СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ДНК ИЗ КЛЕТОК КРОВИ Российский патент 2015 года по МПК C12N15/10 B82B1/00 

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для медицинской лабораторной ДНК-диагностики и лабораторных научных исследований при экстракции (извлечении) ДНК из биопрепаратов и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения очищенной ДНК. Изобретение представляет способ предотвращения образования трудноразрушаемого осадка магнитных частиц, сорбирующих ДНК, за счет добавления в образец ферромагнитных наносфер.

2. Уровень техники

Экстракция нуклеиновых кислот (ДНК и/или РНК) является важным этапом медицинской лабораторной ДНК-диагностики и лабораторных научных исследований. Одними из наиболее эффективных и технологичных являются методы очистки нуклеиновых кислот (НК) при помощи их сорбции на твердой фазе (чаще всего - на различных модификациях оксида кремния) или так называемые «сорбентные» методики.

В последние годы с появлением автоматизированных пиппетирующих станций для экстракции НК и ПЦР-комплексов сорбент стали делать магнитозависимым, а магнитные поля использовать для концентрирования частиц с НК в определенном месте пробирки или для диссоциации частиц (при промывании).

В частности, на рынке представлен широкий спектр коммерческих наборов реагентов для очистки НК при помощи их сорбции на магнитных частицах: Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Blood) (Cat. # MB048, MB096), Geneaid Biotech Ltd. (http://www.geneaid/.com); GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS21110) (http://www.invitrogen.com/); PowerMag® Microbial DNA Isolation Kit, (Cat. # 27200-4), MO BIO Laboratories, Inc. (http://www.mobio.com/) и др.

Использование магнитных частиц ничем принципиальным не отличается от использования других типов сорбентов (латексы, полимерные сорбенты, стекло), но позволяет применять магнитное разделение вместо центрифугирования и фильтрации. В основе магнитных частиц используются получаемые частицы оксида железа, обладающие суперпарамагнитными свойствами.

Однако примеси белков, липидов и полисахаридов в образцах биологического материала зачастую прочно скрепляют собранные вместе магнитным полем частицы в труднодиспергируемый осадок.

Предложен способ предотвращения образования устойчивых агрегатов несущих НК магнитных частиц для повышения эффективности экстракции и очистки НК, в том числе при использовании автоматизированных пиппетирующих станций для экстракции НК- и ПЦР-комплексов.

3. Раскрытие изобретения

Предотвращение образования устойчивых агрегатов несущих ДНК магнитных частиц достигается за счет добавления в образец вместе с сорбирующими ДНК-частицами ферромагнитных наносфер размером 50-200 нм.

Все процедуры по экстракции ДНК проводят в соответствии с инструкцией производителя набора реагентов (например, GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS 21110) однако перед началом экстракции в образец биологического материала добавляют ферромагнитные наносферы размером 50-200 нм (например, CoNiFe2O4 50 nm, Cat. # MKN-Co0.5Ni0.5Fe2O4-050, MKImpex Corp.)до конечной концентрации 10¹⁰ частиц на 1 мл биологического образца.

Положительный результат - повышение эффективности экстракции ДНК - достигается за счет предотвращения образования устойчивых агрегатов несущих ДНК магнитных частиц путем разделения несущих ДНК магнитных частиц прослойками ферромагнитных наносфер. При этом способность магнитных частиц (в частности, изготовленных на основе оксида кремния) к сорбции ДНК не меняется.

4. Реализация изобретения

Рассмотрим реализацию изобретения на примере экстракции ДНК из клеток крови при помощи коммерческого набора реагентов GeneCatcher™ gDNA 3-10 ml Blood Kit (Invitrogen™) (Cat. # CS 21110).

Процедуры по экстракции НК и промывке выполняют как указано в инструкции к набору реагентов.

1. Взятие биологического материала

1.1 Взятие крови проводится в пластиковые пробирки с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл.

1.2. После добавления на шаге 1 (согласно инструкции) в 1,5 мл полипропиленовую пробирку раствора, содержащего 50 мкл крови+150 мкл лизирующего раствора, 5 мкл магнитных частиц, дополнительно добавляют 5 мкл ферромагнитных наносфер CoNiFe2O4 50 nm, (Cat. # MKN-Co0.5Ni0.5Fe2O4-050, MKImpex Corp.).

2. Выделение ДНК из биологического материала

2.1. Промаркировать необходимое количество пластиковых пробирок объемом 1,5 мл (8, 16, 24 или 32 с учетом пробирки для «К-») производства SSI США кат. №1260.

2.2. Внести на дно каждой пробирки 50 мкл или 100 мкл) цельной крови. Устанавливайте образцы в штативы слева направо, сверху вниз.

Внимание! Одновременно с выделением ДНК из биологического материала необходимо подготовить отрицательный контрольный образец «К-». Для этого в промаркированную соответствующим образом пробирку внесите 50 мкл или 100 мкл) физиологического раствора стерильного.

2.3. Установить пробирки с образцами в штативы для выделения. Закрепите крышки в держателях.

Установить штативы на магнитный гомогенизатор.

2.4. Запустить на ПК программу DTStreamRunner.

2.5. Закрыть крышки пробирок после выполнения программы. Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к внесению в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.

Процедуру снятия ДНК с носителя выполняют, как указано в инструкции к набору реагентов.

Результат экстракции ДНК без применения ферромагнитных наносфер и с ферромагнитными наносферами показан на фиг. 1, 2 и 3.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Electrostatic Adsorption of Polystyrene Nanospheres onto the Surface of an Ultrathin Polymer Film Prepared by Using an Alternate Adsorption Technique. Takeshi Serizawa, Hiroko Takeshita, and Mitsuru Akashi. Langmuir, 1998, 14 (15), pp 4088-4094.

2. Макаров B.M., Калаева C.3., Шипилин A.M. и др. Переработка железосодержащих отходов с получением наночастиц для изготовления магнитной жидкости // Нанотехника. - №4 (12), 2004 - С. 66-69.

3. Scherer С.and Figueiredo Neto A. M.Ferrofluids: Properties and Applications // Brazilian Journal of Physics - V. 35, 2005 - P. 718-727.

4. Макеева Г.С. Электродинамический расчет ферромагнитного резонанса в магнитных композитных наноматериалах на основе решеток ферромагнитных наносфер / Г.С. Макеева, О.А. Голованов, М.В. Савченкова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Физико-математические науки. - 2009. - N 2 (10). C. 102-109.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ экстракции ДНК из клеток крови. Добавляют в образец магнитные частицы и ферромагнитные наносферы CoNiFe₂O₄ 50 нм. Лизируют биологический материал. Промывают ДНК и снимают ДНК с носителя. Преимуществом заявленного способа является повышение количества ДНК в полученном образце. 3 ил., 1 пр.

Способ экстракции ДНК из клеток крови с использованием магнитных частиц, сорбирующих ДНК, включающий лизис клеток крови, промывку и снятие ДНК с носителя, отличающийся тем, что перед началом экстракции в образец вместе с магнитными частицами добавляют ферромагнитные наносферы CoNiFe₂O₄ 50 нм.