Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.

В медицине известны синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы А у крупного рогатого скота согласно изобретению имеют нуклеотидные последовательности:

(патент РФ №2527153, кл. C12Q 1/68, 2014 г. ).

Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2726242, кл. C12Q 1/68, 2020 г., включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд, взятых в объемном соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных.

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida).

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных, с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтри-фосфатов, олигонук-леотидных праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью:

при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.

Новизна заявляемой тест-системы состоит в идентификации ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест-система предназначена для выявления ДНК Pasteurella multocida - возбудителя пастереллеза КРС, овец, свиней и птиц - в биологическом материале (кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов.

Тест-систему для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени используют следующим образом.

Предварительно выделяют ДНК из биологического материала животного сорбционным методом. В качестве биологического материала по выбору может быть использованы по выбору: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др., лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов.

Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель -ROX/Orange и для внутреннего контрольного образца бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл - FAM/Green. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) и бактериофага Т4 со следующими нуклеотидными последовательностями (5`-3`):

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Затем измеряют накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) для внутреннего контрольного образца используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida), взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями (5`-3`):

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для генома Pasteurella multocida были отобраны на основе нуклеотидной последовательности гена гидролазы (КМТ1, hydrolase gene, КР212385 457 bp DNA linear BCT 23-FEB-2015 DEFINITION Pasteurella multocida strain Sib-13 Kmt1 gene, partial cds.)

Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Рm-Р (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Pm-F и Pm-R). На 5`-конце олигонуклеотидного зонда помещен флуоресцентный краситель 6-Карбоксиродамин (R6G).

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный зонд Т4-Р, помеченный флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеин (FAM). 3`- конец олигонуклеотидного зонда был помечен флуоресцентным красителем HEX, а 5`-конец зонда содержит гаситель флуоресценции BHQ1:

Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем FAM (Карбоксифлуоресцеин- длина волны возбуждения - 490 нм, флуоресценции - 520 нм). Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд.

Таким образом, используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР в качестве праймеров и зонда. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах других представителей кокцидий из группы простейших, а также в геномах любых видов животных и человека.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ)

Пример включает следующие этапы:

1. Отбор материала для исследования

Для исследования используют следующий материал:

• Мазки и соскобы слизистых оболочек носа. Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;

• Фрагменты паренхиматозных органов (фрагменты печени, легких, селезенки, а также миндалины, лимфоузлы и др.). Отбирают в стерильный контейнер.

• Цельная кровь. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.

• Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду.

• Отбор исследуемых образцов кормов/сырья проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп сырья, пищевых продуктов и кормов.

2. Подготовка исследуемого материала

Мазки и соскобы со слизистых конъюнктивы в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.

Пробы тканей и органов, а также пробы продуктов животного происхождения гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем обычно готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об./мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции НК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения нуклеиновой кислоты (НК).

Молоко в объеме до 10 мл обеззараживают и центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и ОД мл суспензии используют для выделения ДНК.

От кормов/сырья плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированные или консервированные корма/сырье перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния. Отбирают лабораторные пробы (20-40 мг) в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл и направляют на выделение НК.

3. Проведение анализа

Исследование проводили с помощью набора реагентов «ПЦР-ПАСТЕРЕЛЛЕ3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida)». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (Таблица 1, комплект №1) и комплекта контрольных образцов (Таблица 2, комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы) 2). Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ПАСТЕРЕЛЛЕ3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida)»B биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, 21.10.60-221-51062356-2020 Для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru

Исследование с помощью набора реагентов «ПЦР-ПАСТЕРЕЛЛЕ3-ФАКТОР» состоит из трех циклов:

• экстракция ДНК;

• проведение ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

4. Экстракция (выделение) НК из клинического материала

Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Внести во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО Т4.

Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения ДНК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделять ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения ДНК.

Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

5. Подготовка образцов к проведению ПЦР

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО PASTEURELLA, ВКО Т4 и ДНК буфера.

В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:

• 5 мкл ПЦР СМЕСЬ PASTEURELLA

• 10 мкл ПЦР БУФЕР PASTEURELLA

• 0,5 мкл TAQ POLYMERASE

Перемешать смесь на вортексе и сбросить капли кратковременным центрифугированием.

Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Внести по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО PASTEURELLA.

6. Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией

Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q указаны таблице 3.

Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора.

7. Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 к Инструкции.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале ROX/Orange) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом по каналу ROX/Orange отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл.4). Если для исследуемого образца по каналу ROX/Orange значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале ROX/Orange более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct на канале ROX/Orange менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК пастереллеза (Pasteurella multocida), отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4).

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Описана тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тест-система включает буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

прямой праймер,

обратный праймер,

зонд,

взятых в объемном соотношении 1:1. При этом согласно изобретению для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью:

для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange. Изобретение может быть использовано для расширения функциональных возможностей и повышения точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida). 4 табл., 1 пр.

Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер,

- обратный праймер,

- зонд, взятых в объемном соотношении 1:1, отличающаяся тем, что для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью:

при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.