Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения стабильной стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС) для применения в медицине и ветеринарии в качестве газотранспортных заменителей донорской крови и полифункциональных перфторуглеродных препаратов для частичного поддержания транспорта газа, объема циркулирующей крови и некоторых других физиологических параметров, а также в составе лекарственных средств для лечения системных и локальных нарушений кровотока, гипоксических и ишемических состояний, улучшения массообмена газов и метаболитов между кровью и тканями, поддержания функции изолированных органов и тканей, уменьшения явлений воспаления, проведения инфузионно-трансфузионной терапии при шоке и кровопотере.
Уровень техники
Перфторуглеродные эмульсии представляют собой газопереносящие эмульсии на основе перфторорганических соединений, применяемые в медико-биологической области в качестве полифункциональных препаратов. С точки зрения коллоидной химии перфторуглеродные газопереносящие эмульсии - это прямые, концентрированные, высоко- и свободно-дисперсные, гетерогенные, термодинамически неустойчивые лиофобные коллоидные системы, обладающие избыточной свободной поверхностной энергией и огромной площадью газообмена (сорбционно активной поверхностью раздела фаз), в которых дисперсная фаза нерастворимых ультрадисперсных химически инертных перфторуглеродных частиц покрыта адсорбционно-сольватным слоем из поверхностно-активного вещества и сохраняет определенное время при низких температурах агрегативную устойчивость и равномерное распределение частиц дисперсной фазы по объему дисперсионной структурированной среды.
Высокая энергонасыщенность перфторуглеродных частиц и их ультрадисперсность приводит к особым свойствам и ставит их в особую переходную область (10-8 м) рядом с коллоидным (10-9 м) и молекулярным (10-10 м) состоянием вещества. Это особенное состояние перфторуглеродных дисперсных наносистем проявляется в их высокой биологической активности, в реакционной способности, в физическом взаимодействии с любыми веществами и газами.
Основными параметрами эмульсий ПФОС, которые определяют их качество и перспективность использования являются:
1) средний диаметр частиц эмульсии ПФОС;
2) распределение частиц эмульсии по диаметрам;
3) период полувыведения ПФОС из организма;
4) токсичность эмульсии или ЛД50;
5) кислородная емкость эмульсии;
6) величина давления паров ПФОС;
7) стерильность эмульсии;
8) возможность длительного хранения эмульсии;
9) токсичность стабилизирующей добавки;
10) реактогенность эмульсии.
Сравнение этих показателей позволяет оценить полученные эмульсии ПФОС и определить преимущество одной эмульсии ПФОС перед другой.
Средний диаметр частиц эмульсий зависит как от свойств ПФОС, так и от способности стабилизирующей добавки (эмульгатора) снижать поверхностное натяжение на границе ПФОС-вода. Чем меньше величина поверхностного натяжения, тем легче протекает процесс эмульгирования и тем меньше средний диаметр частиц в полученной эмульсии.
Эмульсии ПФОС с той или иной стабилизирующей добавкой должны иметь длительный срок хранения, а условия хранения должны быть простыми. Показателем хранения эмульсии ПФОС является изменение (увеличение) среднего диаметра частиц эмульсии при хранении.
Основными задачами при получении газотранспортных эмульсий ПФОС являются:
1) уменьшение среднего диаметра частиц эмульсий ПФОС и сужение распределения частиц эмульсии по диаметрам;
2) надежная стерилизация эмульсий ПФОС;
3) отсутствие токсичности эмульсий ПФОС;
4) увеличение сроков и упрощение условий хранения эмульсий ПФОС без значительного изменения среднего диаметра частиц и уширения распределения частиц по диаметрам.
Известно, что качество перфторуглеродных эмульсий определяется физико-химическими свойствами выбранных ПФОС, физико-химическими свойствами и природой стабилизирующей добавки и технологией получения эмульсии.
ПФОС нерастворимы в воде и сами являются плохими растворителями для различных водорастворимых биологически активных веществ, поэтому для применения в качестве кислородпереносящих сред их диспергируют в водном растворе стабилизирующей добавки до образования тонкодисперсных эмульсий.
Задача стабилизирующей добавки состоит в формировании адсорбционного слоя вокруг частиц перфторуглеродов, при этом физико-химические свойства и природа стабилизирующей добавки определяют стабильность дисперсной системы и ее реактогенность. Ключевыми параметрами здесь являются прочность связи ПАВ с «ядром» частицы эмульсии, характер и плотность расположения молекул ПАВ на поверхности частицы.
Известны различные способы получения эмульсий ПФОС. Одна из технологий основана на методе измельчения масляной фазы с помощью воздействия ультразвука. Однако, энергия и мощность ультразвукового воздействия столь велики, что наряду с диспергированием приводят к разрыву связи C-F. В результате в водной фазе эмульсии появляются высокотоксичные концентрации ионов F- и от их избыточного содержания эмульсию необходимо очищать посредством пропускания через ионообменную смолу. Кроме того, такая эмульсия имеет чрезвычайно широкую величину дисперсии.
Механическое диспергирование путем встряхивания или перемешивания позволяет получать только грубодисперсные эмульсии ПФОС с неприемлемым для медицинского использования размером - более 1 мм. Для получения тонкодисперсных эмульсий используют метод выдавливания вещества дисперсной фазы через тонкие отверстия в дисперсионную среду под большим давлением (метод экструзии), что приводит к разрыву движущейся струи жидкости на капли. Диспергирование вызывается градиентом давления и силами гидравлического трения. Обычно производство эмульсий ПФОС осуществляют на гомогенизаторах высокого давления, что позволяет получить достаточно тонкую калиброванную эмульсию.
Гомогенизация достигается пропусканием смеси эмульгатора и перфторуглерода через малые отверстия с сечением 10-6-10-8 м2 под давлением от 10,1 до 101,3 МПа. Для получения эмульсий ранее использовался одноконтурный способ, где перфторуглерод из отдельной емкости капельно подавался в емкость с эмульгатором (полоксамером), затем вся смесь подавалась в дезинтегратор и из него обратно в емкость с ПФОС и эмульгатором. Этот цикл повторялся многократно (от 5 до 15 циклов). Однако, эмульсия, полученная данным способом, не полностью удовлетворяет требованиям к размеру частиц, так как в составе остаются частицы с размером 400-450 нм, что увеличивает токсичность полученной эмульсии.
Известен способ получения эмульсий ПФОС для медицинских целей, в котором для уменьшения реактогенности предлагается уменьшить средний размер и повысить монодисперсность частиц эмульсии. Это достигается за счет капельного введения смеси двух видов жидких ПФОС в водный раствор стабилизирующего агента, что предотвращает появление макроскопической границы раздела фаз, увеличивает время и поверхности контакта ПФОС и стабилизирующего агента на стадии получения предэмульсии. Субмикронная эмульсия получается в двухконтурной системе гомогенизации в процессе 12-кратной рециркуляции в контурах гомогенизатора при попеременном давлении. Однако, первый и второй контуры гомогенизатора используются попеременно, что замедляет процесс гомогенизации, так как возврат из второго контура в первый приводит к попаданию в уже измельченную тонкодисперсную эмульсию крупных частиц предэмульсии и даже капель ПФОС, неизбежно образующихся и задерживающихся на стенках камеры и трубок в первом контуре.
В патенте РФ 2122404 описан способ получения эмульсии путем струйного пропускания многокомпонентной смеси ПФОС и раствора проксанола через гомогенизатор под давлением 700-1000 атм и охлаждении при температуре от 24 до 34°С с дальнейшей циклической гомогенизацией под постоянным давлением 400-490 атм и при постоянном охлаждении. В предлагаемом способе получения эмульсии за счет струйного пропускания смеси ПФОС вдвое сокращается время первого цикла гомогенизации, а регуляция и отслеживание режима давления в гомогенизаторе предотвращают процесс вторичного укрупнения частиц и обеспечивают мягкую «доводку» эмульсии до заданного размера частиц 0,03-0,05 мкм.
В патенте РФ 2206319 описан способ получения эмульсии в соответствии с которым перед смешиванием компонентов смесь жидких ПФОС и водный раствор стабилизирующего агента насыщают углекислым газом, после чего нагревают водный раствор стабилизирующего агента при температуре не выше 75°С. Затем смесь жидких ПФОС вводят несколькими струями в охлажденный водный раствор стабилизирующего агента при интенсивном перемешивании и поддуве углекислого газа, одновременно пропуская получаемую крупнодисперсную предэмульсию несколько раз через первый контур гомогенизатора, после чего измельченную предэмульсию подвергают гомогенизации во втором контуре гомогенизатора до получения требуемой дисперсности при поддуве углекислого газа, и добавляют водно-солевой состав.
Насыщение смешиваемых компонентов углекислым газом и нагрев водного раствора стабилизирующего агента (проксанола) позволяет депирогенизировать раствор без пропускания через сорбенты, ухудшающие качество стабилизирующего агента и изменяющие его молекулярно-массовое распределение, а также поверхностно-активные свойства. Отклонения от указанных значений температуры ухудшают поверхностно-активные свойства стабилизирующего агента. Струйное введение жидких ПФОС в водный раствор стабилизирующего агента при интенсивном перемешивании и одновременном пропускании получаемой смеси через гомогенизатор высокого давления способствует ускорению процесса получения предэмульсии. Регулирование скорости подачи ПФОС, перемешивания и протока смеси через гомогенизатор осуществляется так, чтобы предотвратить образование макроскопической границы раздела фаз ПФОС/вода, что является необходимым условием для получения монодисперсной эмульсии.
В патенте РФ 
2070033 описан способ получения перфторуглеродных эмульсий для медицинских целей, в котором смесь ПФОС получают смешиванием жидких компонентов, а предэмульсию получают, пропуская смесь ПФОС через водный раствор стабилизирующего агента (проксанола), одновременно пропуская получаемую предэмульсию через рабочую камеру гомогенизатора, после полного смешивания пропускают через рабочую камеру гомогенизатора с термостатированием под давлением 300-660 атм, с последующим добавлением в полученную предэмульсию стерильного физиологически приемлемого водно-солевого раствора. Полученную наноэмульсию ПФОС замораживают.
Недостатками вышеописанного способа получения наноэмульсий ПФОС являются трудоемкость получения смеси ПФОС, связанная с тем, что отвешивают жидкие компоненты разной плотности для получения требуемого объема смеси ПФОС; термостатирование осуществляют только рабочей камеры гомогенизатора, что не обеспечивает необходимый температурный режим для получения предэмульсии со средним размером частиц 30-80 нм; давление в рабочей камере гомогенизатора выше 60 МПа является избыточным и приводит к загеливанию водного раствора полоксамера; замораживание наноэмульсии ПФОС сразу после изготовления приводит к резкому укрупнению частиц наноэмульсии ПФОС, что уменьшает ее стабильность, сокращая срок ее хранения.
В патенте РФ 
2393849 описан способ получения эмульсии ПФОС, в котором, перед смешиванием, смесь ПФОС и водный раствор полоксамера насыщают углекислым газом, процесс приготовления предэмульсии и последующей гомогенизации осуществляют в атмосфере углекислого газа, в предэмульсию добавляют физиологически приемлемый водно-солевой раствор.
Недостатками этого способа получения наноэмульсии ПФОС являются насыщение смеси ПФОС и водного раствора полоксамера углекислым газом и осуществление процесса гомогенизации в атмосфере углекислого газа, что технологически сложно реализуемо и удорожает процесс изготовления наноэмульсии ПФОС. Объем производства наноэмульсии ограничен производительностью гомогенизатора. Водно-солевой раствор добавляется в предэмульсию с более высокой плотностью, что ухудшает смешение и увеличивает время этого процесса. Отсутствует стабилизация наноэмульсии ПФОС перед замораживанием.
Целью настоящего изобретения было создание простого, технологичного и экономичного способа получения наноэмульсий ПФОС, позволяющего получить продукт с улучшенной стабильностью и упростить условия хранения наноэмульсий ПФОС без значительного изменения среднего диаметра частиц и уширения распределения частиц по диаметрам.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что предварительное заполнение циркуляционного контура установки для получения наноэмульсии ПФОС, который включает емкость для получения предэмульсии ПФОС, гомогенизатор и трубопроводы, связывающие емкость и гомогенизатор, раствором стабилизирующей добавки до добавления смеси ПФОС позволяет уменьшить средний диаметр частиц эмульсии и уменьшить распределение частиц по диаметрам, что, в свою очередь, значительно увеличивает стабильность эмульсии ПФОС и как результат увеличивает срок хранения продукта.
Кроме того, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что выдерживание эмульсии ПФОС при температуре от 2 до 10°С в течение более 18 часов перед замораживанием готового продукта также позволяет значительно увеличить стабильность эмульсии ПФОС.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС), который включает:
- добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки;
- гомогенизацию смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС;
- смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС;
- выдерживание наноэмульсии ПФОС при температуре от 2 до 10°С в течение не менее 18 часов;
- необязательное замораживание наноэмульсии ПФОС.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению осуществляют предварительное заполнение циркуляционного контура установки для получения наноэмульсии ПФОС водным раствором стабилизирующей добавки.
Настоящее изобретение также относится к способу получения стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС), который включает:
- предварительное заполнение циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки;
- добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки;
- гомогенизацию смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС;
- смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС;
- необязательное замораживание наноэмульсии ПФОС.
Циркуляционный контур в способе настоящего изобретения включает емкость для получения предэмульсии ПФОС, гомогенизатор и трубопроводы, связывающие емкость и гомогенизатор.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению перед началом процесса осуществляют проверку герметичности циркуляционного контура путем его промывки, стерильным концентрированным водным раствором стабилизирующей добавки в объеме, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора при давлении в рабочей камере гомогенизатора 10-45,5 МПа, с последующим сливом раствора.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению гомогенизацию предэмульсии ПФОС осуществляют при давлении в рабочей камере гомогенизатора в диапазоне от 10 до 60,8 МПа, предпочтительно в диапазоне от 43,1 до 45,1 МПа, осуществляют термостатирование рабочей камеры гомогенизатора для обеспечения технологической температуры в диапазоне от 19 до 30°С, предпочтительно от 20 до 26°С и осуществляют термостатирование трубопроводов циркуляционного контура для обеспечения технологической температуры трубопроводов в диапазоне от 5 до 20°С, предпочтительно от 7 до 15°С.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению циркуляционный контур содержит один или более дополнительных гомогенизаторов, подключенных параллельно к основному гомогенизатору циркуляционного контура.
В предпочтительном варианте изобретения гомогенизатор имеет более одной рабочей камеры, подключенных параллельно.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению наноэмульсию ПФОС перед выдерживанием разливают в потребительскую тару.
В наиболее предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению потребительскую тару с наноэмульсией ПФОС перед замораживанием осторожно встряхивают до получения однородности содержимого.
Потребительская тара, которую используют в способе по настоящему изобретению, представляет собой стеклянные бутылки, флаконы, ампулы, шприц-тюбики, полимерные емкости, металлические баллоны, тубы.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению способ проводят в асептических условиях.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению водный раствор стабилизирующей добавки представляет собой 10-30 масс. % водный раствор, предпочтительно 10-20 масс.% водный раствор и в качестве стабилизирующей добавки используют полоксамеры, такие как сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, предпочтительно полоксамеры с торговыми наименованиями Эмуксол 268 марки «А» и Killiphor P188 (Коллифор P188), С10-С22 жирные кислоты и/или их соли или триглицериды или фосфолипиды яичного желтка или сои.
В способе по настоящему изобретению в качестве смеси ПФОС используют смесь по меньшей мере одного быстро выводимого ПФОС, выбранного из С8-С10 ПФОС, например, перфтордекалина (ПФД) или перфтороктилбромида (ПФОБ) и, по меньше мере, одного медленно выводимого ПФОС, выбранного из С11-С12 ПФОС, например перфтортрипропиламина (ПФТПА), перфторметилциклогексилпиперидина (ПФМЦП) или перфтортрибутиламина (ПФТБА).
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению смесь ПФОС для приготовления предэмульсии готовят смешиванием одного или более жидких ПФОС.
В способе по настоящему изобретению водно-солевой раствор включает NaCl и воду, и, необязательно, KCl, MgCl2, NaHCO3, NaH2PO4, Na2HPO4, глюкозу.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению наноэмульсия ПФОС содержит 4,8-7,2 г/л натрия хлорида; 0,31-0,47 г/л калия хлорида; 0,15-0,23 г/л магния хлорида (в пересчете на сухое вещество); 0,55-0,83 г/л натрия гидрокарбоната; 0,16-0,24 г натрия фосфата однозамещенного (в пересчете на сухое вещество); 1,6-2,4 г/л глюкозы.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению рН наноэмульсии ПФОС составляет от 5 до 8, предпочтительно в диапазоне от 7,2 до 7,8, и для корректировки pH изменяют количественное содержание натрия гидрокарбоната и натрия фосфата однозамещенного.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению наноэмульсию ПФОС замораживают при температуре от -4 до -18°С, предпочтительно при температуре от -10 до -18°С.
В предпочтительном варианте способа по настоящему изобретению наноэмульсию ПФОС выдерживают при температуре от 2 до 10°С, предпочтительно при температуре от 3 до 6°С, наиболее предпочтительно при температуре 4°С.
В предпочтительном варианте изобретения эмульсию выдерживают перед замораживанием в течение не менее 18 часов, предпочтительно в течение 18-30 часов, наиболее предпочтительно 24 часа.
Подробное описание изобретения
На Фиг.1 представлена предпочтительная схема установки для получения нанэмульсии ПФОС для осуществления способа настоящего изобретения.
На представленной схеме емкость 1 представляет собой емкость для смеси ПФОС или раствора стабилизирующей добавки, трубопровод 2 соединяет емкость 1 с емкостью 3 циркуляционного контура для получения смеси ПФОС в растворе стабилизирующей добавки, трубопроводы 4 и 6 циркуляционного контура соединяют емкость 3 с гомогенизатором 5 высокого давления циркуляционного контура, трубопровод 7 соединяет циркуляционный контур с емкостью 8 для водно-солевого раствора для получения готовой наноэмульсии ПФОС, трубопровод 9 предназначен для удаления готового продукта и/или фасовки готовой наноимульсии ПФОС в потребительскую тару.
Способ осуществляют следующим образом.
Для получения предэмульсии ПФОС смесь ПФОС подается капельно и/или струйно из емкости 1 по трубопроводу 2 в емкость 3 с раствором стабилизирующей добавки. В предпочтительном варианте изобретения до начала процесса водный раствор стабилизирующей добавки подается из емкости 1 в основной циркуляционный контур, включающий емкость 3, трубопроводы 4 и 6 и гомогенизатор 5 до полного заполнения контура.
Смесь ПФОС в водном растворе стабилизирующей добавки прокачивается в основном циркуляционном контуре по трубопроводам 4 и 6 через гомогенизатор 5 при рабочем давлении в камере гомогенизатора 10-60,8 МПа, при охлаждении рабочей камеры гомогенизатора до 19-30°С и термостатировании трубопроводов 4 и 6 циркуляционного контура при температуре 5-20°С. Осуществляют 9-15 циклов гомогенизации для получения предэмульсии ПФОС. Затем предэмульсию ПФОС прокачивают по трубопроводу 7 в емкость 8 с водно-солевым раствором, где предэмульсия, постепенно проходя через водно-солевой раствор, удельный вес которого меньше удельного веса предэмульсии, равномерно смешивается с водно-солевым раствором с получением готовой наноэмульсии ПФОС. Далее готовый продукт по трубопроводу 9 перекачивают в дополнительную емкость или в потребительскую тару, где необязательно выдерживают при температуре 2-10°С в течение не менее 18 часов для стабилизации продукта, после чего продукт необязательно замораживают при температуре от -4 до -18°С.
В предпочтительном варианте изобретения до начала процесса проводят проверку герметичности циркуляционного контура путем его заполнения водным раствором стабилизирующей добавки в количестве в 2-4 раза превышающим рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора при включенном гомогенизаторе при давлении 10-45,5 МПа с последующим сливом раствора.
Наноэмульсия ПФОС настоящего изобретения включает по меньшей мере одно быстро выводящееся ПФОС и по меньшей мере одно медленно выводящееся ПФОС в количестве до 50 об.%, предпочтительно от 5 до 30 об.%, еще более предпочтительно от 10 до 20 об.%, стабилизирующую добавку в количестве до 10 масс.%, предпочтительно от 0,5 до 10 масс.%, более предпочтительно от 3,5 до 4,5 масс.%, соли, такие как NaCl, KCl, MgCl2, NaHCO3, NaH2PO4, Na2HPO4 и воду.
Соотношение быстро выводящегося и медленно выводящегося перфторированных соединений может составлять от 10:1 до 1:10.
Водно-солевая часть готовой эмульсии ПФОС может содержать 82-123 мМ NaCl, и, необязательно, 4,2-6,3 мМ KCl, 1,6-2,4 мМ MgCl2, 6,6-9,9 мМ NaHCO3, 1,3-2 мМ NaH2PO4. Предпочтительно соотношение ионов Na и К поддерживается на уровне 10:1-30:1.
В состав готовой эмульсии ПФОС также может входить глюкоза в количестве 8,9-13,3 мМ (или 1,6-2,4 г/л).
Величина рН готовой эмульсии ПФОС составляет от 5 до 8,0, предпочтительно от 7,2 до 7,8.
Эмульсия ПФОС имеет средний размер частиц не более 150 нм, предпочтительно 30-100 нм, наиболее предпочтительно 30-80 нм.
Для получения эмульсий ПФОС по настоящему изобретению используют, как правило, одновременно два типа перфторорганических соединений. Одно из них выбирают из группы С8-С10, включающей, например перфтордекалин (ПФД) или перфтороктилбромид (ПФОБ), второе - из группы С11-С12, содержащей, например перфтортрипропиламин (ПФТПА), перфторметилциклогексил-пиперидин (ПФМЦП) или перфтортрибутиламин (ПФТБА). Соединения первого типа быстро (в течение месяца) выводятся из организма, но не обеспечивают достаточной стабильности эмульсий, соединения же второго типа, напротив, придают эмульсии высокую стабильность, позволяющую хранить их без замораживания, но в течение длительного времени (от 8 месяцев до 2-х лет) не выводятся из организма.
Могут быть также использованы многокомпонентные смеси из двух ПФОС, например, ПФД/ПФТБА, ПФД/ПФМЦП, ПФОБ/ПФТБА, ПФОБ/ПФМЦП или из трех ПФОС, например ПФОБ/ПФД/ПФМЦП, ПФОБ/ПФД/ПФТБА или из четырех ПФОС, например, ПФОБ/ПФД/ПФМЦП/ПФТБА.
Специальные стабилизирующие добавки вводят для снижения среднего диаметра частиц эмульсии, увеличения дисперсности и стабильности при длительном хранении.
В качестве стабилизирующей добавки предпочтительно используют нетоксичные неионогенные высокомолекулярные поверхностно-активные вещества (НПАВ), в частности полоксамеры (проксанолы, плюроники, коллифоры, эмуксолы). Их количество в эмульсиях ПФОС, по возможности, минимально и определяется только необходимостью удовлетворительного эмульгирования и гомогенизации ПФОС. Минимизация количества ПАВ связана и с тем, что они влияют на токсичность и реактогенность эмульсии ПФОС.
Полоксамеры представляют собой сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида общей формулы HO(C2H4O)m(C3H6O)n(C2H4O)m ,H, где (m+m') варьируется от нескольких единиц до нескольких десятков; молекулярная масса составляет от 1000 до 20000, доля полиоксиэтиленовых блоков может составлять от 10 до 80% по массе.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения используют полоксамер с торговым названием Проксанол 268, «Эмуксол 268» марки «А», Kolliphor P188 (Коллифор P188), Pluronic F68 (Плюроник F68), Synperonic F68 (Синпероник F68), Lutrol F68 (Лутрол F68).
В качестве стабилизирующей добавки также могут быть использованы С10-С22 жирные кислоты и/или их соли или триглицериды и фосфолипиды яичного желтка или сои.
В предпочтительном способе настоящего изобретения используют 10-30 масс.% водный раствор стабилизирующей добавки, наиболее предпочтительно 10-20 масс.% водный раствор.
Водно-солевой раствор, используемый в способе по настоящему изобретению представляет собой водный раствор солей, выбранных из NaCl, и, необязательно, KCl, MgCl2, NaHCO3, NaH2PO4, Na2HPO4. Водно-солевой раствор может содержать глюкозу.
Количество компонентов водно-солевого раствора, используемого для смешивания с предэмульсией ПФОС рассчитывается таким образом, чтобы обеспечить в готовой эмульсии ПФОС следующее содержание солей: 82,1-123,2 мМ NaCl, 4,2-6,3 мМ KCl, 1,6-2,4 мМ MgCl2 6,6-9,9 мМ NaHCO3, 1,3-2 мМ NaH2PO4 и 8,9-13,3 мМ D-глюкозы или 4,8-7,2 г/л натрия хлорида; 0,31-0,47 г/л калия хлорида; 0,15-0,23 г/л магния хлорида (в пересчете на сухое вещество); 0,55-0,83 г/л натрия гидрокарбоната; 0,16-0,24 г/л натрия фосфата однозамещенного (в пересчете на сухое вещество); 1,6-2,4 г/л глюкозы.
Ниже заявленное изобретение проиллюстрировано примерами, которые никоим образом не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение наноэмульсии, содержащей 10 об.% ПФОС.
Перед процессом гомогенизации проверяют герметичность циркуляционного контура путем его заполнения 13,3% водным раствором полоксамера Эмуксол 268 марки «А» в количестве, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора, при включенном гомогенизаторе при давлении 10-45,5 МПа с последующим его сливом. Емкость 3 заполняют 2,52 л 13,3% водного раствора полоксамера Эмуксол 268 марки «А». Смесь ПФОС, включающую 0,56 л ПФД и 0,28 л ПФМЦП, постепенно (капельно) добавляют в 2,52 л 13,3% водного раствора полоксамера Эмуксол 268 марки «А». Давление в гомогенизаторе поддерживают в пределах от 43,1 до 45,1 МПа и при охлаждении рабочей камеры до 20-26°С. Трубопроводы циркуляционного контура термостатируют для создания температуры в диапазоне 7-15°С. Осуществляют 13 циклов гомогенизации. Получают 3,36 л предэмульсии ПФОС, содержащей 25 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм 3,36 л полученной предэмульсии добавляют в 5,04 л водно-солевого раствора, содержащего в 1,7 раза больше растворенных солей (95,5 мМ NaCl, 5,0 мМ KCl, 2,2 мМ MgCl2, 8,1 мМ NaHCO3, 1,5 мМ NaH2PO4, и 10,7 мМ глюкозы) по отношению к концентрации солей в наноэмульсии, в соотношении 1:1,5 соответственно. Получают 8,4 л наноэмульсии ПФОС, содержащей 10 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм. Наноэмульсию ПФОС разливают в стерильную потребительскую тару и стабилизируют при температуре 4°С в течение 24 часов, после чего ее замораживают при температуре -15°C.
В соответствии с методикой, описанной в Примере 1, получают экспериментальную серию наноэмульсии ПФОС 4э со средним размером частиц 64 нм.
Пример 2. Получение наноэмульсии, содержащей 10 об.% ПФОС.
Перед заполнением циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки проверяют герметичность циркуляционного контура путем его заполнения 10% водным раствором полоксамера Эмуксол 268 марки «А» в количестве, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора, при включенном гомогенизаторе при давлении 10-45,5 МПа с последующим его сливом. Циркуляционный контур заполняют 3,36 л 10% водного раствора полоксамера Эмуксол 268 марки «А», после чего в него постепенно (струйно) добавляют смесь ПФОС, состоящую из 0,56 л ПФД и 0,28 л ПФМЦП. Давление в гомогенизаторе поддерживают в пределах от 43,1 до 45,1 МПа и при охлаждении рабочей камеры до 20-26°С. Трубопроводы циркуляционного контура термостатируют для создания температуры в диапазоне 7-15°С. Осуществляют 10 циклов гомогенизации. Получают 3,36 л предэмульсии ПФОС, содержащей 25 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм 3,36 л полученной предэмульсии добавляют в 5,04 л водно-солевого раствора, содержащего в 1,7 раза больше растворенных солей (93,7 мМ NaCl, 5,1 мМ KCl, 1,9 мМ MgCl2, 7,5 мМ NaHCO3, 1,7 мМ NaH2PO4, и 11,2 мМ глюкозы) по отношению к концентрации солей в наноэмульсии, в соотношении 1:1,5 соответственно. Получают 8,4 л наноэмульсии ПФОС, содержащей 10 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм. Наноэмульсию ПФОС разливают в стерильную потребительскую тару и стабилизируют при температуре 4°С в течение 24 часов, после чего ее замораживают при температуре -150C.
В соответствии с методикой, описанной в Примере 2, получают экспериментальную серию наноэмульсии ПФОС 3э со средним размером частиц 53 нм.
Пример 3. Получение наноэмульсии, содержащей 10 об.% ПФОС.
Перед заполнением циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки проверяют герметичность циркуляционного контура путем его заполнения 10% водным раствором полоксамера Lutrol F68 (Лутрол F68) в количестве, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора, при включенном гомогенизаторе при давлении 10-45,5 МПа с последующим его сливом. Циркуляционный контур заполняют 3,36 л 10% водного раствора полоксамера Эмуксола 268 марки «А», после чего в него постепенно (капельно) добавляют смесь ПФОС, состоящую из 0,56 л ПФД и 0,28 л ПФМЦП. Давление в гомогенизаторе поддерживают в пределах от 10 до 81 МПа и при охлаждении рабочей камеры до 19-28°С. Трубопроводы циркуляционного контура термостатируют для создания температуры в диапазоне 10-20°С. Осуществляют 10 циклов гомогенизации. Получают 4,2 л предэмульсии ПФОС, содержащей 20 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм 4,2 л полученной предэмульсии добавляют в 4,2 л водно-солевого раствора, содержащего в 2 раза больше растворенных солей (100,7 мМ NaCl, 5,7 мМ KCl, 2,1 мМ MgCl2, 7,9 мМ NaHCO3, 1,6 мМ NaH2PO4, и 11,0 мМ глюкозы) по отношению к концентрации солей в наноэмульсии, т.е. в соотношении 1:1 соответственно. Получают 8,4 л наноэмульсии ПФОС, содержащей 10 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм. Наноэмульсию ПФОС разливают в потребительскую тару и стабилизируют при температуре 4°С в течение 24 часов, после чего ее замораживают при температуре -16°C.
В соответствии с методикой, описанной в Примере 3, получают экспериментальную серию наноэмульсии ПФОС: серия 3с со средним размером частиц 53 нм.
Методики способа получения наноэмульсии ПФОС Примеров 1, 2 и 3 представляют собой стандартную технологию производства, дополненную стадией выдерживания наноэмульсии перед замораживанием в Примере 1 или дополненную стадией предварительного заполнения циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки в Примере 2 или дополненную как стадией выдерживания наноэмульсии перед замораживанием, так и стадией предварительного заполнения циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки в Примере 3.
Пример 4 (контрольный). Получение наноэмульсии, содержащей 10 об.% ПФОС.
Перед процессом гомогенизации проверяют герметичность циркуляционного контура путем его заполнения 13,3% водным раствором полоксамера Эмуксол 268 марки «А» в количестве, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора, при включенном гомогенизаторе при давлении 10-45,5 МПа с последующим его сливом. Смесь ПФОС, включающую 0,56 л ПФД и 0,28 л ПФМЦП, постепенно (струйно) добавляют в 2,52 л 13,3% водного раствора полоксамера Эмуксол 268 марки «А». Давление в гомогенизаторе поддерживают в пределах от 10 до 81 МПа и при охлаждении рабочей камеры до 19-28°С. Трубопроводы циркуляционного контура термостатируют для создания температуры в диапазоне 10-20°С. Осуществляют 13 циклов гомогенизации. Получают 4,2 л предэмульсии ПФОС, содержащей 20 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм 4,2 л полученной предэмульсии добавляют в 4,2 л водно-солевого раствора, содержащий в 2 раза больше растворенных солей (102,3 мМ NaCl, 5,6 мМ KCl, 2,0 мМ MgCl2, 8,3 мМ NaHCO3, 1,8 мМ NaH2PO4, и 11,2 мМ глюкозы) по отношению к концентрации солей в наноэмульсии, т.е. в соотношении 1:1 соответственно, Получают 8,4 л наноэмульсии ПФОС, содержащей 10 об.% ПФОС со средним размером частиц 50-80 нм. Наноэмульсию ПФОС замораживают при температуре -17°C.
По методике, описанной в Примере 4, получают контрольную серию наноэмульсии ПФОС 1к со средним размером частиц 58 нм.
Методика способа получения наноэмульсии ПФОС Примера 4 представляет собой стандартную технологию производства (контроль).
Пример 5. Оценка влияния выдерживания наноэмульсии ПФОС или предварительного заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки на стабильность продукта.
Стабильность наноэмульсии ПФОС определяют по изменению размера части в процессе хранения. Нормальным средним размером частиц считается размер в диапазоне от 30 до 150 нм.
Наноэмульсию, полученную в Примерах 1 (серия 4э), 2 (серия 3э) и 4 (серия 1к), размораживают и определяют средний размер частиц при хранении при температуре 4°С и температуре -18°С.
Средний размер частиц эмульсий и распределение частиц по диаметрам измеряют на электронном микроскопе.
Полученные данные представлены в Таблицах 1 и 2.
Стабильность наноэмульсии ПФОС при хранении при температуре 4°С
Стабильность наноэмульсии ПФОС при хранении при температуре -18°С
Представленные данные измерений среднего размера частиц эмульсии ПФОС показывают, что выдерживание наноэмульсии ПФОС перед замораживанием при температуре 4°С в течение 24 часов или предварительное заполнение циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки перед смешиванием компонентов существенно увеличивает срок хранения продукта по сравнению с контролем:
- срок хранения наноэмульсии ПФОС по Примеру 1 при температуре 4°С составляет 6 недель, что на 3 недели больше срока хранения контрольной серии по Примеру 4 (Таблица 1);
- срок хранения наноэмульсии ПФОС по Примеру 2 при температуре 4°С составляет 4 недели, что на 1 неделю больше срока хранения контрольной серии по Примеру 4 (Таблица 1);
- срок хранения наноэмульсии ПФОС по Примеру 1 при температуре -18°С составляет 48 месяцев, что на 24 месяца больше срока хранения контрольной серии по Примеру 4 (Таблица 2);
- срок хранения наноэмульсии ПФОС по Примеру 2 при температуре -18°С составляет 30 месяцев, что на 6 месяцев больше срока хранения контрольной серии по Примеру 4 (Таблица 2).
Пример 6. Оценка влияния предварительного заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки и выдерживания наноэмульсии ПФОС на стабильность продукта.
Стабильность наноэмульсии ПФОС определяют по изменению размера части в процессе хранения. Нормальным средним размером частиц считается размер в диапазоне от 30 до 150 нм.
Наноэмульсию, полученную в Примерах 3 (серия 3с) и 4 (серия 1к), размораживают и определяют средний размер частиц при хранении при температуре 4°С и при температуре -18°С.
Средний размер частиц эмульсий и распределение частиц по диаметрам измеряют на электронном микроскопе.
Полученные данные представлены в Таблицах 3 и 4.
Стабильность наноэмульсии ПФОС при хранении при температуре 4°С
Стабильность наноэмульсии ПФОС при хранении при температуре -18°С
Анализ данных измерений среднего размера частиц наноэмульсии ПФОС показывает, что заполнение циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки и выдерживание наноэмульсии ПФОС перед замораживанием при температуре 4°С в течение 24 часов существенно увеличивает срок хранения продукта по сравнению с контролем:
- срок хранения при температуре 4°С наноэмульсии по Примеру 3 составляет 8 недель, что на 5 недель больше контроля (Таблица 3);
- срок хранения наноэмульсии по Примеру 3 при температуре -18°С составляет 60 месяцев, что на 36 месяцев больше контроля (Таблица 4).
Причем стабильность наноэмульсии ПФОС при использовании как заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки так и выдерживания наноэмульсии ПФОС перед замораживанием при температуре 4°С в течение 24 часов существенно увеличивает срок хранения продукта не только по сравнению с контрольным продуктом, но и по сравнению с продуктом, полученным с использованием только заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки или стадии выдерживания наноэмульсии.
Представленные выше экспериментальные данные с очевидностью доказывают, что использование в способе получения наноэмульсий ПФОС дополнительной стадии предварительного заполнения циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки и/или выдерживания наноэмульсии ПФОС при температуре 2-10°С в течение более 18 часов позволяют существенно увеличить стабильность эмульсии и срок ее хранения.
Пример 7. Оценка влияния предварительного заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки на распределение частиц по диаметрам.
Средний размер частиц эмульсий и распределение частиц по диаметрам получают прямым измерением частиц наноэмульсии, используя электронную микроскопию. Для подготовки образца применили метод негативного контраста монослоя частиц наноэмульсии, нанесенного на коллодиевую пленку, уранил нитратом. Изображение получали при ускоряющем напряжении 80 кВ в электронном микроскопе JEM 100B (JEOL, Япония).
Полученные данные представлены в Таблице 5.
Представленные данные с очевидностью свидетельствуют, что использование стадии предварительного заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки для получения наноэмульсии со средним размером частиц в диапазоне 30-80 нм требуется на три цикла гомогенизации меньше, что существенно снижает время производственного процесса. Также, наноэмульсия ПФОС серии 4э, полученная без стадии предварительного заполнения циркуляционного контура раствором стабилизирующей добавки, имеет требуемый средний размер частиц 64 нм, но в отличие от наноэмульсии ПФОС серия 3э содержит частицы крупнее 200 нм, что увеличивает количество реактогенных реакций при ее использовании.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС), включающий: добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки; гомогенизацию смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС; смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС; выдерживание наноэмульсии ПФОС при температуре от 2 до 10°С в течение не менее 18 часов. Способ также может быть осуществлен следующим образом: предварительное заполнение циркуляционного контура установки для получения наноэмульсии ПФОС водным раствором стабилизирующей добавки; добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки; гомогенизация смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС; смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС. Изобретение обеспечивает увеличение стабильности эмульсии ПФОС и срока ее хранения. 2 н. и 28 з.п. ф-лы, 7 пр., 5 табл., 1 ил.
1. Способ получения стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС), включающий:
- добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки;
- гомогенизацию смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС;
- смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС;
- выдерживание наноэмульсии ПФОС при температуре от 2 до 10°С в течение не менее 18 часов.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий предварительное заполнение циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором циркуляционный контур включает емкость для получения смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки, гомогенизатор и трубопроводы, связывающие емкость и гомогенизатор.
4. Способ по п. 1 или 2, который проводят в асептических условиях.
5. Способ по п. 1 или 2, в котором, перед началом процесса, осуществляют проверку герметичности циркуляционного контура путем его промывки стерильным водным раствором стабилизирующей добавки в объеме, в 2-4 раза превышающем рабочий объем трубопроводов и рабочей камеры гомогенизатора при давлении в рабочей камере гомогенизатора 10-45,5 МПа, с последующим сливом водного раствора.
6. Способ по п. 1 или 2, в котором гомогенизацию предэмульсии ПФОС осуществляют при давлении в рабочей камере гомогенизатора в диапазоне от 10 до 60,8 МПа, предпочтительно в диапазоне от 43,1 до 45,1 МПа.
7. Способ по п. 1 или 2, в котором осуществляют термостатирование рабочей камеры гомогенизатора для обеспечения технологической температуры в диапазоне от 19 до 30°С, предпочтительно от 20 до 26°С.
8. Способ по п. 1 или 2, в котором осуществляют термостатирование трубопроводов циркуляционного контура для обеспечения технологической температуры трубопроводов в диапазоне от 5 до 20°С, предпочтительно от 7 до 15°С.
9. Способ по п. 1 или 2, в котором циркуляционный контур содержит один или более дополнительных гомогенизаторов, подключенных параллельно к основному гомогенизатору циркуляционного контура.
10. Способ по п. 1 или 2, в котором гомогенизатор содержит более одной рабочей камеры, где камеры подключены параллельно.
11. Способ по п. 1 или 2, в котором наноэмульсию ПФОС перед выдерживанием разливают в потребительскую тару.
12. Способ по 11, в котором потребительскую тару с наноэмульсией ПФОС осторожно встряхивают до получения однородности содержимого.
13. Способ по п. 11, в котором потребительская тара представляет собой стеклянные бутылки, флаконы, ампулы, шприц-тюбики, полимерные емкости, металлические баллоны, тубы.
14. Способ по п. 13, в котором размер потребительской тары для наноэмульсии ПФОС, предназначенной для замораживания, не превышает 500 мл.
15. Способ по п. 1 или 2, в котором наноэмульсию ПФОС выдерживают при температуре от 2 до 10°С в течение не менее 18 часов, предпочтительно при температуре 3-6°С в течение 18-30 часов, предпочтительно при температуре 4°С в течение 24 часов.
16. Способ по п. 1 или 2, в котором полученную наноэмульсию ПФОС замораживают.
17. Способ по п. 16, в котором наноэмульсию ПФОС замораживают при температуре от -4 до -18°С.
18. Способ по п. 1 или 2, в котором водный раствор стабилизирующей добавки представляет собой 10-30 масс. % водный раствор, предпочтительно 10-20 масс. % водный раствор.
19. Способ по п. 1 или 2, в котором в качестве стабилизирующей добавки используют полоксамеры, такие как сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, С10-С22 жирные кислоты и/или их соли или триглицериды или фосфолипиды яичного желтка или сои.
20. Способ по п. 19, в котором в качестве стабилизирующей добавки используют полоксамеры с торговыми наименованиями Проксанол 268, Эмуксол 268 марки "А", Kolliphor P188 (Коллифор P188), Pluronic F68 (Плюроник F68), Synperonic F68 (Синпероник F68), Lutrol F68 (Лутрол F68).
21. Способ по п. 1 или 2, в котором в качестве смеси ПФОС используют смесь по меньшей мере одного быстро выводимого ПФОС,
выбранного из С8-С10 ПФОС, и по меньшей мере одного медленно выводимого ПФОС, выбранного из С11-С12 ПФОС.
22. Способ по п. 21, в котором быстро выводимые ПФОС выбирают из перфтордекалина (ПФД) или перфтороктилбромида (ПФОБ) или их смесей, и медленно выводимые ПФОС выбирают из перфтортрипропиламина (ПФТПА), перфторметилциклогексилпиперидина (ПФМЦП) или перфтортрибутиламина (ПФТБА) или из смесей.
23. Способ по п. 1 или 2, в котором смесь ПФОС для приготовления предэмульсии готовят смешиванием одного или более жидких ПФОС.
24. Способ по п. 1 или 2, в котором водно-солевой раствор включает NaCl и воду и, необязательно, KCl, MgCl2, NaHCO3, NaH2PO4, Na2HPO4.
25. Способ по п. 24, в котором водно-солевой раствор дополнительно включает глюкозу.
26. Способ по п. 1 или 2, в котором наноэмульсия ПФОС содержит 4,8-7,2 г/л натрия хлорида; 0,31-0,47 г/л калия хлорида; 0,15-0,23 г/л магния хлорида (в пересчете на сухое вещество); 0,55-0,83 г/л натрия гидрокарбоната; 0,16-0,24 г/л натрия фосфата однозамещенного (в пересчете на сухое вещество); 1,6-2,4 г/л глюкозы.
27. Способ по п. 1 или 2, в котором рН наноэмульсии ПФОС составляет от 5 до 8,0.
28. Способ по п. 27, в котором для корректировки pH изменяют количественное содержание натрия гидрокарбоната и натрия фосфата однозамещенного.
29. Способ по п. 1 или 2, в котором наноэмульсия ПФОС имеет
средний размер частиц не более 150 нм, предпочтительно от 30 до 100 нм, наиболее предпочтительно от 30 до 80 нм.
30. Способ получения стерильной наноэмульсии перфторорганических соединений (ПФОС), включающий:
- предварительное заполнение циркуляционного контура водным раствором стабилизирующей добавки;
- добавление смеси ПФОС к водному раствору стабилизирующей добавки;
- гомогенизацию смеси ПФОС с водным раствором стабилизирующей добавки с получением предэмульсии ПФОС;
- смешивание предэмульсии ПФОС с водно-солевым раствором с получением наноэмульсии ПФОС.
| RU 2122404 C1, 27.11.1998 | |||
| ЭМУЛЬСИЯ ПЕРФТОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ, СПОСОБ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | 2000 |
|
RU2206319C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНЫХ ЭМУЛЬСИЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ | 1994 |
|
RU2070033C1 |
| ЭМУЛЬСИЯ ПЕРФТОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ, СПОСОБ ЕЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ | 2006 |
|
RU2393849C2 |
| WO 1994014415 A1, 07.07.1994 | |||
| WO 2010121082 A2, 21.10.2010 | |||
