СПОСОБ ОЦЕНКИ ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТИ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ Российский патент 2015 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в исследованиях по физиологии и биотехнологии растений, а также в селекции сельскохозяйственных культур для оценки засухоустойчивости сельскохозяйственных растений и ускорения отбора селекционного материала по этому признаку.

Известны лабораторные способы оценки засухоустойчивости сельскохозяйственных растений, основанные на прорастании семян и росте проростков в растворах осмотиков (сахарозы, ПЭГ), имитирующих недостаток влаги. Так, широко известен способ диагностики засухоустойчивости полевых культур, в котором здоровые, нормально выполненные семена, демонстрирующие всхожесть не менее 75-85, после стерилизации в формалине проращивают на фильтровальной бумаге в стерилизованных сосудах в термостате в растворе сахарозы с соответствующим испытуемой культуре осмотическим потенциалом (опыт) и в дистиллированной воде (контроль), вычисляют отношение числа проклюнувшихся на 5 сутки семян в опыте к числу проклюнувшихся в контроле, сравнивают со всхожестью на растворе сахарозы стандартного copтa, обладающего в полевых условиях высокой устойчивостью к засухе [Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям (методическое указание) / Под ред. Удовенко Г.В. - л.: ВИР. - 1988. - 228 с.].

Недостатком данного способа является относительная оценка засухоустойчивости растений на организменном уровне, которая позволяет выделить образцы, перспективные для более глубокого изучения их устойчивости.

Более достоверную информацию дает оценка засухоустойчивости на клеточно-тканевом уровне по каллусной культуре, поскольку она затрагивает более глубокие механизмы засухоустойчивости. В каллусной культуре вне зависимости от способов ее получения полностью сохраняется генотип донорного растения.

Известен способ оценки растений in vitro, отражающий реакцию генотипов на неблагоприятные абиотические факторы внешней среды (в частности на засуху), в котором зрелые зерна в количестве 120-160 штук стерилизуют в 70% этиловом спирте, затем в 0,1 растворе сулемы по 20 минут в каждом, далее 6-кратно промывают по 10 минут, выдерживают в стерильной воде 3 часа, верхние половинки зародышей высаживают в пробирки объемом 25 мл на содержащую 2,4-Д агаризованную питательную среду, культивируют 90-120 дней при освещенности 1,0-1,5 клк, 1 б-часовом фотопериоде, подсчитывают долю каллусных культур с высокой регенерационной способностью и долю культур с регенерантами, к устойчивым относят те образцы, у которых сумма этих долей составляет более половины числа оцениваемых культур [Способ оценки растений in vitro к абиотическим факторам внешней среды: пат. 2146865, Россия, RU A01H 4/00, A01H 1/04 (прототип)].

Недостатком данного способа является трудоемкость - требует обработки большого количества зерен (120-160 шт. для каждого варианта), длительность - длительна подготовка эксплантов для асептического введения в культуру (280 мин), длительно культивирование in vitro (90-120 дней).

Техническим результатом изобретения является ускорение способа оценки засухоустойчивости растений за счет ускоренной подготовки эксплантов и уменьшения их количества, ранняя выбраковка оцениваемого образца до достижения им полной спелости, повышение точности способа путем одновременной регистрации в идентичных условиях оценочных параметров.

Технический результат достигается за счет того, что он включает два этапа культивирования зародышей незрелых зерен: индукция и пролиферация каллусов; введение на втором этапе стрессовых агентов в питательную среду, фиксацию с помощью флуориметра скорости фотосинтетического транспорта электронов через фотосистему 2 каллусов; оценку засухоустойчивости генотипов по уровню интенсивности возбуждающего света, при котором происходит снижения световой кривой до нуля, чем выше интенсивность света, тем выше засухоустойчивость образца.

Пример осуществления способа.

Выбирают сорта мягкой яровой пшеницы с различной устойчивостью к засухе, например, засухоустойчивый - Мильтурум 2419, среднеустойчивый к засухе - Тулунская 12, незасухоустойчивый - Снаббе. Зерна в стадии молочно-восковой спелости стерилизуют 14 минут в 7,5% растворе гипохлорита натрия, промывают в дистиллированной воде последовательно в течение 5, 10 и 15 минут, вычленяют зародыши, высаживают их в пробирки объемом 5 мл на агаризованную среду (например, Мурасиге-Скуга), содержащую 2,4-Д (в концентрации, определенной для данной культуры), культивируют при температуре 20-24°C при естественном освещении без досвечивания до достижения каллусами объема не менее 125 мм³ (обычно 20-25 дней), отбирают каллусы с побегами (не менее 20 шт.), после удаления побегов отобранные каллусы по 8-10 штук высаживают в чашки Петри на агаризованную среду того же состава, но с уменьшенной концентрацией 2,4-Д и добавлением стрессового агента, обеспечивающего осмотическое давление 0,5 МПа (для данной культуры), культивируют при освещенности 2,5-3,0 кЛк, при 16-часовом фотопериоде и температуре 20-24°C в течение 7 суток, поскольку в этот срок реакция фотосинтетического аппарата на стресс наиболее выражена. С использованием флуориметра (например, IMAGING-РАМ, серия МАХТ WALZ, Германия) для каллусов без их изъятия из чашек Петри проводят регистрацию световых кривых скорости транспорта электронов (СТЭ) через фотосистему 2 в диапазоне интенсивности возбуждающего света от 0 до 400 мкмоль фотонов/м²с, усредняют данные измерений всех каллусов одного сорта, строят для каждого сорта график зависимости скорости СТЭ от интенсивности возбуждающего света, оценивают засухоустойчивость генотипов по уровню интенсивности возбуждающего света, при котором световая кривая пересекает ось абсцисс. Чем выше этот уровень, тем более засухоустойчив генотип.

На графике (см. чертеж) наглядно прослеживается распределение исследуемых сортов по степени засухоустойчивости. После достижения максимальной величины СТЭ не снижается до нуля в диапазоне интенсивности возбуждающего света от 100 до 400 мкмоль фотонов/м²с для сорта Мильтурум 2419, сорт оцениваем как высокоустойчивый к засухе. Для более конкретной оценки данного сорта необходимо увеличить верхнюю границу диапазона интенсивности возбуждающего света.

Для сортов Тулунская 12 и Снаббе после достижения максимальной величины СТЭ снижается и падает до нуля при интенсивности возбуждающего света 281 мкмоль фотонов/м²с (для сорта Тулунская 12) и 186 мкмоль фотонов /м²с (для сорта Снаббе), что свидетельствует о меньшей засухоустойчивости этих сортов, при этом сорт Снаббе наименее засухоустойчив. Оценка засухоустойчивости оцениваемых сортов, проведенная предлагаемым способом, соответствует изначальной их характеристике.

Преимущества способа: проведение оценки засухоустойчивости растений через 40-50 дней после посева, использование незрелых зерен (в стадии молочно-восковой спелости), позволяющее ускорить (до 44 мин) подготовку эксплантов к культивированию за счет более мягких режимов стерилизации; экономия питательной среды (400-500 мл, вместо 2400-3200 мл) за счет меньшего количества и размера пробирок и уменьшения количества культивируемых эксплантов (40-50 шт. вместо 120-160 шт.); конкретизация стресса за счет применения осмотика; сокращение периода культивирования in vitro до 27-32 дней (вместо 90-120 дней); одновременное фиксирование световых кривых у 8-10 каллусов, позволяющее увеличить точность оценки за счет идентичности условий; наличие численных параметров, позволяющих сравнивать (ранжировать) засухоустойчивость генотипов без использования контрольного варианта условий и засухоустойчивого образца (стандарта).

Изобретение относиться к области сельского хозяйства, физиологии и биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ оценки засухоустойчивости генотипов пшеницы. Способ включает культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д. По достижении каллусами объема не менее 125 мм³ их культивируют в течение 7 суток в чашках Петри на новой среде того же состава, но с меньшей концентрацией 2,4-Д и с добавлением осмотика. Пропускают на флуориметре сквозь чашки Петри без изъятия из них каллусов и нарушения стерильности в режиме «насыщающих импульсов» возбуждающий свет в диапазоне интенсивности, достаточном для закрытия реакционных центров фотосистемы 2. Регистрируют световые кривые скорости транспорта электронов (СТЭ) согласно программному обеспечению и установкам флуориметра. После усреднения данных строят график зависимости СТЭ от интенсивности возбуждающего света. Заключение о засухоустойчивости сорта делают по интенсивности возбуждающего света, при которой световая кривая пересекает ось абсцисс: чем выше интенсивность света, тем выше засухоустойчивость образца. Способ позволяет ускорить оценку засухоустойчивости и селекционный процесс. 1 ил.

Способ оценки засухоустойчивости генотипов пшеницы, включающий культивирование зародышей зерен на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-Д, отличающийся тем, что по достижении каллусами объема не менее 125 мм³ их культивируют в течение 7 суток в чашках Петри на новой среде того же состава, но с меньшей концентрацией 2,4-Д и с добавлением осмотика, пропускают на флуориметре сквозь чашки Петри без изъятия из них каллусов и нарушения стерильности в режиме «насыщающих импульсов» возбуждающий свет в диапазоне интенсивности, достаточном для закрытия реакционных центров фотосистемы 2, регистрируют световые кривые скорости транспорта электронов (СТЭ) согласно программному обеспечению и установкам флуориметра, после усреднения данных строят график зависимости СТЭ от интенсивности возбуждающего света, заключение о засухоустойчивости сорта делают по интенсивности возбуждающего света, при которой световая кривая пересекает ось абсцисс: чем выше интенсивность света, тем выше засухоустойчивость образца.