Способ получения каллусной культуры цикория (Cichorium intybus L.) Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, к культивированию in vitro каллусных культур цикория (Cichorium intybus L.), содержащих инулин, который может быть использован в пищевой промышленности для получения сырья (инулин) вне зависимости от сезона выращивания растительного материала.

Одним из направлений научных исследований является создание новых форм, гибридов и сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной продуктивностью. Особый интерес представляют исследования, направленные на получение растений, обладающих высоким биосинтетическим потенциалом накапливать минеральные и органические соединения, витамины, вещества фенольной природы и др., которые оказывают благоприятное действие на организм как человека, так и животных [Калашникова, Е.А. Клеточная инженерия растений. Учебник, практикум. / Е.А. Калашникова. - М.: Москва, Юрайт.2020, - 324 с.]. Вторичные соединения, обладающие сладким вкусом, принадлежат к очень разным химическим классам, например, лактонам и фенольным соединениям, флавоноидам, терпеноидам и сапонинам, а также белкам. Только несколько натуральных молекул со сладким вкусом (глициризин, стевиол) в настоящее время имеют более широкое применение, что объясняется трудоемкими условиями культивирования, поскольку растениям требуются особые условия для их роста, или отсутствием простых методов для выделения соединений. Кроме того, в большинстве случаев отсутствует объяснение молекулярных механизмов, которые запускают способы биосинтеза и накопления соединений в интактных растениях [Калашникова, Е.А., Основы биотехнологии. / Е.А. Калашникова, М.Ю. Чередниченко, Р.Н. Киракосян. М.: Москва, КноРус. 2022, - 277 с.]. Таким образом, многие принципиально интересные природные вторичные растительные метаболиты со сладким вкусом в настоящее время имеют ограниченную ценность для рынка. Поскольку ожидается, что мировой рынок метаболитов сладкого вкуса значительно вырастет в течение следующих нескольких лет, необходимо расширить знания о регуляции систем биосинтеза и продукции посредством дополнительных исследований и разработать метод, гарантирующий высокий выход соответствующих продуктов - метаболитов.

Особый интерес, в последнее время, привлекают растения, способные образовывать в тканях инулин - природный полисахарид не имеющий синтетических аналогов. Он содержится более чем в 3000 растениях, преимущественно в их корнях и клубнях, среди которых выделяются цикорий (Cichorium intybus L.), топинамбур (Helianthus tuberosus L.), батат (Ipomoea batatas L.), девясил (Inula helenium L.), спаржа (Asparagus officinalis L.), одуванчик (Taraxacum officinale Wigg.) и другие растения.

Инулин используют в качестве пребиотика, заменителя жира, сахара, модификатора текстуры, а также для разработки функциональных пищевых продуктов с целью улучшения работы ЖКТ. По литературным данным инулин играет превентивную роль в отношении желудочно-кишечных осложнений, таких как запоры и многие заболевания желудочно-кишечного тракта, особенно заболевания раздраженного кишечника и рак толстой кишки, а также улучшает перистальтику кишечника. Кроме того, потребление инулина усиливает усвоение кальция, магния и железа и стимулирует иммунную систему [Shoaib, М. Inulin: Properties, health benefits and food applications. / Shoaib M., Shehzad A., Omar M., Rakha A., Raza H., Sharif H.R., Shakeel A., Ansari A., Niazi S. // Carbohydr. Polym. - 2016, - 147, - 444-454.]. Исследования in vitro показали, что инулин обладает активностью по удалению радикалов и способностью восстанавливать железо, хотя они слабее, чем витамин С. Кроме того, исследования кур-несушек in vivo показали, что пищевые добавки с инулином значительно улучшили антиоксидантный статус этих птиц [Shang, Н.М. In vitro and in vivo antioxidant activities of inulin / Shang, H.M., Zhou H.Z., Yang J.Y., Li R., Song H., Wu -H.X // PLoS ONE, - 2018, - 13, - 19-22.]. Поэтому природные источники инулина имеют большую ценность, обладая пользой для здоровья человека.

Анализ состояния рынка показывает, что, как правило, в производстве функциональных продуктов питания, Российские производители используют импортный инулин, полученный из цикория (производитель - Германия, Бельгия). Однако все больший удельный вес по объемам производства в мире занимает инулин, выделенный из клубней топинамбура (производитель - Китай). В настоящее время глобализация и информационная революция обострили существенные проблемы мировой экономики, что привело к импортозамещению ряда товаров и продуктов. Поэтому необходимо получать свою конкурентоспособную продукцию высокого качества. Данное направление приобретает особую актуальность и для производства продуктов питания функционального и диетического назначения.

В отличие от основных продовольственных культур, инулинсодержащие растения, в основном, дают сравнительно высокий урожай в относительно теплых климатических условиях. Среди абиотических стрессов известно, что холодовой стресс является одним из основных факторов окружающей среды, ограничивающих сельскохозяйственное производство, вызывая ущерб до и после сбора урожая, что ежегодно приводит к огромным финансовым потерям в сельском хозяйстве. Холодовой стресс также оказывает огромное влияние на выживание и географическое распространение растений. Стандартные методы селекции демонстрируют ограниченный успех в создании устойчивых к холоду сельскохозяйственных растений, поскольку для большинства чувствительных к холоду растений существует потребность в межвидовой или даже межродовой гибридизации. Поэтому выращивание инулинсодержащих растений (цикорий, батат) в условиях рискового земледелия имеет свои ограничения.

Развитие клеточных и генетических технологий in vitro, используемых для производства биологически активных веществ (БАВ) из растений, являются перспективными подходами к выполнению принципов «зеленых» технологий. Данные технологии являются экологически безвредными по сравнению с традиционными способами производства и помогают грамотно управлять ресурсами и снижать негативную нагрузку на природу.

Производство БАВ in vitro, как правило, осуществляется из микроклонов или дедифференцированных каллусных культур. Такие технологии позволяют экономить производственные площади, проводить работы в течение года и не зависеть от внешних условий выращивания. Главным преимуществом таких технологий является возможность управления биосинтетическим потенциалом растений и дедифференцированных каллусных культур в условиях in vitro, получать штаммы и линии суперпродуцентов вторичных метаболитов. Данный процесс зависит от генетических, биохимических и физиологических особенности растений, а также от условий выращивания.

Известен способ получения каллусной ткани чая (Camellia sinensis L.), включающий выращивание каллусов на питательной среде, содержащей макро- и микросоли по прописи Хеллера, витамины по Уайту, аденин в концентрации 5 мг/л, 2,4-Д - 5 мг/л, глюкозу - 25 г/л, агар - 7 г/л, при 26°С, с последующим переносом клеток в жидкую питательную среду того же состава с добавлением L-фенилаланина в концентрации 3 мМ и выращиванием при относительной влажности воздуха 70% на качалке с частотой 90 об/мин в условиях темноты 14 суток [RU 2 709 692 C1, А01Н 4/00, опубликовано 04.05.2019 г.]. Способ позволяет получать клеточные культуры с высокой способностью накапливать фенилпропаноиды. Недостатком предлагаемого способа является смена среды - твердой (агаризованной) на жидкую (суспензия), что делает данную технологию более трудоемкой.

Известен способ получения каллусной ткани из листовых пластинок асептических растений черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.), включающий культивирование листовых эксплантов на агаризованной питательной среде Woody Plant Medium (WPM), содержащей a-нафтилуксусную кислоту - 0.5 мг/л и 6-бензиламинопурин - 0.5 мг/л. Каллусную ткань выращивают при освещении лампами дневного света Philips TL-D 36W, 2000-5000 люкс, или за счет освещения фитолампами Osram fluora L36W/77, 2000-5000 люкс. Пересадку каллусной ткани на свежую питательную среду проводят каждые 4-6 недель [RU 2 709 175 С1, C12N 5/04, опубликовано 16.12.2019 г.]. Способ позволяет получать клеточные культуры способные накапливать фенольные соединения, в частности, флаваноиды. Недостатком предлагаемого способа является нестабильный выход фенольных соединений в конце цикла культивирования.

Известны способы получения каллусной ткани из семян болиголова (Conium maculatum L.) [RU 2590586 C1, C12N 5/04; A01H 5/10, опубликован 10.07.2016 г.] и борца (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.) [RU 2631927 C1, C12N 5/04, опубликован 28.09.2017 г.], включающие стерилизацию семян в спирте и сулеме, помещение их на питательную среду Мурасиге-Скуга для образования этиолированных проростков, выращивание проростков на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС) с гормонами 2,4-Д и БАП для получения и дальнейшего культивирования каллусов. Пролиферацию каллусной ткани осуществляли на среде, содержащей НУК в сочетании БАП. Способы направлены на получение каллусной ткани, способной накапливать алкалоиды и терпеноиды. Недостатком этих способов является использование довольно токсичного агента - сулемы, а также смена гормонального состава питательной среды для культивирования каллусов, что делает технологию более трудоемкой.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ получения каллусной ткани цикория (Cichorium intybus L.) из листовых пластинок асептических растений, культивирование на питательной среде МС, содержащей 7,5 мг/л НУК в сочетании с 2,0 мг/л БАП [Калашникова Е.А., Киракосян Р.Н., Темирбекова С.К., Мелешина О.В., Афанасьева Ю.В., Тареева М.М. Получение клеточных культур cichorium intybus 1. in vitro как источника инулина // Вестник российской сельскохозяйственной науки. - 2022. - №1. - С. 37-41]. Недостатком данного способа является получение каллусной ткани из листовых пластинок, в которых инулин содержится в небольших количества, а следовательно в клеточных культурах его содержание минимально.

В результате анализа литературных данных и патентного поиска установлено, что исследования направлены на применение разных способов определения инулина только в интактных растениях, а не в каллусной ткани. Следовательно, необходимо разработать способ, позволяющий снизить трудоемкость культивирования каллусной ткани цикория посредством использования одного варианта питательной среды и условий культивирования, позволяющих получать инулин в необходимом количестве.

Задача предлагаемого изобретения - разработать способ получение каллусной культуры Cichorium intybus L. in vitro, богатой фруктанами, в частности, инулином. Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является накопление инулина в каллусной ткани цикория in vitro.

Указанная проблема и заявленный технический результат достигается за счет того, что каллусную культуру получают из сегментов корней 30-суточных асептических растений цикория, путем культивирования на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497], а также 7,5 мг/л НУК, 1 мг/л препарат Эпин.

Выращивают в условиях освещения светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 30% и 70% соответственно в течение всего цикла культивирования, при температуре 23-25°С и 16 -часовом фотопериоде.

Известных в научно-технической и патентной литературе способов с использованием корневых эксплантов и аналогичным составом питательной среды и условий выращивания не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением питательной среды для получения каллусной ткани in vitro для других инулинсодержащих растений не достигался в известных решениях.

Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

Для получения культуры in vitro цикория (С.intybus L.) использовали семена элитной репродукции сорта Петровский (урожай 2019 г.), селекции Ростовской опытной станции. Семена стерилизуют 0.1% раствором HgCl₂ (сулема) в течение 7 мин, трижды промывают стерильной дистиллированной водой и высевают в чашки Петри диаметром 90 мм на агаризованную МС-среду без добавления регуляторов роста. рН МС-среды доводят до 5,8 перед автоклавированием. Чашки Петри помещают на стеллажи под белые линейнолюминесцентные лампы (интенсивность освещения 150 мкмоль/м² с) и проращивают при температуре 23-25°С и 16-часовом световом дне. Полученные 16-дневные проростки пересаживают в культуральные сосуды объемом 200 мл на питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи МС, 1,0 мг/л препарат Эпин и 0,1 мг/л ИУК для формирования асептических растений с правильной морфологией.

Каллусную ткань получают из сегментов корней, изолированных с 30-дневных асептических растений цикория, на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи МС, дополненной препаратом Эпин в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с НУК 7,5 мг/л, выращивают каллусную культуру в чашках Петри (диаметром 90 мм) при освещении белыми линейнолюминесцентными лампами (интенсивность освещения 150 мкмоль/м с) и 16-часовом световом дне в течение первого цикла выращивания. Каждые 4 недели каллусную ткань пересаживают на свежую питательную среду. Последующие циклы культивирования, каллусную ткань выращивают в условиях освещения светодиодами красного и синего спектра в соотношении 30% к 70% соответственно при температуре 23-25°С, и 16-часовом фотопериоде.

Изобретение проиллюстрировано на рисунках.

На фиг. 1 каллусная ткань С.intybus, полученная из корневых эксплантов на питательной среде с ИУК

На фиг. 2 каллусная ткань С.intybus, полученная из корневых эксплантов на питательной среде с НУК

На фиг. 3 каллусная ткань С.intybus, полученная из корневых эксплантов на МС-среде с добавлением препарата Эпин 1,0 мг/л в сочетании с 7,5 мг/л НУК при освещении светодиодными лампами с красным спектром 70% и синим спектром 30%

На фиг. 4 каллусная ткань С.intybus, полученная из корневых эксплантов на МС-среде с добавлением препарата Эпин 1,0 мг/л в сочетании с 7,5 мг/л НУК при освещении светодиодными лампами с красным спектром 30% и синим спектром 70%

Пример 1. Для получения культуры in vitro цикория (С.intybus L.) использовали семена элитной репродукции сорта Петровский (урожай 2019 г.), селекции Ростовской опытной станции.

Семена цикория сорта Петровский (селекции Ростовской опытной станц) стерилизовали 0,1%) раствором HgCl₂ в течение 7 мин, трижды промывали стерильной дистиллированной водой и высевали в чашки Петри диаметром 90 мм на агаризованную питательную среду МС без добавления регуляторов роста. рН среды МС доводили до 5,8 перед автоклавированием. Проращивали семена в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 23-25°С и 16-часовой световой день. Для получения растений с правильной морфологией 16-дневные проростки пересаживали в культуральные сосуды объемом 200 мл на питательную среду МС, дополненную препаратом Эпин в концентрации 1,0 мг/л и 0,1 мг/л ИУК.

Каллусную ткань получали из сегментов корней, изолированных с 30-дневных асептических растений цикория, на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи МС, дополненной препаратом Эпин в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с различными ауксинами НУК, ИУК и 2,4-Д в концентрации 5,5-9,5 мг/л. Каждые 4 недели каллусную ткань пересаживали на свежую питательную среду. При этом учитывали структуру и цвет каллусной ткани. Интенсивность роста каллусной ткани определяли по ее массе (мг). Для этого осуществляли взвешивание ткани в условиях ламинар-бокса в начале и в конце цикла выращивания. На основании полученных результатов вычисляли прирост каллусной культуры на 28 сутки культивирования (Gr) (V и VI циклы выращивания). Для расчетов использовали следующую формулу:

Gr=X_max/Х₀,

где X_max и Х₀ - максимальное и начальное значения сырой массы каллусной ткани. Полученные результаты приведены в таблице 1 и рисунках 1 и 2.

Установлено, что наилучший прирост каллусной ткани был отмечен на питательной среде, содержащей НУК. В вариантах с ИУК каллусная ткань характеризовалась низкой пролиферативной активностью, а на среде с 2,4-Д - формирование каллусной ткани не происходило. Наибольший и стабильный прирост каллусной ткани отмечен при добавлении в состав питательной среды НУК в концентрации 7,5 мг/л. В этом варианте в V и VI циклах выращивания прирост каллусной ткани составил 5,28 и 5,96 соответственно, что превышает данный показатель в варианте с ИУК (7,5 мг/л) примерно в 2.0-2.4 раза.

Пример 2. Каллусную ткань получали по методике, описанной в примере 1. Изучали влияние светокультуры на формирование каллусной ткани. Исследовали 3 варианта освещения:

1 вариант - облучатели на базе белых светодиодов (СД) цветовой температуры 3500 K и 6000 K и монохроматический красных СД с пиком 660 нм (марка «OSRAM AG», производство - Германия) с интенсивностью 150 мкмоль/ м²с (контроль).

2 вариант - многоканальный облучатель на базе белых светодиодов (СД) цветовой температуры 3500 K и 6000 K и монохроматический красных и синих светодиодов с пиками 660 нм и 460 нм соответственно. Мощность каналов монохроматических светодиодов составила: красный -70%, синий - 30%.

3 вариант - многоканальный облучатель на базе белых светодиодов (СД) цветовой температуры 3500 K и 6000К и монохроматический красных и синих светодиодов с пиками 660 нм и 460 нм соответственно. Мощность каналов монохроматических светодиодов составила: красный - 30%, синий - 70%.

Каллусную ткань получали из сегментов корней, изолированных с 30-дневных асептических растений цикория, на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи МС, дополненной препаратом Эпин в концентрации 1,0 мг/л в сочетании с 7,5 мг/л НУК или 7,5 мг/л ИУК. Выращивание каллусной культуры осуществляли в чашках Петри с диаметром 90 мм, при температуре 23-25°С и 16-часовом световом дне.

Спектры излучения измеряли с помощью прибора PLA-20 (Everfine, КНР). Результаты приведены на рисунках 3 и 4.

Экспериментально установлено, что световой режим выращивания оказал влияние на интенсивность роста, структуру и цвет каллусной культуры. При выращивании каллусной ткани на питательной среде, содержащей НУК в условиях освещения светодиодными лампами красного и синего спектров в различных соотношениях формировалась ткань разной интенсивности, рыхлого типа, состоящая из сильно или слабо вакуолизированных клеток. Установлено, что в варианте 2 (освещение светодиодными лампами с красным спектром 70% и синим спектром 30%) интенсивность образования каллусной ткани была минимальной, а в варианте 3 (освещение светодиодными лампами с красным спектром 30% и синим спектром 70%) - максимальной. В этом варианте освещения каллусная ткань зеленела на свету и была способна к морфогенезу. При выращивании каллусной ткани в варианте 1 (контроль) формирование каллусной ткани происходило не значительно.

Пример 3. Количественный анализ инулина в каллусных культурах определяли по стандартной методики с помощью спектрофотометра. Анализ проводили на высушенном материале. Каллусную культуру высушивали в сушильном шкафу при температуре 50°С в течение 24 ч. Для одного анализа брали сухой образец каллуса в количестве 600 мг, помещали в мерную колбу, заливали 9,5 мл 90% этанола и выдерживали в течение 30 мин на водяной бане при температуре 80°С, периодически перемешивая его содержимое. В качестве контроля к образцу каллуса добавляли такой же объем воды. После охлаждения в обе колбы (пробную и контрольную) добавляли 0,05 мл 25% раствора NaOH и объем доводили до 10,0 мл этанолом. Содержимое колб оставляли на 10-20 мин, после чего проводили центрифугирование при 4000-6000 об/мин в течение 3-5 мин. После этого брали пустые мерные колбы объемом 10 мл и переносили в них 0,05 мл центрифугата обоих экстрактов (образца и контроля), а также раствора 3,0 мг/мл фруктозы (стандарт) и воды (контроль). На следующем этапе к полученному объему добавляли 1,0 мл реагента (2,0 мг/мл резорцина+96% этанол и концентрированную соляную кислоту в равных объемах). Колбы выдерживали на водяной бане в течение 35 мин, а затем охлаждали. Объем доводили до 10 мл водой и перемешивали. Оптическую плотность анализируемых образцов и стандартного раствора измеряли на спектрофотометре при длине волны 480 нм. Содержание фруктозосодержащих сахаров в образцах рассчитывали по формуле:

где A_pr и A_st - оптическая плотность опытного образца и стандартного раствора соответственно; C_st - концентрация стандартного раствора фруктозы (3 мг/мл); m_pr - масса навески анализируемого образца каллуса, г. Результат, полученный для водного экстракта, отражает общее содержание водорастворимых углеводов. Результат для экстракта этанола отражает содержание низкомолекулярных фруктозидов. Разница между этими двумя показателями дает содержание инулина. Основные результаты исследований приведены в таблице 2.

Экспериментально установлено, что использование различных условий освещения (соотношение красного и синего спектров) оказывает значительное стимулирующее действие на накопление инулина в каллусе, полученном их корневых сегментов. Более того, максимальное значение инулина (15% к сухой биомассе клеток) было получено в каллусной ткани, культивируемой на питательной среде МС, содержащей 7,5 мг/л НУК в сочетании с препаратом Эпин 1,0 мг/л при режиме освещения светодиодными лампами с красным и синим спектром в соотношении 30% и 70% соответственно.

На основании полученных данных в результате проведения цикла исследований был разработан способ получение каллусной культуры Cichorium intybus L. in vitro, богатой инулином, включающий культивирование каллусной ткани, полученной из корневых эксплантов, на питательной среде МС, содержащей НУК 7,5 мг/л в сочетании с препаратом Эпин 1 мг/л при освещении светодиодными лампами с красным и синим спектром в соотношении 30% и 70% соответственно.

Предлагаемый способ получения in vitro каллусной ткани цикория сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать его в практической работе и для получения каллусной ткани других инулинсодержащих растений:

1. Технология предлагает использовать в небольших количествах легкодоступный, дешевый материал семян цикория.

2. Технология предполагает проведение работ в лабораторных условиях не зависимо от сезона и негативных факторов окружающей среды.

3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования и питательных сред.

4. Предлагаемый способ обеспечивает получение большого количества биомассы in vitro культуры цикория, в клетках которых накапливается инулин в концентрации 15%.

5. Предлагаемый способ является универсальным для получения in vitro каллусной ткани других инулинсодержащих растений.

Изобретение по сравнению с прототипом обеспечит накопление ценного вещества - инулин в концентрации 15% и более.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения каллусной ткани цикория (Cichorium intybus L.). Это достигается за счет использования питательной среды Мурасига и Скуга, в состав которой добавляют 7,5 мг/л НУК и 1,0 мг/л препарата Эпин и культивируют при освещении светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 30% и 70% соответственно, при температуре 23-25°С и 16-часовом световом дне. Изобретение позволяет повысить содержание инулина в каллусной культуре до 15%. 4 ил., 2 табл., 3 пр.

Способ получения каллусной ткани цикория (Cichorium intybus L.), включающий получение каллусной ткани из сегментов асептических растений цикория, выращенных из семян на безгормональной питательной среде Мурасига и Скуга, отличающийся тем, что каллусную ткань получают из сегментов корней, изолированных с 30-дневных асептических растений, и культивируют на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно добавляют индуктор образования каллусной ткани - нафтилуксусную кислоту - 7,5 мг/л и препарат Эпин - 1,0 мг/л и выращивают при освещении светодиодными лампами с красным и синим спектром в соотношении 30% и 70% соответственно.