Способ ранней диагностики деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости на основе показателя жизнеспособности каллусных культур in vitro Российский патент 2019 года по МПК A01H4/00 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений и лесного хозяйства. Цель изобретения - ранняя диагностика генотипов сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости с использованием каллусных культур in vitro в моделируемых стрессовых условиях.

В последние десятилетия отмечается резкое увеличение количества засух, их усиление [1]. Среди всех аномальных природно-климатических явлений на их долю приходится около 26% случаев [2]. Увеличение среднегодовых температур, ведущих к учащению засух и аридизации климата, пагубно сказывается на состоянии лесов, приводит к нарушению их репродуктивной способности, деградации и усыханию [3, 4].

Способность растений адаптироваться к засушливым условиям зависит, в первую очередь, от их генотипических особенностей [5].

Получение стрессоустойчивых растений на основе биотехнологического подхода с использованием культуры ткани in vitro уже давно применяется на практике, но в основном, для сельскохозяйственных культур.

Формирование каллуса происходит в ответ на поранение растения, либо в результате изменения гормонального баланса [6, 7]. Способность изолированной ткани к каллусообразованию, прежде всего, зависит от генотипических особенностей исходного материнского растения, а также от условий культивирования эксплантов. Данный способ заключается в получении жизнеспособного каллуса в моделируемых стрессовых условиях с добавлением стрессирующего агента, либо на среде, помещенной в стрессовые для растения условия (холод, засуха и т.д.).

Чаще всего в качестве параметров оценки каллусогенной способности тканей применяют частоту и интенсивность каллусогенезов (далее ЧК и ИК соответственно).

ЧК - отношение количества эксплантов, сформировавших каллус, к их общему количеству, помещенных на питательную среду. Например, ЧК использовали для оценки и отбора устойчивых к тяжелым металлам растений огурца и редиса [8], форм ярового ячменя устойчивого к корневым гнилям [9] и др.

Известен способ получения солеустойчивых растений газонных трав овсяницы и полевицы через каллусные культуры путем их помещения на селективные питательные среды (Способ получения толерантных к засолению газонных трав in vitro. Заявка: 2004103983, 12.02.2004; дата начала отсчета срока действия патента: 12.02.2004. Опубликовано: 27.09.2005; МПК А01Н 4/00, А01Н 5/04). Учет каллусогенной способности растений на селективной питательной среде вели по показателю ЧК. По нашему мнению, при оценке каллусогенной способности растений с помощью данного показателя стоит учитывать тот факт, что без применения оптической техники не всегда можно диагностировать наличие каллуса на экспланте. То есть в некоторых случаях каллусная ткань, только начав формироваться в виде небольших групп клеток, не идентифицируемых невооруженным глазом, погибает. В подобном случае результаты могут быть не достоверными.

В качестве ближайшего аналога данной работы можно привести статью Аминевой Е.Ю. и др. [10] «Оценка засухоустойчивости отдельных генотипов Pinus sylvestris L. на основе метода культуры ткани in vitro в моделируемых стрессовых условиях» («Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства». 2017. №1. С. 14-22). Отличительным признаком настоящего изобретения от ближайшего аналога является исключение из состава питательной среды никотиновой кислоты и пиридоксина, а также из гормонального состава - 2,4 Д.

Показатель ИК, характеризующий рост каллусной ткани, применялся для оценки каллусных культур лаванды, устойчивых к NaCl [11], теплоустойчивого картофеля [12]; выявления реакции зерновых злаков на абиотический стресс [13] и др. Учет ИК, как правило, ведется несколькими способами. Часто оценку проводят при помощи периодического измерения веса каллуса на протяжении определенного промежутка времени. В ряде других случаев ИК оценивают с применением балльной системы, когда анализ проводится с помощью измерения прироста каллуса в определенные интервалы. В первом случае существует возможность неполной очистки от питательной среды каллусной ткани перед взвешиванием (в случае, если измеряется вес каллуса изъятого из лабораторной посуды), либо постепенного испарения жидкости из питательной среды (когда взвешивание каллуса проводят вместе с культуральным сосудом). Таким образом, результаты взвешивания будут недостоверными. Во втором случае оценка каллусогенеза является субъективной.

Рост каллусной ткани часто представляют в виде цикла: фаза активного деления клеток (логарифмическая и линейная), фаза растяжения (замедление роста: размер клеток растет при их неизменном количестве), завершающая стационарная фаза (размер клеток и их количество не изменяются). Затем наступает старение и отмирание ткани. В завершающей фазе одного цикла культивирования все каллусные культуры подвержены угнетению ростовых процессов, появлению мертвых участков ткани и ее дальнейшей гибели. Одним из основных факторов, определяющих сроки старения и жизнеспособности ткани, является генотип исходного растения. Нами было установлено, что каллусные культуры различных генотипов сосны обыкновенной характеризуются различной жизнеспособностью [14]. Некротическая ткань легко идентифицируются визуально: от жизнеспособной она отличается изменением цвета к более темному, как правило, темно-коричневому.

В настоящем исследовании в качестве дополнительного стрессового фактора использовали NaCl, который добавляли в питательную среду в концентрации 1%. NaCl позволяет моделировать солевой и осмотический стресс одновременно, вследствие чего становится возможным изучение соле- и засухоустойчивости отдельных форм растений [15, 16, 17].

В экспериментах задействовали рекультивированные каллусы сосны обыкновенной от 1 пассажа (не менее 10 культур на каждый генотип, опыт проводился в 3-х кратной повторности). Базовой питательной средой служила среда Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макросолей QA MS) [18]. Из витаминов добавляли тиамин и аскорбиновую кислоту, так как тиамин необходим для метаболизма углеводов и биосинтеза некоторых аминокислот; аскорбиновая кислота является антиоксидантом, производным глюкозы, участвующим в окислительных процессах в качестве кофермента гидроксилаз. Никотиновая кислота и пиридоксин, входящие в состав биотехнологических питательных сред, были исключены. Упрощение состава питательной среды и, следовательно, снижение ее стоимости, способствуют повышению эффективности использования данного метода для ранней диагностики засухоустойчивости деревьев сосны обыкновеной. Углеводное питание обеспечивали 3% сахарозой. В качестве гормонов использовали 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л).

Показано, что по сравнению с контролем (питательная среда без добавления NaCl) все культуры подвержены угнетению ростовых процессов под воздействием NaCl, однако чувствительность была различна в зависимости от особенностей исходного генотипа.

При оценке состояния каллусной ткани выделяли 3 типа культур (фиг. 1):

1) жизнеспособные (с отсутствием участков мертвой ткани);

2) с отдельными очагами некротической ткани;

3) 100% мертвая ткань.

Начало появления участков мертвой ткани для каллусов сосны обыкновенной на питательной среде с добавлением NaCl (1%) в среднем отмечается на 15-20 сутки культивирования. Причем, при добавлении NaCl (1%) различия между генотипами выявляются более четко: для одних генотипов появление первых очагов некротической ткани приходится уже на 5 сутки культивирования, и к 10-15 дню культивирования отмечается 100% некротизация; для других срок начала процесса некротизации приходится на 15-20 сутки.

Техническая задача изобретения направлена на раннюю диагностику деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости.

Техническая задача изобретения достигается путем получения первичных каллусных культур исследуемых деревьев сосны обыкновенной на питательной среде Мурасиге и Скуга с половинным содержанием макросолей (½ MS), 3% сахарозы, гормонами 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л), витаминами - тиамин и аскорбиновая кислота (никотиновая кислота и пиридоксин исключаются). Через 15-20 суток культивирования полученные каллусные ткани переносят на селективную питательную среду с 1% содержанием NaCl. На 10-15 сутки проводят их анализ по признаку жизнеспособности. В зависимости от состояния каллусной ткани в указанный период судят о стрессоустойчивости исходных деревьев. 100% некротизация говорит о низкой стрессоустойчивости, если же участки мертвой ткани отсутствуют или имеются в виде отдельных небольших очагов, то исходное дерево можно отнести к стрессоустойчивому.

Технический результат заключается в простоте, надежности, достоверности и воспроизводимости результатов оценки засухоустойчивости деревьев сосны обыкновенной с помощью предложенного нами параметра (жизнеспособности каллусной ткани) в условиях засоления питательной среды.

Недостатком использования показателя жизнеспособности является относительная длительность эксперимента во времени - 30-40 суток.

В своих исследованиях для определения стрессоустойчивости деревьев сосны обыкновенной мы применяли следующие параметры: ЧК, РЖ, скорость инициации каллусной ткани и предложенный нами, как основной, индикатор - жизнеспособность каллусной ткани. Причем анализировались как первичные каллусные культуры, так и рекультивированные каллусы от 1 пассажа, помещенные в условия моделируемой засухи - на питательную среду с добавлением NaCl (1%). Отбор растительного материала для эксперимента проводили в апреле-мае. Формирование каллусной ткани индуцировали на стеблевых эксплантах сосны обыкновенной. Установлено, что первичные каллусные культуры, формирование которых происходило в наиболее ранние сроки, а также имевшие высокие показатели ЧК и ИК, отличались и высокой жизнеспособностью [14]. Так, для д. №3 появление первых следов каллуса пришлось на 4-5 сутки, ЧК составила 87,6%, интенсивность образования каллусов была также достаточно высокой, и к завершающей фазе культивирования размер каллусной ткани во много раз превышал размеры экспланта. Что касается жизнеспособности культур, то отдельные, небольшие очаги мертвой ткани отмечались на 20-25 сутки, что говорит о стрессоустойчивости исходного дерева. У д. №1 появление первых следов каллуса пришлось на 10-11 сутки, частота каллусогенезов составила 50-57% (что в 1,5 раза меньше по сравнению с д. №3), к завершающей фазе культивирования размеры каллуса не превышали и половины размера экспланта.

Вышесказанное говорит о том, что данные, полученные в результате анализа жизнеспособности каллусных культур, совпадают с таковыми относительно показателей ЧК, ИК и скорости формирования каллусной ткани. Однако, на наш взгляд, идентификация стрессоустойчивости деревьев на основе показателя жизнеспособности является менее трудоемким процессом, дающим более достоверный результат по сравнению с использованием других параметров.

При перенесении полученных первичных каллусов на селективную питательную среду с добавлением 1% NaCl наблюдалась неоднозначная реакция. Для каллусных культур д. №3 изменения по признаку жизнеспособности не отмечались, она оставалась на уровне 22,3 суток. Жизнеспособность каллусной ткани д. №4 была незначительно снижена относительно контроля, однако разница статистически достоверна: 20,7 против 17,9 суток. Для каллусов д. №1 и №2 отмечено снижение жизнеспособности более чем в 2 раза: 11,3 против 5,1 и 10,7 против 4,8 соответственно (фиг. 2).

Таким образом, на основе признака жизнеспособности каллусных культур нам удалось выявить разной степени засухоустойчивости генотипы сосны обыкновенной. Д. №3 и №4 можно отнести к засухоустойчивым, т.к. уровень жизнеспособности их каллусных культур на селективной питательной среде оставался практически неизменным. Для каллусов д. №1 и №2 отмечено значительное снижение жизнеспособности по сравнению с контрольным вариантом (более чем в 2 раза), что свидетельствует о низкой степени засухоустойчивости исходных деревьев.

Источники информации

1. Переведенцев Ю.П. Глобальные и региональные изменения климата на рубеже XX и XXI столетий / Ю.П. Переведенцев и др. // Вестник ВГУ. Сер. география и геоэкология. 2007. №2. С. 5-13.

2. Tugce K. The effects of drought on plants and tolerance mechanisms / K. Tugce, E. Yasemin // G.U. J. Science. 2005. V. 5. №4. P. 723-740.

3. Замолодчиков Д.Г. Оценка климатогенных изменений разнообразия древесных пород по данным учетов лесного фонда / Д.Г. Замолодчиков // Успехи современной биологии. 2011. Т. 131. №4. С. 382-391.

4. Завельская А.А. Прогноз влияния изменения климата на бореальные леса России / А.А. Завельская, Н.В. Зукерт, Е.Ю. Полякова, А.А. Пряжников // Лесоведение. 1993. №3. С. 16-24

5. Генкель П.А. Физиология жаро- и засухостойчивости растений // М.: Наука. 1982. 278 с.

6. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений / Л.А. Лутова. СПб.: Изд-во Спб. ун-та. 2010. 240 с.

7. Кунах В.А. Пластичность генома соматических клеток и адаптивность растений / В.А. Кунах // Молекулярная и прикладная генетика. 2011. Т. 12. С. 7-14.

8. Емельянова И.С.Об использовании каллусных культур растений для изучения стрессовых воздействий

9. Сорокатая Е.И. Использование биотехнологических методов для получения устойчивых к корневым гнилям форм ярового ячменя // Автореф. дис.… канд. биол. наук. Красноярск. 2001. с. 110.

10. Аминева Е.Ю., Табацкая Т.М., Машкина О.С., Попов В.Н. Оценка засухоустойчивости отдельных генотипов Pinus sylvestris L. на основе метода культуры ткани in vitro в моделируемых стрессовых условиях / Труды Санкт-Петербургского научно-исследовательского института лесного хозяйства. 2017. №1. С. 14-22.

11. Егорова Н.А. Разработка методических основ клеточной селекции лаванды in vitro на устойчивость к NaCl // Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2011. Вып. 5. С. 173-179.

12. Муминджанов Х.А. Селекция и семеноводство картофеля на основе физиологических тестов и методов клеточной биотехнологии // Автореф. дис.… докт. с-х. наук. Душанбе. 2000. с. 244.

13. Терлецкая Н.В. Неспецифические реакции зерновых злаков на абиотические стрессы in vivo и in vitro. Монография. - Алматы, 2012. - 208 с.

14. Пардаева Е.Ю., Табацкая Т.М., Машкина О.С. Оценка стрессоустойчивости различных генотипов сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) с помощью биотехнологического метода // Лесохозяйственная информация. Лесная генетика и селекция. 2015. №4. С. 58-65.

15. Левенко Б.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к стрессовым факторам // Автореф. дис.… докт. биол. наук. ИФРГ. К. 1991. 41 с.

16. Игнатова С.А. Клеточные технологии в растениеводстве, генетике и селекции возделываемых растений: задачи, возможности, разработки систем in vitro. Одесса: Астропринт, 2011. 224 с.

17. Ошмарина В.И., Получение резистентных к NaCl и этионину клеточных линий Nicotiana sylvestris и их характеристика / В.И. Ошмарина, З.Б. Шамина, Р.Г. Бутенко // Генетика. - 1983. - Т. 19, №5. - С. 822-827.

18. Murashige Т.А., Skoog Т.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaceo tissue cultures // Phisiologia Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ ранней диагностики деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости, основанный на использовании каллусных культур in vitro, культивируемых в условиях моделируемой засухи (1% NaCl) на питательной среде MS с добавлением 3% сахарозы, уменьшенным содержанием витаминов (В1 - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 0,4 мг/л, пиридоксин и РР исключены), гормонов 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л), с дифференциацией культур через 10-15 суток культивирования по признаку жизнеспособности: отсутствие некротической ткани - засухоустойчивое исходное дерево, 100% некротизация - неустойчивое к засухе. Изобретение позволяет простото, надежно, достоверно оценить засухоустойчивость деревьев сосны обыкновенной с помощью параметра жизнеспособности каллусной ткани в условиях засоления питательной среды. 2 ил.

Способ ранней диагностики деревьев сосны обыкновенной по признаку засухоустойчивости, основанный на использовании каллусных культур in vitro, культивируемых в условиях моделируемой засухи (1% NaCl) на питательной среде MS с добавлением 3% сахарозы, уменьшенным содержанием витаминов (В1 - 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота - 0,4 мг/л, пиридоксин и РР исключены), гормонов 6-БАП (0,5 мг/л), НУК (2 мг/л), с дифференциацией культур через 10-15 суток культивирования по признаку жизнеспособности: отсутствие некротической ткани - засухоустойчивое исходное дерево, 100% некротизация - неустойчивое к засухе.