СИСТЕМА ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/132 A61K33/44 A61K9/14 A61K47/04 B82B1/00 B82Y5/00 

Изобретение относится к области фармацевтики, фармацевтической нанотехнологии и фармакологии, касается системы доставки биологически активных веществ, в том числе лекарственных веществ, в организм, способа ее получения и может быть использовано в медицине.

Известны системы для доставки биологически активных веществ, в том числе лекарственных веществ, в организм в форме фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающая фосфатидилхолин растительного происхождения и мальтозу [1].

Известны системы доставки биологически активных веществ, в том числе лекарственных веществ, в организм в форме их комбинации с полимерным наполнителем. Лекарства, содержащие наночастицы, могут быть получены путем внедрения биологически активного вещества, или лекарственного вещества, во время или после получения полимерной дисперсии. Активные компоненты растворяются, захватываются или адсорбируются на поверхности наночастиц. Также возможна комбинация этих механизмов [2]. Однако, полимерные наночастицы могут обладать существенными недостатками. За исключением алкилцианакрилата, большинство мономеров образуют медленно биоразлагаемые или бионеразлагаемые полимеры. Также молекулярная масса полимерного материала не может контролироваться полностью. Остатки в среде полимеризации могут быть токсичны и требовать последующей очистки коллоидной системы. Часто в процессе полимеризации молекулы мономера могут взаимодействовать с молекулами лекарственного вещества, что приводит к их инактивации или деструкции [3].

Известна система доставки лекарственных веществ на основе наноалмаза с размерами частиц 5 нм, включающая адсорбированный антибиотик доксорубицин и гидратированные молекулы воды [4].

Известна система доставки лекарственных веществ на основе наноалмаза, включающая частицы карбоксилированного наноалмаза с размерами частиц 3-5 нм, на поверхность которого в ходе ряда химических превращений прививаются -CH₂O(CH₂)₆NH₂ группы, с которыми ковалентно связывается противоопухолевый дитерпеноид паклитаксел [5].

Известны модифицированные фтором частицы наноалмаза с размером 2-10 нм и содержанием фтора до 5% ат. [6]. Полученный модифицированный фтором наноалмаз использовали для получения конъюгатов с такими веществами, как алкиллитиевые соединения, диамины, аминокислоты. Указанные конъюгаты могут найти применение в качестве связующих в полимерных композициях, абразивах и покрытиях, адсорбентах, биосенсорах и наноэлектромеханических системах.

Известен способ повышения эффективности лекарственных веществ путем химического (ковалентного) связывания молекул лекарственных веществ с частицами наноалмаза с размером менее 10 нм за счет атомов фтора и/или гидроксильных групп на их поверхности [7].

Присутствие в органическом веществе атомов фтора повышает его токсичность, в частности, такое вещество может поражать нервную систему, легкие и печень. Даже перфторированные органические вещества, несмотря на химическую инертность, изменяют показатели микросомальной системы биотрансформации ксенобиотиков (чужеродных веществ) в печени [8]. Так, показано, что ковалентное связывание атомов фтора с молекулой фуллерена C₆₀, являющегося ближайшим углеродным наноструктурным аналогом наноалмаза, повышает его общую токсичность в 2,4-5 раз [9].

Поэтому получение частиц наноалмаза, не содержащего атомов фтора, которые могли бы использоваться в качестве систем доставки биологически активных веществ в организм, представляет собой актуальную и практически значимую для медицины и фармацевтической промышленности задачу.

Известен способ повышения эффективности лекарственных веществ путем химического (ковалентного) связывания молекул лекарственных веществ с частицами наноалмаза с размером менее 10 нм за счет амино- или ацилхлоридных групп на их поверхности [10].

Известны частицы наноалмаза, модифицированные хлором, в котором содержание хлора составляет до 12% ат., с размером частиц в суспензии 70 нм через месяц после синтеза и 180 нм - через 9 месяцев после синтеза, соответственно [11]. Эти частицы имеют большие размеры, чем оптимально необходимы для медицинских целей. При этом в работе не достигнуто максимальное значение содержания атомов хлора на поверхности наноалмаза, что не позволит в дальнейшем получить предельное содержание лекарственного вещества на поверхности наноалмаза, что заведомо снижает эффективность системы доставки. Хотя авторы работы [11] указывают, что анализ образцов наноалмаза, модифицированного хлором, методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) подтверждает связывание атомов хлора с поверхностными атомами углерода, однако подтверждающие данные не приводятся. Более того, анализ самими авторами приведенных в статье ИК-спектров не обнаруживает наличие таких химических связей. Это позволяет предположить, что атомы хлора на поверхности наноалмаза связаны адсорбционно, а не ковалентно. Следовательно, лекарственные вещества с такой поверхностью наноалмаза не будут связываться достаточно прочной химической связью и система доставки становится неэффективной.

Также известен способ получения таких модифицированных хлором частиц наноалмаза и его вариант, заключающиеся в следующем [11]. Хлорирование частиц наноалмаза проводят способом жидкофазного хлорирования восстановленного наноалмаза в насыщенном хлором растворе CCl₄ при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 72 ч при облучении светом в видимом диапазоне. После хлорирования частицы наноалмаза отмывают сухим CCl₄, центрифугируют и высушивают осадок в течение 5-6 ч при давлении 13-26 Па и температуре 70-80°C.

Вариант этого способа получения частиц наноалмаза, модифицированного хлором, заключается в том, что хлорирование проводят в плазме CCl₄ в течение 6 ч [11].

Авторами работы [11] сделан вывод, что полученная ими связь атомов хлора с наноалмазом менее стабильна на воздухе (из-за предполагаемой адсорбционной природы связи), чем связь наноалмаза с атомами фтора. При этом возможное количество связанных с поверхностью наноалмаза атомов фтора превышает количество атомов хлора, что делает хлорированные частицы наноалмаза менее благоприятными для проведения дальнейших реакций ковалентного связывания химических соединений по сравнению с фторированными частицами наноалмаза.

Таким образом, поставленная задача получения не содержащих фтора частиц наноалмаза, способных эффективно ковалентно связывать различные биологически активные, в том числе лекарственные, вещества, до настоящего времени решена лишь частично. Более того, наличие ковалентно связанных с поверхностью наноалмаза атомов хлора при их дальнейшей полной замене на молекулы биологически активных веществ позволяет получить перспективные системы доставки биологически активных веществ в организм, не содержащих на своей поверхности атомов галогенов, и, таким образом, избежать неконтролируемое повышение токсических свойств. Это требование является чрезвычайно важным для любых лекарственных средств и изделий медицинского назначения, применяемых в медицине и фармацевтической промышленности.

В соответствии с изобретением описывается система доставки биологически активных веществ в организм, представляющая собой ультрадисперсный порошок (Фиг.1) наноалмаза серого цвета с размером частиц 2-10 нм (Фиг.2), поверхность которых модифицирована хлором при содержании хлора до 14% ат. (Фиг.3). Распределение размеров агрегатов в заявляемой системе доставки в водной суспензии составляет 40-70 нм (Фиг.4).

На Фиг.1 отчетливо видно наличие у заявляемой системы доставки ультрадисперсной структуры из частиц с размером, меньшим разрешающей способности использованного прибора (от 20 нм).

Микрофотографии получены с использованием автоэмиссионного сканирующего электронного микроскопа сверхвысокого разрешения Zeiss Ultra Plus (Carl Zeiss, Германия). Условия съемки приведены на микрофотографии.

На Фиг.2 видно, что заявляемая система доставки биологически активных веществ имеет распределение размеров частиц 2-10 нм.

Микрофотография получена с использованием просвечивающего электронного микроскопа Jeol 1011 (JEOL, Япония).

На Фиг.3 приведены спектры РФЭС заявляемой системы доставки биологически активных веществ. Данные спектры определяют природу, энергетическое состояние и количество поверхностных атомов частиц наноалмаза.

Исследование поверхности заявляемой системы доставки биологически активных веществ проводили на приборе LAS-3000 (Riber, Франция), оснащенном полусферическим анализатором ОРХ-150. Для возбуждения фотоэлектронов использовали немонохроматизированное рентгеновское излучение алюминиевого анода (AlK_α=1486,6 эВ) при напряжении на трубке 12 кВ и токе эмиссии 20 мА. Калибровку фотоэлектронных пиков проводили по линии углерода С 1s с энергией связи (E_св) 285 эВ. Вакуум в рабочей камере составлял 6,7·10^-8 Па. Для получения высокого вакуума был использован ионный насос.

Элементный состав поверхности системы доставки биологически активных веществ по данным РФЭС приведен в Таблице 1.

Таблица 1 Элементный состав и энергии связи поверхностных атомов заявляемой системы доставки биологически активных веществ Наименование характеристики Химические элементы C O N Cl Атомные %, 76,7-91,2 5,0-7,1 1,8-2,2 2-14 Энергии связи, 285,3±0,5 530,7±0,5 399,5±0,5 200,3±0,5 эВ     408,7±0,5  

На Фиг.4. приведена кривая распределения размеров частиц в водной суспензии заявляемой системы доставки биологически активных веществ, размеры агрегатов которой составляют 40-70 нм.

Измерение распределения размера частиц в суспензии заявляемой системы доставки проводили методом динамического лазерного светорассеяния на приборе ZetaSizer (Malvern Instruments, США).

На Фиг.5а приведен ИК-спектр заявляемой системы доставки биологически активных веществ с содержанием хлора на поверхности 14% ат. На спектре присутствуют: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Данный спектр показывает, что на поверхности заявляемой системы доставки присутствуют ковалентно связанные атомы хлора, характеристические валентные частоты которых находятся в области 650-850 см^-1 [12]. На Фиг.5б приведен ИК-спектр заявляемой системы доставки биологически активных веществ с минимальным содержанием хлора на своей поверхности (0,1% ат). На спектре присутствуют: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, две широкие полосы с максимумом при 1136 и 621 см^-1, две полосы средней интенсивности при 2929, 2892 см^-1 и слабый сигнал при 1331 см^-1. При такой низкой концентрации хлора на поверхности заявляемой системы доставки биологически активных веществ он не обнаруживается на ИК-спектре в области 650-850 см^-1.

ИК-спектры регистрировали на приборе FTIRS IR200 Thermonicolet (Thermo Scientific, США). Разрешение 2 см^-1, количество сканов 64. Для анализа навески образцов смешивали с порошком KBr и прессовали в таблетку.

Поскольку полученная система не содержит опасного для организма человека и животного фтора и его соединений, которые остаются после осуществления реакций связывания биологически активных веществ с поверхностью наноалмаза, она может эффективно использоваться для доставки биологически активных соединений, в том числе лекарственных веществ, в организм человека.

Изобретением является также заявляемый способ получения системы доставки биологически активных веществ, схема которого приведена на Фиг.6.

Заявляемый способ получения системы доставки биологически активных веществ в организм заключается в том, что отжиг частиц наноалмаза осуществляют при температуре от 500 до 1200°C в токе газообразного водорода с последующим хлорированием полученных отожженных частиц наноалмаза молекулярным хлором, растворенным в CCl₄, при воздействии видимого света и температуре от 50 до 70°C. Отжиг проводят со скоростью газообразного водорода от 2 до 3 л/ч. Хлорирование осуществляют преимущественно от 36 до 60 ч при концентрации молекулярного хлора в CCl₄ от 3 до 5% масс. с последующим центрифугированием, промывкой CCl₄ и сушкой.

Более подробно способ заключается в том, что отжиг наноалмаза проводят в токе газообразного водорода со скоростью 2-3 л/ч при температуре от 500 до 1200°C в течение от 1 до 8 ч. Затем отожженные частицы наноалмаза подвергают жидкофазному хлорированию молекулярным хлором. С этой целью хлор, получаемый в процессе реакции между K₂Cr₂O₇ (или KMnO₄) и соляной кислотой, растворяют в CCl₄ до 3-5% масс. Реакцию хлорирования проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 36-60 ч и температуре 50-70°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью выше 6000 об/мин, промывают CCl₄, повторяют процесс 3-5 раз и высушивают под вакуумом до постоянного веса.

На основе полученной системы доставки готовят конъюгаты с биологически активными веществами, в том числе лекарственными веществами, из различных фармакологических групп: алкилирующих веществ, в частности, содержащих этилендиамины, вспомогательных веществ, реактивов и полупродуктов, а также аминокислот.

В случае диаминов полученные частицы заявляемой системы доставки суспендируют в диметилсульфоксиде (CH₃)₂SO, добавляют этилендиамин, прикапывают несколько капель пиридина и выдерживают при температуре 120°C в течение 24 ч [Фиг.7]. Затем полученный конъюгат наноалмаза с этилендиамином центрифугируют со скоростью выше 6000 об/мин, многократно промывают водой и ацетоном и высушивают под вакуумом до постоянного веса.

Полученный конъюгат используют для доставки этилендиамина в организм. Для доказательства решения поставленной задачи при получении системы доставки биологически активных веществ в организм после стадии отжига наноалмаза на него была нанесена тритиевая метка методом термической активации тритием [13]. После чего, по заявляемому способу получают систему доставки биологически активных веществ, имеющую на своей поверхности радиоактивную метку. Далее, по вышеописанному способу получают конъюгат системы доставки с этилендиамином. Полученный конъюгат с радиоактивной меткой вводят в организм крысы внутрибрюшинно. Производят забой животного, извлечение органов, их гомогенизацию и измерение радиоактивности полученного гомогената на жидкостном сцинтилляционном спектрометре.

В случае аминокислот, на примере глицина, получают его конъюгат с системой доставки по следующей схеме (Фиг.8). Для этого полученные частицы системы доставки растворяют в полярном водно-органическом растворителе или в воде. К полученной суспензии добавляют глицин в виде аминоуксусной кислоты NH₂CH₂COOH с добавлением третичного амина. В качестве органического растворителя предпочтительно использовать те, в которых растворяется глицин, например, пиридин или низшие алифатические спирты. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком (50 Вт) в течение 5-60 мин и выдерживают при постоянном перемешивании и температуре 50-80°C в течение 12-48 ч. Полученный продукт центрифугируют со скоростью 6000 об/мин, промывают этанолом и осадок высушивают под вакуумом при 70°C в течение всей ночи.

Полученный конъюгат используют для доставки глицина в организм. С этой целью используют электронно-микроскопическое изучение взаимодействия полученного конъюгата с культурами клеток методами клеточной биологии.

Краткое описание графических материалов.

Фиг.1. Микрофотографии ультрадисперсной структуры системы доставки биологически активных веществ, полученные методом сканирующей электронной микроскопии, а - увеличение в 23,83 тыс. раз; б - увеличение в 8,57 тыс.раз.

Фиг.2. Микрофотография частиц системы доставки биологически активных веществ, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии.

Фиг.3. C 1s, O 1s, N 1s, Cl 2p спектры РФЭС поверхности частиц системы доставки биологически активных веществ

Фиг.4. Распределение по размеру частиц системы доставки биологически активных веществ в водной суспензии, полученное методом динамического лазерного светорассеяния.

Фиг.5. ИК-спектр системы доставки биологически активных веществ.

Фиг.6. Схема получения системы доставки биологически активных веществ.

Фиг.7. Схема получения конъюгата наноалмаза с этилендиамином.

Фиг.8. Схема получения конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.9. КР-спектр конъюгата наноалмаза с этилендиамином.

Фиг.10. Биораспределение конъюгата наноалмаза с этилендиамином в организме крысы.

Фиг.11. ИК-спектр конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.12. Микрофотография конъюгата наноалмаза с глицином, полученная методом просвечивающей электронной микроскопии.

Фиг.13. Микрофотография проникновения конъюгата наноалмаза с глицином в клетку лимфобласта MOLT-4. а, б - выделенные области проникновения частиц в клетку.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

200 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,5 л/ч при температуре 800°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (4,7% масс.) в 40 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 8000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 4 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 181 мг (90,5%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 14% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 50 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 78,1, O - 6,0, N - 1,9, Cl - 14% ат., соответственно.

Пример 2

250 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,4 л/ч при температуре 800°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (4,8% масс.) в 50 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 36 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 8000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 3 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 198 мг (79,1%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 4,2% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 67 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 87,9, O - 5,9, N - 2,0, Cl - 4,2% ат., соответственно.

Пример 3

400 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,7 л/ч при температуре 800°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (3,5% масс.) в 80 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 60 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 7000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 3 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 339,6 мг (84,9%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 7,8% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 56 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 84,1, O - 6,3, N - 1,8, Cl - 7,8% ат., соответственно.

Пример 4

200 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,0 л/ч при температуре 800°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (5,0% масс.) в 40 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 50°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 6000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 5 раз и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 149,2 мг (74,6%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 3,0% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 70 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 87,8, O - 7,1, N - 2,1, Cl - 3,0% ат., соответственно.

Пример 5

200 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,9 л/ч при температуре 800°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (5,0% масс.) в 40 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 70°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 9000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 3 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 144,6 мг (72,3%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 9,4% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 61 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 83,3, O - 5,5, N - 1,8, Cl - 9,4% ат., соответственно.

Пример 6

500 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,5 л/ч при температуре 500°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (5,0% масс.) в 100 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 6000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 5 раз и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 433,5 мг (86,7%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 5,2% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 63 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 86,5, O - 6,1, N - 2,2, Cl - 5,2% ат., соответственно.

Пример 7

500 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,5 л/ч при температуре 1200°C в течение 5 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (3,3% масс.) в 100 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 7000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 4 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 370,5 мг (74,1%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 8,8% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 58 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 83,9, O - 5,5, N - 1,8, Cl - 8,8% ат., соответственно.

Пример 8

200 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,0 л/ч при температуре 800°C в течение 1 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (4,6% масс.) в 40 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 9000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 3 раза и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 180 мг (90,0%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 3,5% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 70 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 87,5, O - 6,9, N - 2,1, Cl - 3,5% ат., соответственно.

Пример 9

300 мг навески наноалмаза отжигают в токе газообразного водорода со скоростью 2,0 л/ч при температуре 800°C в течение 8 ч. Отожженные частицы наноалмаза жидкофазно хлорируют молекулярным хлором (4,6% масс.) в 60 мл CCl₄ при воздействии видимым светом в течение 48 ч и температуре 60°C. Затем суспензию центрифугируют со скоростью 6000 об/мин и промывают сухим CCl₄. Повторяют процесс 5 раз и полученный осадок высушивают под вакуумом до постоянного веса. Выход целевого продукта 256,2 мг (85,4%).

Полученный продукт представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, содержащий на своей поверхности 13,2% ат. хлора, с размерами агрегатов в водной суспензии 55 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3430 см^-1, широкая полоса с максимумом 1262 см^-1, пять полос средней интенсивности при 2929, 2892, 1331, 846, 680 см^-1 и слабый сигнал при 743 см^-1. Элементный состав поверхности включает C - 79,8, O - 5,2, N - 1,8, Cl - 13,2% ат., соответственно.

Характеристики системы доставки биологически активных веществ и параметры способа ее получения для каждого примера сведены в Таблице 2.

Таблица 2 Сводная таблица характеристик заявляемой системы доставки биологически активных веществ и условий способа ее получения Параметры процесса № примера/условия процесса 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Время отжига (1-8), ч 5 5 5 5 5 5 5 1 8 Температура отжига (500-1200), °C 800 800 800 800 800 500 1200 800 800 Время хлорирования (36-60), ч 48 36 60 48 48 48 48 48 48 Температура хлорирования (50-70), °C 60 60 60 50 70 60 60 60 60 Выход продукта, % 90,5 79,1 84,9 74,6 72,3 86,7 74,1 90,0 85,4   Характеристики системы доставки Содержание хлора, % ат. 14 4,2 7,8 3,0 9,4 5,2 8,8 3,5 13,2 Размер частиц в суспензии, нм 50 67 56 70 61 63 58 70 55

Пример 10

500 мг заявляемой системы доставки, полученной по способу, описанному в примере 1, суспендируют в 50 мл растворителя диметилсульфоксида, добавляют 2,5 мл этилендиамина и прикапывают 2 капли пиридина и выдерживают при температуре 120°C в течение 24 ч. Затем полученный конъюгат наноалмаза с этилендиамином центрифугируют со скоростью 6000 об/мин, 5 раз промывают водой и ацетоном и высушивают под вакуумом до постоянного веса.

Полученный конъюгат представляет собой серый ультрадисперсный порошок с размером частиц 2-10 нм, характеризующийся спектром комбинационного рассеяния света, который обладает сильной люминесценцией, превышающий интенсивность КР-спектра наноалмаза более чем в 50 раз (Фиг.9). Элементный состав поверхности полученного конъюгата включает: C - 86,4, O - 8,9, N - 4,7% ат., соответственно.

Полученный конъюгат использовали для доставки этилендиамина в организм.

Для решения этой задачи при получении системы доставки биологически активных веществ после отжига наноалмаза на него была нанесена тритиевая метка методом термической активации тритием [13]. После обработки отожженного наноалмаза атомами трития его выдерживали двое суток в воде, центрифугировали, отделяли супернатант и добавляли новую порцию растворителя. В результате был получен препарат отожженного наноалмаза с удельной радиоактивностью 90 ГБк/г. После чего, по заявляемому способу получают систему доставки биологически активных веществ, имеющую на своей поверхности радиоактивную метку. Далее, по вышеописанному способу получают конъюгат системы доставки с этилендиамином. Полученный конъюгат с радиоактивной меткой вводят в организм крысы (белая беспородная, самец массой 400 г) в виде водной суспензии внутрибрюшинно. Через 4 ч производят забой животного, изъятие и взвешивание органов и тканей, их гомогенизацию в водных растворах NaOH и H₂O₂ и измерение радиоактивности полученного гомогената на жидкостном сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1215 (Финляндия) (Табл.3, Фиг.10).

Таблица 3 Список изъятых органов крысы для изучения распределения конъюгата наноалмаза с этилендиамином № проб Вид органа или ткани Вес, г Кол-во NaOH, мл Кол-во H₂O₂, мл 1 Печень 0,42 2 0,05 2 Легкие 0,13 1,5 - 3 Селезенка 0,26 2 0,15 4 Почки 0,22 1,5 0,05 5 Толстая кишка 0,17 2 - 6 Тонкая кишка 0,12 1 - 7 Сердце 0,27 2,05 0,05 8 Желудок 0,08 1,5 - 9 Мышцы 0,1 1,5 - 10 Кровь 0,27 3 0,25 12 Фронтальная кора 0,18 1,5 - 13 Ствол мозга 0,31 2 0,05 15 Мозжечок 0,32 2,5 0,05 16 Надпочечники 0,08 1 -

Из Фиг.10 следует, что конъюгат наноалмаза с этилендиамином распределяется практически во всех жизненно важных органах, при этом минует гематоэнцефалический барьер, в различных количественных соотношениях.

Пример 11

Из 200 мг заявляемой системы доставки, полученной по способу, описанному в примере 1, получают суспензию, используя 40 мл водно-спиртовой смеси (вода : метанол = 1:1), в которую вносят 300 мг глицина в виде свободной аминокислоты NH₂CH₂COOH с добавлением 1 мл триэтиламина. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком (50 Вт) в течение 40 мин и выдерживают при постоянном перемешивании и температуре 65°C в течение 30 ч. Полученный продукт центрифугируют со скоростью 6000 об/мин, промывают этанолом и высушивают под вакуумом при 70°C в течение всей ночи. Остаточная влажность продукта составляет 2,2%. Выход целевого продукта 186 мг (93%).

Полученный продукт представляет собой темно-серый с синеватым оттенком ультрадисперсный порошок с размерами первичных частиц 2-10 нм, имеющих оболочку поверхностного слоя до 1 нм (Фиг.11), и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса с максимумом 3400 см^-1, сильный сигнал при частоте 1621 см^-1, шесть полос средней интенсивности при 2924, 2881, 1383, 1306, 1212 и 1154 см^-1 и слабый характеристический сигнал при 504 см^-1 (Фиг.12). Элементный состав поверхности конъюгата включает: C - 91,5, O - 6,0, N - 2,5% ат., соответственно.

Полученный конъюгат использовали для доставки глицина в организм. Проникновение конъюгата наноалмаза с глицином в организм подтверждается электронно-микроскопическими исследованиями его взаимодействия с культурой клеток лимфобластов MOLT-4. На Фиг.13 видно, что под действием конъюгата происходят инвагинации клеточной мембраны клетки лимфобласта и дальнейшее его проникновением в цитозоль.

Список литературы

1. Пат РФ RU 2391966, C1 20.06.2010 г.

2. Нанолекарства. Концепции доставки лекарств в нанонауке: пер. с англ. / под ред. Алфа Лампрехта, М.: Научный Мир, 2010. С.10-20.

3. J.L. Grangier, М. Puygrenier, J.C. Gautier, P. Couvreur. Nanoparticles as carriers for growth hormone releasing factors // J. Control. Rel. 1991. V.15. P.3-13.

4. A. Adnant, R. Lam, H. Chen et al. Atomistic Simulation and Measurement of pH Dependent Cancer Therapeutic Interactions with Nanodiamond Carrier // Mol. Pharmaceutics. 2001. V.8. №2. P.368-374.

5. K.-K. Liy, W.-W. Zheng, C.-C. Wang et al. Covalent linkage of nanodiamond-paclitaxel for drug delivery and cancer therapy // Nanotechnology. 2010. V.21. №315106. 14 pp.

6. US Pat 2005/0158549 A1, 21.07.2005.

7. US Pat 2010/0129457 A1, 27.05.2010.

8. Российская энциклопедия по охране труда. В 3 т. 2-е изд., перераб. и доп. Т.3. - М.: изд. НЦ ЭНАС. 2007. С.181.

9. Н.Н. Каркищенко. Наноинженерные лекарства: новые биомедицинские инициативы в фармакологии // Биомедицина. 2009. №2. С.5-26.

10. US Pat 2009/0226495 A1, 10.09.2009.

11. G.V. Lisichkin, I.I. Kulakova, Y.A. Gerasimov et al. Halogenation of detonation-synthesised nanodiamond surfaces. Mendeleev Commun. 2009. V.19. P.309-310.

12. А. Смит. Прикладная ИК-спектроскопия. Пер. с англ. - М.: Мир, 1982. С.307.

13. Г.А. Бадун. Меченные тритием соединения / Метод. руководство. - М.: МГУ, 2008. С.36-37.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к системе доставки биологически активных веществ в организм. Система доставки биологически активных веществ в организм, представляющая собой наноалмаз с размером частиц 2-10 нм, поверхность которых модифицирована хлором при содержании хлора до 14% ат. Способ получения системы доставки биологически активных веществ в организм, представляющей собой наноалмаз с размером частиц 2-10 нм, поверхность которых модифицирована хлором при содержании хлора до 14% ат, заключающийся в том, что осуществляют отжиг частиц наноалмаза при температуре 500-1200°C в токе газообразного водорода с последующим жидкофазным хлорированием полученных частиц молекулярным хлором, растворенным в четыреххлористом углероде, при фотохимическом воздействии видимого света и нагревании, после чего суспензию центрифугируют, промывают и сушат, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить систему доставки биологически активных веществ в организм, представляющую собой частицы наноалмаза, не содержащих фтора, способных эффективно связывать различные биологические активные и лекарственные вещества. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл., 11 пр.

1. Система доставки биологически активных веществ в организм, представляющая собой наноалмаз с размером частиц 2-10 нм, поверхность которых модифицирована хлором при содержании хлора до 14% ат.

2. Способ получения системы доставки биологически активных веществ в организм по п.1, характеризующийся тем, что осуществляют отжиг частиц наноалмаза при температуре 500-1200°C в токе газообразного водорода с последующим жидкофазным хлорированием полученных частиц молекулярным хлором, растворенным в четыреххлористом углероде, при фотохимическом воздействии видимого света и температуре от 50 до 70°C, после чего суспензию центрифугируют, промывают и сушат.

3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что отжиг исходного наноалмаза проводят со скоростью газообразного водорода от 2 до 3 л/ч в течение 1-8 ч.

4. Способ по п.2, характеризующийся тем, что хлорирование проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 36 до 60 ч и температуре 50-70°C.

5. Способ по п.2, характеризующийся тем, что концентрация молекулярного хлора в четыреххлористом углероде от 3 до 5% масс.

6. Способ по п. 2, характеризуется тем, что центрифугирование проводят со скоростью выше 6000 об/мин.

7. Способ по п. 2, характеризуется тем, что процесс центрифугирования и промывки проводят 3-5 раз.

8. Способ по п.2, характеризуется тем, что сушку осуществляют под вакуумом до постоянного веса.