КОНЪЮГАТ НАНОАЛМАЗА С ГЛИЦИНОМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/195 A61K33/44 B82B1/00 B82Y5/00 

Настоящее изобретение относится к области фармации и медицины, конкретно, к фармацевтической нанотехнологии и касается конъюгата наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, а также способа его получения.

Известен конъюгат наноалмаза с глицином, состоящий из частиц с размером 2-10 нм, применяемый в качестве связующего компонента в полимерных композициях [1, 2]. Особенностью данного конъюгата является наличие атомов фтора на поверхности наноалмаза. Содержание атомов фтора на поверхности наноалмаза составляет менее 1% ат. Однако на практике содержание фтора может достигать 14% ат и более.

Описан также способ получения конъюгата наноалмаза с глицином, используемый в качестве связующего компонента в эпоксидных полимерных композитах, применяемых для антикоррозионных покрытий, который заключается в следующем [2]. Навеску наноалмаза помещают в реактор в постоянном токе гелия и отжигают при температуре 150-470°C в течение 3-4 ч. Далее проводят фторирование образцов наноалмаза при температуре 50-500°C в течение 1-24 ч контактированием со смесью газообразных фтора и водорода. Для получения конъюгата наноалмаза с глицином фторированный наноалмаз обрабатывают ультразвуком в o-дихлорбензоле в течение 20-30 мин, добавляют гидрохлорид этилового эфира глицина (NH₂CH₂COOCH₂CH₃·HCl) и несколько капель пиридина. Полученную смесь перемешивают при температуре 130-140°C в течение 8-12 ч. Образовавшийся конъюгат фильтруют, промывают этанолом и сушат под вакуумом при 70°C.

Конъюгаты модифицированного фтором наноалмаза с глицином нежелательно использовать в медицинских целях, так как известно, что присутствие в органическом веществе фтора и его производных повышает его токсичность и может изменять показатели микросомальной системы биотрансформации ксенобиотиков в печени [3]. Кроме того, фтор и его соединения способны накапливаться в различных объектах окружающей среды и присутствовать в них в различных количествах [4].

В соответствии с изобретением описывается конъюгат наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, представляющий собой частицы наноалмаза, модифицированные глицином, с размером частиц 2-10 нм, содержащие до 21±3% мас. глицина, который входит в состав поверхностной оболочки конъюгата толщиной до 1 нм.

Количество глицина в конъюгате наноалмаза с глицином определяют следующим образом. Готовят смеси наноалмаза с разным содержанием глицина. Берут навески каждой смеси и определяемого образца равной массы. Регистрируют их ИК-спектры, выбирают на них наиболее интенсивные характеристические сигналы, которые соотносят с полосами ИК-спектра исходного глицина. Затем строят калибровочные кривые зависимости интенсивности сигнала в ИК-спектре от содержания глицина в навеске. Далее, по интенсивности выбранных характеристических полос исследуемого конъюгата наноалмаза с глицином по калибровочным кривым определяют количественное содержание в нем глицина. По полученным данным определяют среднее значение величины содержания глицина в конъюгате наноалмаза с глицином.

Описывается также способ получения конъюгата наноалмаза с глицином (схема осуществления представлена на Фиг.1) с размером частиц 2-10 нм, содержащие до 21±3% мас. глицина и имеющие поверхностную оболочку толщиной до 1 нм, заключающийся в том, что частицы наноалмаза с размером частиц 2-10 нм, модифицированные хлором, растворяют в полярном растворителе с образованием суспензии, добавляют третичный амин и глицин, полученную смесь обрабатывают ультразвуком с последующими выдерживанием при температуре 50-80°C, центрифугированием, промывкой растворителем и сушкой.

В качестве третичного амина используют триэтиламин, в качестве полярного растворителя используют пиридин, низшие алифатические спирты, водно-спиртовую смесь или воду. Обработку ультразвуком ведут в течение 5-60 мин и выдерживание при температуре 50-80°C осуществляют в течение от 18 до 48 ч.

Поэтому получение конъюгата наноалмаза с глицином, не содержащего атомов фтора, с повышенной дисперсностью, а также снижение уровня экологической и эндоэкологической опасности, упрощение и удешевление способа получения конъюгата наноалмаза с глицином представляют собой актуальную и практически значимую задачу.

Описываемый конъюгат наноалмаза с аминокислотой глицином, не содержащий на своей поверхности атомов фтора, представляет собой ультрадисперсный порошок (Фиг.2) темно-серого цвета или темно-серого цвета с зеленоватым или темно-синим оттенками с размером частиц от 2 до 10 нм (Фиг.3) и размером агрегатов в водной суспензии от 25 до 50 нм (Фиг.4).

На Фиг.2 отчетливо видно наличие у заявляемого конъюгата ультрадисперсной структуры из частиц с размером, меньшим разрешающей способности использованного прибора (от 20 нм).

Микрофотография частиц конъюгата наноалмаза с глицином получена на автоэмиссионном сканирующем электронном микроскопе сверхвысокого разрешения Zeiss Ultra Plus (Carl Zeiss, Германия). Условия съемки приведены на микрофотографии.

На Фиг.3 видно, что распределение по размерам частиц конъюгата наноалмаза с глицином составляет 2-10 нм с оболочкой поверхностного слоя до 1 нм.

Микрофотография частиц конъюгата наноалмаза с глицином получена на просвечивающем электронном микроскопе Jeol 1011 (JEOL, Япония).

На Фиг.4. приведена кривая распределения размеров частиц в суспензии описываемого конъюгата наноалмаза с глицином, из которой следует, что размеры частиц суспензии составляют 25-50 нм. Измерение распределения размера частиц в суспензии конъюгата проводили методом динамического лазерного светорассеяния на приборе ZetaSizer (Malvern Instruments, США). По оси абсцисс отложена логарифмическая шкала размера частиц в нм. По оси ординат - процентное содержание.

На Фиг.5 приведен ИК-спектр описываемого конъюгата. На спектре присутствуют интенсивная широкая полоса с максимумом 3400 см^-1, сильный сигнал при частоте 1621 см^-1, шесть полос средней интенсивности при 2924, 2881, 1383, 1306, 1212 и 1154 см^-1 и слабый характеристический сигнал при 504 см^-1. Спектр имеет максимумы при 1383, 1306, 1212 и 1154 см^-1, соответствующие максимумам исходной аминокислоты глицина, которые из-за образования ковалентной связи с поверхностью наноалмаза сместились в область 1400-1100 см^-1.

ИК-спектры регистрировали на приборе FTIRS IR200 Thermonicolet (Thermo Scientific, США). Разрешение 2 см^-1, количество сканов 64. Для анализа навески образцы смешивали с порошком KBr и прессовали в таблетку.

На Фиг.6 приведены спектры РФЭС описываемого конъюгата наноалмаза с глицином. Применение рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) позволяет установить природу, энергетическое состояние и количество поверхностных атомов частиц наноалмаза, а также определять практически все элементы, кроме водорода и гелия [5].

Исследование поверхности описываемого конъюгата наноалмаза с глицином проводили на приборе LAS-3000 (Riber, Франция), оснащенном полусферическим анализатором ОРХ-150. Для возбуждения фотоэлектронов использовали немонохроматизированное рентгеновское излучение алюминиевого анода (AlK_α=1486,6 эВ) при напряжении на трубке 12 кВ и токе эмиссии 20 мА. Калибровку фотоэлектронных пиков проводили по линии углерода C 1s с энергией связи (Е_св) 285 эВ. Вакуум в рабочей камере составлял 6,7·10^-8 Па. Для получения высокого вакуума был использован ионный насос.

Элементный состав поверхности описываемого конъюгата наноалмаза с глицином по данным РФЭС приведен в Таблице 1.

Таблица 1 Элементный состав и энергии связи поверхностных атомов описываемого конъюгата наноалмаза с глицином Наименование характеристики Химические элементы C O N Атомные %, 77,5-94,5 4-14 1,5-8,5 Энергии связи, эВ 285,2±0,5 530,7±0,5 399,8±0,5

Из Таблицы 1 следует, что описываемый конъюгат наноалмаза с глицином не содержит атомов фтора, а также атомов других галогенов в количестве, превышающем ошибку прибора (0,1% ат.), так как в процессе получения конъюгата наноалмаза с глицином (Фиг.1) все атомы хлора заменяются на молекулы глицина и уходят с поверхности наноалмаза в виде молекул HCl.

Используемые в способе получения модифицированные хлором частицы наноалмаза получают путем отжига наноалмаза в токе газообразного H₂ со скоростью 2-3 л/ч при температуре от 500 до 1200°C в течение 1-8 ч. Затем отожженный наноалмаз подвергают жидкофазному хлорированию молекулярным хлором. С этой целью хлор, получаемый в процессе реакции между K₂Cr₂O₇ (или KMnO₄) и соляной кислотой, растворяют в CCl₄ до 3-5% мас. Реакцию хлорирования проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 36-60 ч при температуре 50-70°C. Затем образец промывают CCl₄, центрифугируют суспензию со скоростью от 6000 об/мин и высушивают под вакуумом до постоянного веса.

Более подробно способ получения конъюгата наноалмаза с глицином заключается в том, что готовят суспензию хлорированного наноалмаза в полярном органическом, водно-органическом растворителе или в воде и вносят в нее глицин в виде аминоуксусной кислоты NH₂CH₂COOH с добавлением третичного амина. В качестве органического растворителя предпочтительно использовать те, в которых растворяется аминокислота глицин, например, пиридин или низшие алифатические спирты. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком (50 Вт) в течение 5-60 мин и выдерживают при постоянном перемешивании при температуре от 50 до 80°C в течение 12-48 ч. Полученный продукт промывают этанолом, центрифугируют и осадок высушивают под вакуумом при 70°C в течение всей ночи.

Таким образом, в заявляемом способе получения конъюгата наноалмаза с глицином опасный, сложный и дорогостоящий процесс газофазного фторирования заменен на доступный, безопасный и существенно более дешевый процесс жидкофазного хлорирования, а дорогостоящее производное глицина - гидрохлорид этилового эфира глицина - заменен существенно более дешевой аминокислотой глицином.

Заявляемый конъюгат наноалмаза с глицином не содержит атомов фтора, дисперсность его частиц в суспензии повышена в 6-12 раз.

Полученный конъюгат наноалмаза с глицином может найти применение в медицине в качестве системы доставки аминокислоты глицина в организм. С этой целью используют электронно-микроскопическое изучение взаимодействия полученного конъюгата с культурами клеток методами клеточной биологии.

Краткое описание графических материалов.

Фиг.1. Схема получения конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.2. Микрофотография описываемого коньюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.3. Микрофотография описываемого конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.4. Распределение размеров частиц описываемого конъюгата наноалмаза с глицином в суспензии.

Фиг.5. ИК-спектр описываемого конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.6. C 1s, O 1s, N 1s спектры РФЭС поверхности описываемого конъюгата наноалмаза с глицином.

Фиг.7. ИК-спектры смесей наноалмаза с глицином для построения калибровочных кривых. I, II, III - спектры смесей с содержанием в них глицина относительно друг друга 1:1,75:2,5, соответственно. В рамках выделены характеристические пики.

Фиг.8. Калибровочные кривые для каждой характеристической полосы ИК-спектра смеси наноалмаза с глицином, а, б, в - калибровочные кривые для полос 1407, 1332 и 504 см^-1 соответственно.

Фиг.9. Микрофотография проникновения конъюгата наноалмаза с глицином в клетку лимфобласта MOLT-4; а, б - выделенные области проникновения частиц в клетку.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример

300 мг исходного наноалмаза отжигают в токе газообразного H₂ со скоростью 3,0 л/ч при температуре 1000°C в течение 6 ч. Затем отожженный наноалмаз подвергают жидкофазному хлорированию молекулярным хлором, растворенном в 40 мл CCl₄ до 6% мас. Cl₂. Реакцию хлорирования проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 60 ч при температуре 60°C. Затем образец промывают CCl₄ с центрифугированием суспензии при 6000 об/мин и высушивают под давлением 0,1 ммрт.ст. до постоянного веса. Затем из хлорированного наноалмаза получают суспензию, используя 40 мл водно-спиртовой смеси (вода : метанол = 1:1), в которую вносят 300 мг глицина в виде свободной аминокислоты (NH₂CH₂COOH) с добавлением 1 мл триэтиламина. Полученную смесь обрабатывают ультразвуком (50 Вт) в течение 60 мин и выдерживают при постоянном перемешивании при температуре при 65°C в течение 30 ч. Полученный продукт промывают большим количеством этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом при 70°C в течение всей ночи. Остаточная влажность продукта составляет 2,2%. Выход целевого продукта 279 мг (93%).

Полученный продукт представляет собой темно-серый с синеватым оттенком ультрадисперсный порошок с размерами первичных частиц 2-10 нм, имеющих оболочку поверхностного слоя до 1 нм и характеризующийся ИК-спектром: интенсивная широкая полоса при 3400 см^-1, сильный сигнал при частоте 1621 см^-1, шесть полос средней интенсивности при 2924, 2881, 1383, 1306, 1212 и 1154 см^-1 и слабый характеристический сигнал при 504 см^-1. Размер частиц в суспензии полученного продукта составил 25 нм. Элементный состав поверхности продукта приведен в Таблице 2.

Таблица 2 Данные РФЭС полученного продукта. Наименование характеристики Химические элементы C O N Атомные %, 80,1±0,1 11,5±0,1 8,4±0,1 Энергии связи, эВ 285,2±0,5 530,7±0,5 399,6±0,5

Для определения массовой доли глицина в полученном конъюгате готовят 3 смеси наноалмаза с глицином с соотношением последнего относительно друг друга 1:1,75:3,5, соответственно. Для каждой смеси берут навеску массой 0,0035 г и тщательно перетирают в ступке с 0,090 г KBr; 0,070 г полученной смеси прессуют в таблетку и снимают ее ИК-спектр (Фиг.7). Характеристические полосы выбирают при 1407, 1332 и 504 см^-1 соответственно и строят для них калибровочные графики (Фиг.8). Интенсивность полос соответствующих характеристических полос на ИК-спектре полученного образца конъюгата наноалмаза с глицином массой 0,0035 г составляет 0,23, 0,22 и 0,10 о.е. соответственно. Из калибровочных кривых а, б, в (Фиг.8) определяют величину содержания глицина в образце, которая составляет 0,00057±8·10^-5 г глицина в образце. Следовательно, массовая доля глицина в навеске образца составляет 21±3% мас.

Обработка суспензии ультразвуком в течение 30-60 мин, выдерживание при температуре 70-80°C в течение 30-48 ч и использование в качестве полярного растворителя пиридина или низших алифатических спиртов приводит к получению конъюгата с аналогичными характеристиками и содержанием глицина в интервале 13-21% мас.

Обработка суспензии ультразвуком в течение 5-30 мин, выдерживание при температуре 50-70°C в течение 12-30 ч и использование в качестве полярного растворителя водно-спиртовой смеси или воды приводит к получению конъюгата с аналогичными характеристиками и содержанием глицина в интервале 2-14% мас.

Полученный конъюгат наноалмаза с глицином используют для доставки глицина в организм. Проникновение конъюгата наноалмаза с глицином в организм подтверждается электронно-микроскопическими исследованиями его взаимодействия с культурой клеток лимфобластов MOLT-4 (Фиг.9) после времени инкубации 8 ч. На Фиг.9 видно, что под действием конъюгата происходят инвагинации клеточной мембраны клетки лимфобласта, которые, постепенно углубляясь, приводят к поглощению конъюгата наноалмаза с глицином клеткой.

Срезы клеток, инкубированных с полученным конъюгатом, получали на ультрамикротоме Leica Ultracut UCT (Leica, Германия). Микрофотографии срезов клеток получали на просвечивающем электронном микроскопе JEM 1230 (JEOL, Япония).

Литература

1. Pat US 2005/0158549 A1, 21.07.2005.

2. Y. Liu, Zh. Gu, J.L. Margrave, V.N. Khabashesku. Functionalization of Nanoscale Diamond Powder: Fluoro-, Alkyl-, Amino-, and Amino Acid-Nanodiamond Derivatives // Chem. Mater. 2004. V.16. P.3924-3930.

3. Российская энциклопедия по охране труда. В 3 т., 2-е изд., перераб. и доп., Т.3. - М.: изд. НЦ ЭНАС. 2007. С.181.

4. Т.И. Шалина, Л.С. Васильева. Общие вопросы токсического действия фтора // Сибирский медицинский журнал. 2009, №5, с.5-9.

5. Электронная и ионная спектроскопия твердых тел / Под ред. Фирменса Л.И. и др. - М.: Мир. - 1981, - с.195-232.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к конъюгату наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм. Конъюгат наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, представляющий собой частицы наноалмаза, модифицированные глицином, с размером частиц 2-10 нм, содержащие до 21±3% мас. глицина, который входит в состав их поверхностной оболочки толщиной до 1 нм. Способ получения конъюгата наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, в котором осуществляют отжиг частиц наноалмаза в токе газообразного водорода с последующим жидкофазным хлорированием полученных частиц молекулярным хлором, растворенным в четыреххлористом углероде, при фотохимическом воздействии видимого света и нагревании, после чего суспензию центрифугируют, промывают и сушат, модифицированные хлором частицы растворяют в полярном растворителе с образованием суспензии, добавляют третичный амин и глицин, полученную смесь обрабатывают ультразвуком в течение 5-60 мин, выдерживают смесь при нагревании в течение от 12 до 48 ч, центрифугируют, промывают и сушат при определенных условиях. Конъюгат, полученный вышеописанным способом, характеризуется тем, что не содержит атомов фтора, с повышенной дисперсностью и с повышенным содержанием глицина. 2 н. и 2 з. п. ф-лы, 11 ил., 2 табл.

1. Конъюгат наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, представляющий собой частицы наноалмаза, модифицированные глицином, с размером частиц 2-10 нм, содержащие до 21±3% мас. глицина, который входит в состав их поверхностной оболочки толщиной до 1 нм.

2. Способ получения конъюгата наноалмаза с глицином для доставки глицина в организм, представляющий собой частицы наноалмаза, модифицированные глицином, с размером частиц 2-10 нм, содержащие до 21±3% мас. глицина, который входит в состав их поверхностной оболочки толщиной до 1 нм, характеризующийся тем, что осуществляют отжиг частиц наноалмаза при температуре 500-1200°C в токе газообразного водорода с последующим жидкофазным хлорированием полученных частиц молекулярным хлором, растворенным в четыреххлористом углероде, при фотохимическом воздействии видимого света и температуре от 50 до 70°C, после чего суспензию центрифугируют, промывают и сушат, модифицированные хлором частицы растворяют в полярном растворителе с образованием суспензии, добавляют третичный амин и глицин, полученную смесь обрабатывают ультразвуком в течение 5-60 мин, выдерживают смесь при 50-80°C в течение от 12 до 48 ч, центрифугируют, промывают и сушат.

3. Способ по п.2, характеризующийся тем, что хлорирование проводят при фотохимическом воздействии видимым светом в течение 36-60 ч и температуре 50-70°C.

4. Способ по п.2 или 3, где в качестве третичного амина используют триэтиламин и в качестве полярного растворителя используют пиридин, низший алифатический спирт, водно-спиртовую смесь или воду.