ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКА YB-1 И ЕГО ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2015 года по МПК A61K38/17 A61K35/28 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний путем интраназального введения белка YB-1 и/или его активных фрагментов и/или их производных.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, которое поражает каждого четвертого человека старше 75 лет. Специфический нейродегенеративный процесс, затрагивающий структуры мозга, ответственные за память, приводит к развитию этого заболевания. Несмотря на огромные финансовые вложения в исследования и симптоматическое лечение БА, она по-прежнему остается тяжелейшим недугом со смертельным исходом.

По прогнозам ВОЗ в связи с увеличением общей продолжительности жизни населения в развитых странах ожидается значительный рост распространенности данного заболевания. До сих пор не существует подходов, которые могли бы предотвратить или существенно замедлить прогрессирование БА. В связи с этим актуальной проблемой является выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе развития БА и поиск эффективных методов ее лечения.

По данным клинико-эпидемиологического исследования репрезентативных групп пожилого населения Москвы, БА страдает 4,5% лиц в возрасте от 60 лет, причем повозрастные показатели заболеваемости растут по мере увеличения возраста обследуемых, достигая 15% в возрасте 80 лет и старше (Гаврилова, 2010). Существующие в настоящее время стратегии терапевтического воздействия представлены следующими основными направлениями: 1) компенсаторная (заместительная) терапия, направленная на преодоление нейротрансмиттерного дефицита; 2) протекторная терапия: применение нейропротекторов и нейротрофических факторов; коррекция нарушений свободно-радикальных процессов и метаболизма кальция; использование средств, уменьшающих синтез бета-амилоида или вызывающих его дезагрегацию, а также хелатирование металлов; 3) иммунотерапия, направленная как на сам бета-амилоид, так и на рецепторы, опосредующие его нейротоксический эффект; 4) использование веществ, уменьшающих гиперфосфорилирование белка тау или снижающих уровень холестерина; 5) противовоспалительная терапия; 6) гормональная терапия; 7) поведенческая терапия, в том числе психофармакотерапия продуктивных психопатологических расстройств и психологическая коррекций (тренинг) когнитивных функций (Бачурин с соавт., 2010).

В настоящее время наиболее часто для лечения БА используют ингибиторы ацетилхолинестеразы, агонисты мускариновых и никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и вещества, усиливающие синтез и накопление ацетилхолина, что позволяет компенсировать недостаточность ацетилхолинергической системы, а также нейропротекторы, к которым относятся блокаторы кальциевых каналов, антагонисты NMDA-рецепторов (мемантин), лазароиды (21-аминостероиды), блокаторы ферментов, стабильные аналоги эндогенных нейротрофинов и факторов роста, пептидергические вещества и препараты на основе мозгоспецифических белков (Гаврилова, 2002). Однако все эти препараты лишь замедляют прогрессию заболевания, которое остается неизлечимым и неминуемо ведет к смерти больного.

Наиболее распространенной является спорадическая форма БА, которая встречается в девять раз чаще, чем наследственно обусловленная. За последние годы предложено более десяти различных теорий этиологии БА. Это заболевание может быть результатом совместного действия различных факторов, приводящих в конечном счете к сходным клиническим и патоморфологическим изменениям. Основу патоморфологической картины БА составляют церебральный амилоидоз интра- и экстрацеллюлярной локализации, внутриклеточные нейрофибриллярные скручивания, снижение плотности нейрональных синапсов в гиппокапме, гибель нейронов, морфологически определяемая как апоптоз и реактивный астроглиоз (Bertoni-Freddari et al., 1996; Su et al., 1994). Эти морфологические изменения образуются в определенной последовательности в разных отделах головного мозга и носят мозаичный характер. Тяжесть когнитивных нарушений при БА соответствует выраженности этим патоморфологическим изменениям.

Изучение животных с удаленными обонятельными луковицами выявило у них целый ряд важных признаков развития нейропатологии, характерных для БА: нарушение пространственной памяти, повышение уровня мозгового β-амилоида и отложение его в виде бляшкоподобных депозитов в коре головного мозга, белом веществе и гиппокампе у морских свинок, имеющих с человеком одинаковую первичную структуру β-амилоида, а также дисфункцию ацетилхолинергической системы, гибель нейронов в структурах, страдающих у больных БА (височной коре, гиппокампе, дорзальном серотонинергическом ядре шва), и нарушение показателей периферического иммунитета, сходных с наблюдаемыми при БА (Бобкова с соавт., 2001, 2004, 2010, Bobkova et al., 2005; Nesterova et al., 2008).

В настоящее время данная модель является одной из наиболее валидных моделей спорадической формы БА. Одним из примеров исследований БА с применением БЭ (бульбэктомированных) животных в качестве модели спорадической формы этого заболевания является изучение действия белка теплового шока (БТШ70) на нейродегенеративный процесс. Различные данные показывают, что БТШ70 может оказывать протекторное действие на состояние пространственной памяти у мышей.

Известно изобретение (WO 2013006076), в котором описано интраназальное введение БТШ70 для лечения нейродегенеративных заболеваний. В изобретении описан способ лечения нейродегенеративных заболеваний, включающий интраназальное введение терапевтически эффективного количества БТШ70 и/или его активного фрагмента и/или его производного.

Учитывая сложность лечения БА, существует необходимость в расширении арсенала действующих средств. Технический результат, на достижение которого направлено настоящее изобретение, заключается в разработке способа лечения нейродегенеративных заболеваний у млекопитающих с применением белка YB-1, и/или его фрагментов, и/или его производных.

Сущность изобретения

Одним из аспектов изобретения является способ лечения нейродегенеративных заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом, включающий интраназальное введение субъекту терапевтически эффективного количества полноразмерного белка YB-1 и/или его активного фрагмента и/или его производного.

Другой аспект изобретения относится к композиции, содержащей полноразмерный белок YB-1, и/или его фрагменты, и/или его производные в форме комбинированного препарата для совместного, раздельного или последовательного введения при лечении нейродегенеративного заболевания. В одном варианте осуществления белок YB-1, используемый в настоящем способе, является полноразмерным белком YB-1_1-324, который имеет аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO:1 и аминокислотную последовательность кролика SEQ ID NO:7.

В другом варианте осуществления используют активные фрагменты YB-11-219, которые имеют аминокислотные последовательности, содержащие аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO:3 и аминокислотную последовательность кролика SEQ ID NO:9.

В другом варианте осуществления используют активные фрагменты YB-152-129, содержащие аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO:5 и аминокислотную последовательность кролика SEQ ID NO:11.

В другом варианте осуществления изобретения используют активный фрагмент белка YB-1_1-219 и/или активный фрагмент белка YB-1_52-129 в комбинации с полноразмерным белком YB-1_1-324.

Другой аспект изобретения состоит в разработке доз препарата, которые могут варьироваться в широких пределах вследствие очень низкой токсичности YB-1 и его фрагментов и зависят от ряда факторов, таких как масса тела пациента, пол и возраст.

В одном варианте осуществления количество белка YB-1 и/или, по меньшей мере, одного активного фрагмента и/или их композицию вводят млекопитающему в соответствии со способом изобретения, в диапазоне 0,2 мкг-1 мг на 1 кг массы тела в день. В другом варианте осуществления количество белка YB-1 и/или, по меньшей мере, один активный фрагмент и/или их композицию вводят в соответствии со способом изобретения, в диапазоне 0,2-100 мкг на 1 кг массы тела в день. Во втором варианте осуществления количество белка YB-1 и/или, по меньшей мере, одного активного фрагмента и/или их композицию вводят в соответствии со способом изобретения, в диапазоне приблизительно 10 мкг-100 мкг на 1 кг массы тела в день. В третьем варианте осуществления количество белка YB-1 и/или, по меньшей мере, одного активного фрагмента и/или их композицию вводят в соответствии со способом изобретения, в диапазоне приблизительно 100 мкг-1 мг на 1 кг массы тела в день.

Другой вариант изобретения относится к суточным дозам препарата, который содержит белок YB-1 и/или, по меньшей мере, один активный его фрагмент и/или их композицию, при этом препарат вводят в виде одной суточной дозы в течение от 3 недель до 5 месяцев.

Другой аспект изобретения относится к композиции, содержащей YB-1 и/или его фрагменты, в состав которой дополнительно входят агенты, способствующие доставке белка в соответствующие отделы мозга.

Следующий аспект изобретения относится к композиции, содержащей YB-1 и/или его фрагменты, в состав которой дополнительно входит, по крайней мере, один терапевтический агент. Примеры таких дополнительных терапевтических агентов включают агенты улучшения памяти, антидепрессанты, транквилизаторы, антипсихотические средства, агенты против расстройства сна, противовоспалительные средства, антиоксидантные вещества, агенты, модулирующие уровень холестерина и антигипертензивные агенты.

Другой аспект изобретения состоит в том, что YB-1 и его фрагменты могут входить в состав одной и той же дозированной лекарственной формы или же вводиться раздельно в составе отдельных препаратов; в этом случае может поставляться набор, содержащий несколько лекарственных форм вместе с инструкцией по их последовательному, совместному или раздельному применению.

Другим аспектом настоящего изобретения является то, что YB-1 и его фрагменты способны оказывать нейропротекторное действие на млекопитающих на разных стадиях развития нейродегенерации альцгеймеровского типа.

Лекарственные средства на основе белка YB-1 и/или его фрагментов могут быть применены при лечении нейродегенеративных заболеваний связанных с ненормальным синтезом белка таких как: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона, старческое слабоумие, лобно-височная деменция, болезнь Крейцтфельда-Якоба, рассеянный склероз, когнитивные нарушения, прионные заболевания.

Перечень чертежей

Фиг.1. YB-1 и его фрагменты, использованные в изобретении, где А) доменное строение YB-1_1-324 и его фрагментов, Б) электрофоретический анализ препаратов YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129.

Фиг.2. Влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на пространственную память мышей, тестируемую в водном лабиринте Морриса, где А - время пребывания мышей в секторах водного лабиринта, Б - число заходов в них. Заштрихованные столбики соответствуют показателям в секторе обучения.

Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р<0,05; ** - р 0,01; *** - р<0,001.

Фиг.3. Влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на уровень β-амилоида в коре головного мозга и гиппокампе бульбэктомированных мышей. По вертикальной оси указан уровень β-амилоида в нг/г ткани. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: *** - р<0,001.

Фиг.4. Влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на морфофункциональное состояние нейронов височной коры головного мозга БЭ мышей, где А - процентная доля нормальных нейронов от общего числа проанализированных клеток; Б, В, и Г - доля нейронов с патологическими проявлениями по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации соответственно; Д -плотность нейронов. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р <0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 (относительно ложнооперированных мышей); + - р<0,05; ++- р<0,01; +++ - р<0,001 (относительно бульбэктомированных мышей).

Фиг.5. Влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на морфофункциональное состояние нейронов полей СА1 и СА2 гиппокампа бульбэктомированных мышей, где А - доля нормальных нейронов от общего числа проанализированных клеток в %; Б, В и Г - доля нейронов с патологическими проявлениями по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации соответственно; Д - плотность нейронов. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р 0,05; ** - р<0,01;*** - р<0,001 (относительно ложнооперированных мышей); + - р<0,05; ++ - р<0,01; +++ - р<0,001 (относительно бульбэктомированных мышей).

Фиг.6. Влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на морфофункциональное состояние нейронов полей СА3 и СА4 гиппокампа бульбэктомированных мышей, где А - доля нормальных нейронов от общего числа проанализированных клеток в %; Б, В и Г - доля нейронов с патологическими проявлениями по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации соответственно; Д - плотность нейронов. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р<0,05; ** - р<0,01;*** - р<0,001 (относительно ложнооперированных мышей); + - р<0,05; ++ - р<0,01; +++ - р<0,001 (относительно бульбэктомированных мышей).

Фиг.7. Проникновение меченого белка YB-1 в структуры мозга мышей после его интраназального введения. СА1 и СА3 - поля гиппокампа, the temporal cortex - височная кора, NRD - дорзальное ядро шва (серотонинергическое ядро). Белые точки - меченый белок YB-1.

Фиг.8. Проникновение меченного белка YB-1 в культивируемые эукариотические клетки HeLa, где А - мазки клеток сразу же после окончания инкубации с белком YB-1. Б - клетки через 4 часа после инкубации с белком. DAPI - окраска на ядерные структуры клеток; контроль - краситель, не коньюгированный с белком.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном наблюдении, что интраназальное введение в течение трех недель рекомбинантного белка YB-1 и/или его фрагментов в нос БЭ мышей, у которых нарушена пространственная память как и у пациентов с БА, приводит к достоверному улучшению памяти.

При поиске новых методов лечения БА было обращено внимание на мультифункциональный Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1 или YBX1). Белок YB-1 (YB-1_1-324, размером 324 а.о.) относится к семейству высококонсервативных белков с доменом холодового шока. Так, например, аминокислотная последовательность YB-1 человека и кролика отличается всего двумя синонимичными аминокислотными заменами (E24D, D293E). Этот ДНК- и РНК-связывающий белок участвует в целом ряде клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и ответ на стрессовые воздействия. (Елисеева и др., 2011).

Связываясь с определенными нуклеотидными последовательностями в промоторах ряда важнейших генов, YB-1 позитивно или негативно влияет на их транскрипцию (Kohno et al., 2003). Кроме того, YB-1 обладает повышенным сродством к участкам ДНК с нарушенной вторичной структурой и способствует процессу репарации ДНК, а ускоряя обмен комплементарных нуклеотидных последовательностей в двойных спиралях ДНК, он, как предполагается, может участвовать в рекомбинации ДНК (Skabkin et al., 2001; Ise et al., 1999). YB-1 участвует в альтернативном сплайсинге предшественников мРНК в ядре (Chansky et al., 2001), упаковывает молекулы мРНК в цитоплазме, определяет их функциональную активность, стабильность, а также локализацию транслирующихся мРНК на актиновом скелете (Skabkin et al., 2004; Davydova et al., 1997; Evdokimova et al., 2001; Evdokimova et al., 2006; Ruzanov et al., 1999).

Показано, что YB-1 играет важную роль в активации пролиферации, поддержания статуса стволовых клеток и дифференцировке нейрональных прогениторов (Fotovati et al., 2011). Кроме того, в условиях окислительного стресса накопление YB-1 в клетках снижает их чувствительность к стрессу и предотвращает преждевременное старение (Hanssen et al., 2011; Lu et al., 2005). Показано также, что YB-1 может секретироваться из клеток по неклассическому пути (Frye et al., 2009) и выступать в качестве лиганда рецептора Notch3, стимулируя клеточное деление (Rauen et al., 2009). Важно отметить, что нейродегенеративные патологии, включая БА, часто сопровождаются потерей нейронов, окислительным стрессом и нарушениями в Notch-сигнальном пути (Abies et al., 2011). Все описанные свойства белка YB-1 демонстрируют его как перспективный объект при поиске средств лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе и БА.

Тем не менее, исследователи, которые изучали участие белка YB-1 в процессах клеточной пролиферации и поддержания статуса нервных клеток, не обсуждали возможности применения белка YB-1 для замедления нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа и не предлагали в своих работах способов снижения нарушений в нервной ткани и в мозговой деятельности млекопитающего путем интраназального (через носовые проходы) введения раствора белка YB-1.

В процессе изучения БЭ животных был обнаружен эффект от интраназального введения белка YB-1. Оказалось, что субхроническое введение полноразмерного белка YB-1_1-324 препятствует развитию нарушения памяти у БЭ животных. Выраженный протекторный эффект был получен также и при введении БЭ животным фрагмента YB-1_1-219. Полученные результаты доказали эффективность применения YB-1 и его фрагмента YB-1_1-219 при развитии нейро дегенеративного процесса альцгеймеровского типа.

Было обнаружено, что интраназально введенный белок YB-1_1-324, который является довольно большим белком 36 кДа, и/или его фрагменты YB-1_1-219 и YB-1_52-129 снижают степень когнитивных нарушений, наблюдаемых у БЭ мышей. В частности, интраназальное введение рекомбинантного белка YB-1 и/или его фрагментов нормализует плотность нейронов в височной коре, что коррелирует с уменьшением содержания р-амилоида, и достоверно улучшает пространственную память.

Способ лечения нейродегенеративных заболеваний у субъекта, нуждающегося в этом, включает интраназальное введение субъекту терапевтически эффективного количества белка YB-1 и/или его активного фрагмента и/или его производного

Основываясь на полученных данных, настоящее изобретение относится к применению полноразмерного белка YB-1_1-324 и/или его фрагментов YB-1_1-219 и/или YB-1_52-129 для лечения нейродегенеративных заболеваний, нейродегенеративных заболеваний ассоциированных с ненормальным синтезом белка и когнитивными расстройствами. К таким болезням относятся, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона, деменция телец Леви, лобно-височная деменция, сосудистая деменция, умеренные когнитивные нарушения, смешанная деменция, болезнь Крейцтфельда-Якоба, гидроцефалия нормального давления, синдром Вернике-Корсакова, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, прионные заболевания, а также различные атаксии.

Белок YB-1, используемый в способах настоящего изобретения, выбирают из группы полноразмерных рекомбинантных белков YB-11.324 человека и кролика, которые имеют аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:7. В другом варианте осуществления используют один, два или более двух активных фрагментов белка YB-1. Фрагменты выбирают из группы белков YB-1_1-219, которые имеют аминокислотные последовательности: человека SEQ ID NO:3, кролика SEQ ID NO:9 и группы белков YB-1_52-129 которые имеют аминокислотные последовательности: человека SEQ ID NO:5, кролика SEQ ID NO:11. Данная группа фрагментов включает, но не ограничивает других вариантов фрагментов имеющих терапевтическую активность. В рамках данного изобретения возможно применение полипептидов, которые являются производными от белка YB-1 и его фрагментов. Их аминокислотные последовательности содержат, по сравнению с белком YB-1 и его фрагментами, дополнительно одну или более аминокислот, делецию, и/или замену. Такие замены и вставки осуществляют при условии, что в результате замен полипептиды обладают терапевтической активностью в отношении нейродегенеративных заболеваний (терапевтическую активность которых можно проверить, например, с использованием любого из способов, описанных в разделе Примеры).

На фиг.1 приведена структура параметры YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129, использованных в изобретении, где А) доменное строение YB-1 и его фрагментов, Б) электрофоретический анализ препаратов YB-1 и его фрагментов.

YB-1 и его фрагменты или их производные могут входить в состав одной и той же дозированной лекарственной формы или же вводиться раздельно в составе отдельных препаратов. В этом случае может поставляться набор, содержащий две или более лекарственные формы в отдельных дозированных формах вместе с инструкцией по их последовательному, совместному или раздельному применению.

Система экспрессии

Для производства рекомбинантного белка или его фрагментов используют известные методы генетической инженерии. Могут быть использованы разные типы экспрессионных систем, например, с использованием известных векторов и систем на основе Е. coli, дрожжей и других систем экспрессии для белков млекопитающих. В качестве примера, включающего, но не ограничивающего другие подходящие системы экспрессии, известные специалистам в данной области, можно использовать известные системы для экспрессии белка YB-KGuryanov, 2012), приведенные в примере 2.

Очистка белка и фрагментов

Методы очистки белка YB-1 и его фрагментов хорошо известны в данной области техники. Например, используют аффинную очистку белка. Один из примеров очистки, который включает, но не ограничивает способы очистки по данному изобретению, приведен в примере 3.

Состав композиции

Как указано выше, фармацевтические композиции по изобретению должны содержать терапевтически эффективное количество белка YB-1 и его фрагментов или производных. Оптимальная терапевтическая концентрация белка YB-1 и его фрагмента или производного в составе фармацевтических композициях по настоящему изобретению будет обязательно зависеть от активности конкретного рекомбинантного белка YB-1 и его фрагментов или их производных, особенностей пациента (веса, возраста) и характера нейродегенеративного заболевания. Кроме того, концентрация белка YB-1 и его фрагментов или их производных будет зависеть от того, в какой стадии используют композицию для профилактики или лечения.

Дозы композиции на основе белка YB-1 и его фрагментов следует выбирать таким образом, чтобы обеспечить оптимальную активность для конкретного заболевания и пациента. Дозы должны быть скорректированы с учетом скорости высвобождения введенного препарата (например, назальный спрей вместо капель). Количество активного соединения, включающего белок YB-1 и его фрагменты, выбирают таким образом, чтобы обеспечить эффективное лечение, предпочтительно с введением препарата один раз в день.

Предпочтительно композицию вводят в течение краткосрочных ежедневных курсов (например, недель или месяцев, например, от 3 недель до 5 месяцев для людей), но лечение может включать в себя долгосрочные курсы (например, не менее 6 месяцев), ежедневного лечения.

В качестве примера, включающего, но не ограничивающего объем изобретения, предпочтительно, чтобы концентрация белка и/или его фрагментов в композиции составляла от 0,2 мкг до 1 мг на кг массы тела в сутки, либо в виде одной дозы либо в виде нескольких разделенных доз в течение дня.

Доля каждого дополнительного компонента в носовой композиция может варьироваться в зависимости от используемых компонентов. Ниже приведены примеры включающие, но не ограничивающие объем изобретения по составу композиции. Например, носитель, входящий в состав композиции, может составлять от 0,1 до 99,9% общей массы или объема композиции.

Количество поверхностно-активного вещества может находиться в диапазоне приблизительно 0,01-10% или выше и предпочтительно примерно 0,05-10,0% по весу от общего объема или массы композиции с учетом возможного раздражения слизистой оболочки носа.

Количество агентов, усиливающих доставку белка или его фрагментов, может составлять 0,1% и более. Предпочтительно, чтобы количество агентов, усиливающих доставку белка или его фрагментов, составляло 0,5-10% от общей массы композиции. Если композиция является жидкой, усиливающий агент может присутствовать в количестве 1-5% вес/объем от общей массы композиции.

Консерванты могут присутствовать в количестве приблизительно 0,002-0,02% от общего веса или объема композиции.

Предпочтительно, чтобы общее количество композиции, вводимой в каждый носовой канал, содержал примерно 0,02-0,5 мл, предпочтительно 0,05-0,3 мл, обычно около 0,09-0,1 мл. Твердая композиция может содержать 1-3, мг на дозу, предпочтительно 4-20 мг.

В дополнение к белку YB-1 и его фрагментам, а также к дополнительным добавкам и/или агентам композиция может содержать терапевтические ингредиенты (или активные вещества). Примеры пригодных дополнительных терапевтических ингредиентов приведены ниже.

Сушка и лиофилизация

Для сохранения биологически активных свойств композиции предпочтительно хранить ее в виде лиофилизированной формы. Лучше смесь из белка и/или его фрагментов лиофилизовать вместе с другими ингредиентами композиции.

Гомогенный раствор, предпочтительно водный, содержащий белок YB-1 и/или его фрагменты или их производное, а также другие ингредиенты, добавки и/или агенты, как обсуждалось выше, готовят и затем подвергают лиофилизации по аналогии с известными способами лиофилизации или сушки. Полученный порошок затем может быть растворен в жидкости непосредственно перед введением. Лиофилизированный препарат может быть использован для выпуска партии назальных капель, геля или спрея. Порошок содержащий белок YB-1 и/или его фрагменты при приготовлении лекарственных форм может быть смешан с дополнительными ингредиентами, добавками и/или агентами как это обсуждалось выше.

Активность или физическая стабильности белка YB-1 и его фрагментов в водных растворах или в лиофилизированных препаратах может быть повышена за счет различных добавок, таких как, например, полиолы (включая сахара, например, сахарозу и Ficoll 70), аминокислоты, а также различные соли.

Например, микрочастицы белка YB-1 и его фрагментов могут быть получены с помощью лиофилизации или сушки раствора, содержащего различные стабилизирующие добавки, описанные выше. Примеры способов сушки и антиагрегации, которые могут быть использованы для создания композиции по изобретению, описаны в международной заявке WO 2013006076.

Введение препарата

Белок YB-1 и его фрагменты или производные, содержащиеся в фармацевтических композициях, предпочтительно вводят интраназально. Такие композиции можно вводить интраназально в виде порошка или спрея, в виде капель в нос, в виде геля или мази. Жидкую форму можно вводить через трубку или катетер, например, с помощью шприца, или с помощью тампона, контактирующего со слизистой оболочкой носовой полости.

Композиции, содержащие белок YB-1 и/или его фрагменты, согласно изобретению могут быть на водной основе (например, включающие физиологический раствор), Композиции могут содержать различные дополнительные ингредиенты, которые улучшают стабильность белка YB-1 и его фрагментов и/или улучшают доставку белка YB-1 и его фрагментов в мозг при введении через носовые ходы. Такие дополнительные ингредиенты хорошо известны в данной области (см. международную заявку WO 2013006076). Примеры дополнительных ингредиентов для повышения интраназальной доставки включают, но не ограничиваются, например, а) агентами для ингибирования агрегации (например, полиэтиленгликоль, декстран, диэтиламиноэтил декстран, и карбоксиметилцеллюлоза), б) заряженно модифицирующими агентами, в) агентами, управляющими величиной рН, г) агентами, модулирующими физиологию эпителия, например, в качестве сосудорасширяющих средств, д) агентами, повышающими селективный перенос, например, через мембрану, и е) агентами, стабилизирующими средства доставки белков. Примеры агентов, способствующих проникновению через мембраны и повышающих эффективность белковых композиций на основе белка YB-1 и/или его фрагментов, включают, например, (I) поверхностно активные вещества (например, Tween 80, Poloxamer 188, полисорбенты); (II) соль или производные солей (например, ненасыщенные CYCL 1C мочевины и транскутол), (III) фосфолипид или добавку жирной кислоты, смешанной с липосомами, (IV) этанол, (V) энамин, (VI) компоненты - доноры N0 (например, S-нитрозо-N-ацетил-DL-пеницилламин, NOR1, NOR4, которые, как правило, вводятся совместно с реагентами, способствующими выделению N0, такие как доклофенак натрия), (VII) длинноцепочечные амфипатические молекулы (например, деацилметилсульфоксид, лаурилсульфат натрия, олеиновая кислота), (VIII) короткие гидрофобные усилители проникновения, (IX) салицилат натрия или производные салициловой кислоты (например, ацетил-салициловая кислота, холинсалицилат, салициламид и т.д.), (X) глицериновый эфир ацетоуксусной кислоты, (XI) производные циклодекстрина или бета-циклодекстрина, (XII) средние жирные кислоты, в том числе моно- и диглицериды (например, натрия капрат - экстракт кокосового масла, капмул), (XIII) хелатирующий агент (например, лимонная кислота, салицилаты, (XIV) аминокислоты или их соли (например, моноаминокарбоновые кислоты, такие как глицин, аланин, фенилаланин, пролин, гидроксипролин и т.д.; гидроксиаминокислоты, такие как серин; аминокислоты, такие как аспарагиновая и глутаминовая кислоты, и т.д., и основные аминокислоты, такие как лизин и т.п., включая их соли щелочных и щелочноземельных металлов, (XV) N-ацетиламиновая кислота или ее соли; (XVI) фермент деструкции к выбранному компоненту мембраны, (XVII) ингибитор синтеза жирных кислот, (XVIII) ингибитор синтеза холестерина, (XIX) катионные полимеры или любая их комбинация. Агент, усиливающий проникновение через мембрану, также может быть выбран из коротких гидрофильных молекул, в том числе, диметилсульфоксид (ДМСО), диметилформамид, этанол, пропиленгликоль и 2-пирролидоны. Дополнительные усилители проникновения через мембраны включают эмульгаторы (например, олеилфосфат натрия, лаурилфосфат натрия, лаурилсульфат натрия, сульфат миристилсульфат, полиоксиэтиленалкиловые эфиры и др.) капроновая, молочная, яблочная и лимонная кислоты и их соли, пирролидонекарбоксильные кислоты, эфиры алкилпирролидонекарбоксильные кислоты, N-алкилпирролидоны, пролинацильные сложные эфиры и т.п.; сложные эфиры глицерина и ацетоуксусной кислоты (например, глицерил-1,3-диацетоацетат или 1,2-изопропилиденглицерин-3-ацетоацетат) и триглицерид (например, амилодекстрин, Эстарам 299, Миглиоль 810); циклодекстрины и производные бета-циклодекстрина (например, 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин и гептакис (2,6-ди-О-метил-β-циклодекстрин), которые могут быть конъюгированы с YB-1 и в дальнейшем составляться по выбору на масляной основе; и N-ацетиламиновые кислоты (N-ацетиламин, N-ацетилфениламин, N-ацетилсерин, N-ацетилглицин, N-ацетилсерин, N-ацетилглютаминовая кислота, N-ацетилпролин, N-ацетилгидроксипролин и т.д.) и их соли (соли щелочных и щелочноземельных металлов), а также другие агенты, способствующие проникновению, которые являются физиологически приемлемыми для интраназального введения (см. международную заявку WO 2013006076).

Неограничивающие примеры усилителей абсорбции включают, например, поверхностно-активные вещества, гликозиды, циклодекстрин и гликоль. Неограничивающие примеры биоадгезивных агентов включают, например, карбопол, целлюлозные вещества, крахмал, декстран и хитозан.

Доставка

Согласно изобретению композиции могут дополнительно содержать агенты, способствующие доставке белка YB-1 и/или его фрагментов в мозг. Это могут быть: а) наноносители, например, наночастицы, покрытые трансферрином б) липофильные мицеллы и липосомы, липосомы, покрытые целевыми молекулами, такими как антитела, трояны, в) антитела, например, антитела против рецептора трансферрина, г) инсулиновые рецепторы, д) химерные пептиды и т.д.

Агенты, повышающие назальную доставку белка, могут быть смешаны, по отдельности или вместе, с другими веществами, входящими в композицию вместе с белком YB-1 и/или его фрагментами. Для интраназального введения агентов желательно, чтобы любые существенные изменения в проницаемости слизистой были обратимыми в течение периода действия препарата. Кроме того, препарат не должен вызывать токсичность или вредные изменения в барьерных свойствах слизистой оболочки носа при длительном использовании.

Устройства для введения

Настоящее изобретение охватывает любое устройство, которое подходит для интраназального введения композиций. Предпочтительно, чтобы устройство позволяло вводить отмеренную дозу композиции. Примеры устройств интраназального введения включают, но не ограничивают, например, катетеры, капельницы, дозаторы, распылители аэрозолей, дозированные ингаляторы и другие устройства.

Для введения композиции в составе жидкости в виде капель, композиция может быть помещена в контейнер и снабжена обычной капельницей, предпочтительно, чтобы капельница имела фиксированный объем для подачи.

Композиция в виде сухого порошка может быть диспергирована в ингаляционном устройстве.

Устройство доставки (или его упаковки) может быть снабжено этикеткой и/или с инструкцией по применению, указывающий, что композиция должна быть использована интраназально. На этикетке может быть напечатан штрих-код, в котором зашифрован производитель, время выпуска и другая необходимая информация.

Процедуры, используемые при профилактике и лечении

При профилактике и лечении БА можно интраназально вводить белок YB-1 и его фрагменты или их производные в комбинации с другими препаратами, которые могут быть полезны при нейродегенеративных заболеваниях. Например, белок YB-1 и его фрагменты или их производное можно вводить интраназально в комбинации с приемом внутрь средств, входящих в список:

а) блокаторы ацетилхолинэстеразы, например, донепезил (Aricept™), галантамина гидробромид (реминил), ривастигмин (экселон) и ипидакрин (нейромидин);

б) средства для улучшения памяти, уменьшающие эксайтотоксичность глутамата, (акатинола мемантин™);

в) антидепрессанты (пароксетин™). Обычно используют ингибиторы обратного захвата серотонина (тразодон, буспирон) и трициклические антидепрессанты с минимальным М-холиноблокирующим действием (дезипрамин и нортриптилин);

г) анксиолитические средства (тиоридазин), антипсихотические средства (галоперидол) или бензодиазепины (лоразепам);

д) средства от расстройства сна (дифенгидрамин);

е) противовоспалительные средства (нестероидное средство ибупрофен, диклофенак и т.д.);

ж) антиоксидантные средства (витамин Е или стандартизированный экстракт листьев гинко билоба (EGb 761), содержащийся в препарате мемоплант);

з) средства, модулирующие уровень холестерина, например, агенты, которые уменьшают содержание холестерина, статины (аторвастатин, правастатин, симвастатин, ловастатин и флювастатин) и антагонисты гистаминовых (Н2) рецепторов (димебон) (см. международную заявку WO 2013006076).

Примеры

Ниже приведены примеры, включающие, но не ограничивающие объем изобретения. Тем не менее, использование этих и других примеров в описании носит исключительно иллюстративный характер и никоим образом не ограничивает объем и смысла изобретения или любого примера в перспективе. Многие модификации и варианты настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения этого описания, и такие изменения могут быть сделаны в объеме изобретения. Изобретение ограничено только терминами прилагаемой формулы изобретения вместе с объемом эквивалентов, на которые эти требования имеют право.

Пример 1. Генетическая конструкция для экспрессии белка YB-1 и его фрагментов

Синтез рекомбинантного белка YB-1 был индуцирован в клетках Е. coli BL21 (DE3), которые трансформировали плазмидой pET-3-1-YB-1 (р50), обеспечивающей IPTG - индуцируемый биосинтез рекомбинантного белка.

Пример 2. Экспрессия белка YB-1 и его фрагментов

Клетки E.coli BL21(DE3) трансформируют генетической конструкцией, кодирующей необходимый полипептид. Трансформированные клетки выращивают в среде для автоиндукции ZYP-5052 (Studier, 2005), содержащей 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 50 мМ Na₂HPO₄, 50 мМ KH₂PO₄, 25 мМ (NH₄)₂SO₄, 2 мМ MgSO₄, 0,5% глицерин, 0,05% глюкозу и 0,2% лактозу, помещаемых на качалку при 37°С в течение 16-18 часов. Клетки собирают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин (ротор JA-10 (Beckman, США). В случае YB-1 или YB-11-219 клетки суспендируют в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,5 мМ ингибитор протеаз фенилметилсульфонилфторид и 2 М NaCl для диссоциации целевых белков из комплекса с рибосомами, в случае YB-1_1-219 - в буфере 50 мМ MES-KOH, рН 6,0, содержащем 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид и 150 мМ NaCl, в случае YB-1_52-129 - в буфере 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, содержащем 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид и 150 мМ KCl. Объем буфера брали из расчета 100 мл на 20 г клеток. Затем клетки разрушают в течение 3 мин на льду в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 44 кГц, 15 мА и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 мин в роторе JA-14 (Beckman) для удаления клеточных обломков. Полученный супернатант повторно центрифугируют в роторе РПУ-45Т (ИБП РАН, Россия) при 30000 об/мин в течение 3 часов для удаления рибосом.

Пример 3. Очистка белка YB-1 и его фрагментов

При очистке YB-1 безрибосомный супернатант разбавляют буфером 20 мМ Трис-НС1, рН 7,4 и наносяти на колонку с гепарин-сефарозой (GE Healthcare, Швеция) объемом 10 мл, уравновешенную буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 500 мМ NaCl. Колонку промывают пятью объемами того же буфера и в случае YB-1 дополнительно промывают тремя объемами буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 750 мМ NaCl. Белки элюируют буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 М NaCl, собирая фракции по 2 мл и анализируя их электрофорезом. Фракции с максимальным содержанием белка объединяют, концентрируют с помощью Amicon^® Ultra-15 (Millipore, Франция), разбавляют буфером 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4 в три раза и наносят на колонку MonoS 4.6/100 РЕ (GE Healthcare) объемом 1,7 мл, уравновешенную буфером 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, 0,5 М KCl. Белок смывают градиентом 0,5-2 М KCl в буфере 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4 и окончательно дочищают гель-фильтрацией на колонке Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare) в буфере 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, 1 М KCl. Фракции с чистым белком концентрируют и диализуют против 500 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 (в случае YB-1) или 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, 150 мМ KCl (в случае YB-11.219).

При очистке YB-1_1-219 к безрибосомному супернатанту добавляют (NN₄)₂SO₄ до 60% насыщения и центрифугируют в роторе JA-14 при 8000 об/мин. Осадок суспендируют в 50 мМ MES-KOH, рН 6,0, 40% насыщения (NH₄)₂SO₄ и наносят на колонку с фенилсефарозой (GE-Healthcare) объемом 50 мл, уравновешенную тем же буфером. Белки элюируют градиентом 40-0% насыщения (NI-Lt)2S04 в буфере 50 мМ MES-KOH, рН 6,0, собирая фракции по 2 мл и анализируя их электрофорезом. Фракции с максимальным содержанием белка объединяют, диализуют против 20 мМ MES-KOH, рН 6,0, 50 мМ KCl и наносят на колонку MonoS 4.6/100 РЕ (GE Healthcare), уравновешенную тем же буфером. Белок элюируют градиентом 50-500 мМ KCl в буфере 20 мМ MES-KOH, рН 6,0, фракции, содержащие наиболее очищенный белок, концентрируют и диализуют против 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, 200 мМ KCl.

При очистке YB-1_52-129 безрибосомномный супернатант разбавляли в три раза буфером 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, наносят на колонку с сульфопропилсефарозой, уравновешенную 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4, 50 мМ KCl, белки элюируют градиентом 50-400 мМ KCl в буфере 20 мМ Hepes-KOH, рН 7,4. Фракции с максимальным содержанием белка объединяют, смешивают с равным объемом 1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,4 и наносят на колонку с фенилсефарозой, уравновешенной 500 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,4. Белки элюируют градиентом 500-0 мМ калий-фосфатного буфера, фракции с максимальным содержанием белка объединяют, диализуют против 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 и наносили на колонку MonoS 4.6/100 РЕ (GE Healthcare). Белки элюируют градиентом 50-500 мМ калий-фосфатного буфера, фракции, содержащие наиболее очищенный белок, объединяют, концентрируют и диализуют против 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4.

Чистоту белковых препаратов анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле (рис.4, Б). Белки хранят при -80°С. Концентрацию белка в препаратах определяют по поглощению при 280 нм, принимая, что раствор с оптической плотностью 1 ОЕ содержит 1,37, 1,13, 1,59 или 1,06 мг/мл YB-1, YB-1_1-219, YB-1_1-129 или YB-1_52-129, соответственно. Отношение OD280/OD260 во всех случаях было около 2, что подтверждает отсутствие нуклеиновых кислот в препаратах.

Пример 4. Тестирование и анализ эффективности препаратов на основе белка YB-1 и/или его фрагментов

Эксперименты по определению эффективности препаратов на основе белка YB-1 и его фрагментов проводят на половозрелых мышах-самцах линии NMRI весом 25-30 г.Животных содержат в клетках группами по 5-7 особей при свободном доступе к воде и пище, естественном освещении и температуре 22-23°С.

В возрасте трех месяцев у мышей проводят операцию удаления обонятельных луковиц (бульбэктомию) в стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно), для местного обезболивания при скальпировании подкожно вводят 0,5% раствор новокаина. Двустороннее удаление обонятельных луковиц осуществляют путем их аспирации через трепанационное отверстие. Контролем служили ложнооперированные (ЛО) животные, которых подвергали аналогичной процедуре, но без удаления обонятельных луковиц.

Через две недели после операции мышам микропипеткой вводят в нос по 4 мкл раствора белка YB-1 или его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 в концентрации 1,6 мкг/мкл. Препараты вводили в течение трех недель (две недели до обучения и одну неделю во время обучения).

Мышей обучают навигационному рефлексу нахождения спасательной платформы в водном лабиринте Морриса (Morris et al., 1986). Экспериментальная камера представляла собой пластиковый круглый бассейн диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой температурой 23°С. Площадь бассейна условно делилась на четыре равных сектора, в одном из которых находилась погруженная в воду спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забелялась молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.

Для опытов отбирали мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить спасательную платформу. В течение пяти дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно. Животных обучают находить спасательную платформу менее чем за 10 сек. По окончании обучения у мышей тестируют пространственную память в отсутствие спасательной платформы в течение одной минуты. Состояние пространственной памяти оценивают по двум критериям: времени пребывания в секторах бассейна и числу заходов в них.

На следующий день после тестирования пространственной памяти мышам вводят летальную дозу нембуталового наркоза (60 мг/кг, в/б). Кардиальную перфузию проводят 0,1 М фосфатным буфером (рН 17,4). Мозг быстро извлекают, проверяют полноту удаления обонятельных луковиц и рассекают на два полушария. Образцы с неполным удалением обонятельных луковиц или повреждением лобной коры исключают из гистологических и биохимических опытов, а также не учитывают при обработке результатов поведенческих экспериментов. Из левого полушария берут ткань коры головного мозга и гиппокампа и замораживают при температуре -70°С для последующего DOT и ELISA анализов уровня β-амилоида, а правое полушарие фиксируют в 4%-ном растворе параформальдегида на фосфатном буфере притемпературе 4°С в течение 48 часов с последующим хранением в 30%-ном растворе сахарозы. На криостате делают по 20 срезов во фронтальной плоскости, которые затем хранят в антифризе, приготовленном на основе этиленгликоля при температуре -20°С до проведения гистологического анализа.

Для изучения морфофункционального состояния нейронов височной коры и гиппокампа проводят окраску срезов по Нисслю крезилвиолетацетатом («Sigma»), после чего препараты исследуют с помощью оптического микроскопа Nikon Eclipse Е200. Оценивают форму и размер нейронов, а также интенсивность их окрашивания. Срезы просматривают при увеличении 20х и 40х, затем оцифровывают изображения с помощью DXM1200 камеры, установленной на микроскопе. Учитывают только нейроны с четко определяемыми контурами, ядром и ядрышками.

Для оценки морфофункционального состояния нейронов в изучаемых структурах анализируют по 1000 клеток у каждого животного (10 полей зрения, объектив 40х, окуляр 10х). Сравнительное изучение клеточного состава височной коры и полей СА1 и СА3 гиппокампа (1000 нейронов для каждой изучаемой структуры у всех мышей) проводят с использованием компьютерной видеосистемы PDP-12 (Германия). Учитывают нормальные нейроны и нейроны с различными патологическими изменениями по типу цитолиза, пикноза и вакуолизации. Плотность клеток подсчитывают в 1 мм². Для измерения плотности нейронов в структурах мозга мышей используют окуляр со стандартным объект-микрометром. Количество клеток определяли в десяти квадратах сетки площадью 0,036 мм² (объектив 40х). Измерение плотности нейронов проводят в 10 полях зрения. Эти данные были статистически обработаны с помощью программы "Статистика 06". Сравнения проводят с использованием двухвыборочного t-критерия Стьюдента. Различия считались значимыми при р<0,05.

Для биохимического анализа образцы мозга животных готовят следующим образом: 200-270 мг ткани мозга (кора и гиппокамп) гомогенизируют в 0,5 мл 70% муравьиной кислоты, выдерживают в течение одного часа, центрифугируют при 100000 g в течение 40 мин, отбирают супернатант, упаривают на роторном испарителе до минимального объема, добавляют 1 мл Н₂О, нейтрализуют раствор до рН 7,4 раствором NaOH и лиофилизируют.

Для иммунологического анализа нитроцеллюлозную мембрану обрабатывают в течение одной минуты 4% раствором овальбумина в фосфатном буфере (PBS), затем в течение 10 минут 2.5% раствором глутарового альдегида. На мембрану наносят 1 мкл мозговой ткани и выдерживают один час в 2.5% растворе овальбумина в PBS с добавлением 0,1% азида натрия. На каждую точку с образцом мозговой ткани наносят моноклональные мышиные антитела 4G8 к β-амилоиду в разведении 1:1000 и инкубируют в течение двух дней. После этого мембрану промывают PBS с 1 М NaCl, PBS с добавлением 0,05% детергента Tween 20, PBS и 4% раствором овальбумина в PBS с добавлением 0,01% азида натрия. Затем наносят биотинилированные лошадиные антитела против IgG мыши в разведении 1:3500 и инкубируют в течение одного часа. Промывки мембраны повторяют.Далее на мембрану наносят моноклональные антитела к биотину, конъюгированные с пероксидазой (разведение 1:4000). Мембрану обрабатывают раствором 0,05% перекиси водорода и 0,05% о-фенилендиамина в 0,05 Na-цитратном буфере рН 4.5. Реакцию окрашивания останавливают добавлением 12.5% серной кислоты.

Для определение β-амилоида (1-40) методом иммуноферментного анализа (ELISA) часть образцов готовят следующим образом: образцы коры и гиппокампа, хранившиеся при -80 DC после забора проб, взвешивают, размораживают при комнатной температуре, затем гомогенизируют в 2% растворе CHAPS 20 mM Tris-Cl (рН 7.7) в присутствии ингибиторов протеаз (10 мкг/мл леупептина, 10 мкг/мл апротинина и 10 мкг/мл AEBSF) в рассчитанном для каждого образца объеме (4 мл раствора на 1 г ткани). Гомогенаты центрифугируют при 21,000 g при температуре 4 DC в течение 30 мин. Отобранные супернатанты хранят при температуре -80 DC и размораживают непосредственно перед проведением иммуноферментного анализа. Другую часть образцов гомогенизируют в 5 М растворе гуанидин-HCl 50 mM Tris-HCl (рН 8,0), в рассчитанном для каждого образца объеме (8 мкл раствора на 1 мкг ткани). Образцы перемешивают в течение 3-4 часов при комнатной температуре, затем разбавляют в BSAT-DPBS (5% BSA, 0,03% Tween-20) буфере, далее центрифугируют при 21,000 g при температуре 4 DC в течение 30 мин, после чего отбирают супернатант. Иммуноферментный анализ проводят, используя инструкцию по иммуноферментному анализу для определения β-амилоида(1-40) мыши (ELISA kit mouse Ap40, «Invitrogen»). Оптическую плотность измеряют при λ=450 nm на ИФА-ридере («Bio-rad»).

Для оценки возможности прохождения белка YB-1 через гематоэнцефалический барьер и распределения в мозговых структурах используют метод конъюгирования белка с флуоресцентным красителем цианиновым Cy3, который имеет максимум поглощения 550 нм и излучения 570 нм. Краситель растворяют из расчета 1 мкг на 100 мкг водного раствора белка YB-1. Полученный белок интраназально вводят ЛО и БЭ мышам. Через два часа после его введения у животных был извлечен предварительно перфузированный мозг. Срезы головного мозга исследуют на конфокальном микроскопе НЕ654.

Для оценки возможности прохождения белка YB-1 через клеточную мембрану использовался метод коньюгирования белка с флуоресцентным красителем Cy3. Перевиваемые эукариотические клетки HeLa, выращенные в нормальных условиях (10% сыворотки) инкубировали на среде без сыворотки с белком YB-1, коньюгированным с Cy3 (YB-1-Cy3) в количестве 2,5 мкг/мл, либо только с красителем Cy3 в течении 2 часов. После инкубации клетки обрабатывали трипсином, промывали PBS и либо немедленно готовили мазки клеток, либо пересаживали на новую плашку в нормальные условия роста на 4-6 часов. Клетки фиксировали метанолом и окрашивали ядерные структуры красителем DAPI. Полученные препараты исследовали на конфокальном микроскопе Leica TCS SPE.

Таким образом был использован арсенал методов и оригинальных разработок, позволяющих проводить мониторинг протекания заболевания, а также терапевтический эффект от применяемых лекарственных препаратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эффективность действия белка YB-1 и его пептидных фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129, которые включают, но не ограничивают других вариантов фрагментов белка YB-1, по предотвращению развития клинически важных признаков БА оценивают комплексно в поведенческих, морфологических и биохимических исследованиях.

Для оценки способности белка YB-1 и его пептидных фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 предотвращать нейродегенеративный процесс проводят:

а) обучение животных навигационному рефлексу в водном лабиринте Морриса, который позволяет количественно оценить уровень пространственной памяти;

б) иммуногистохимическое и биохимическое определение уровня мозгового β-амилоида (ДОТ анализ и ELISA) для выявления эффекта этих препаратов на уровень ключевого маркера развития нейродегенерации при БА с целью определения интенсивности нейродегенеративного процесса у БЭ мышей;

в) морфофункциональное исследование состояния нейронов коры головного мозга и гиппокампа БЭ животных с выделением патологии по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации.

Обучение

Детально анализируют эффекты субхронического в течение трех недель интраназального введения рекомбинантного белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на обучение и пространственную память БЭ животных, представляющих модель спорадической формы БА.

На фиг.2 показано влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на пространственную память мышей, тестируемую в водном лабиринте Морриса, где А - время пребывания мышей в секторах водного лабиринта, Б - число заходов в них. Заштрихованные столбики соответствуют показателям в секторе обучения. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Полученные данные показывают, что у БЭ мышей значительно ухудшается пространственная память, в то время как у БЭ животных, которым интраназально вводят белок YB-1 или его фрагмент YB-1_1-219, память оставалась сохранной, поскольку эти животные могли выделять сектор, в котором при обучении находилась спасательная платформа. Положительный эффект препаратов наблюдают по обоим критериям оценки состояния памяти. Время пребывания в секторе обучения составило у ЛО, БЭ и БЭ мышей, получавших белок YB-1 или его фрагмент YB-1_1-219 30±2,3>15.4±1.5<23.3±0,9, 21.1±1.0 сек соответственно. Процентная доля числа заходов в сектор обучения от общего числа заходов во все секторы составила у ЛО, БЭ и БЭ мышей, получавших белок YB-1 или его фрагмент YB-1_1-219, 40,4±2,1>27,2±2,4<31,1±1,2, 31,3±1,3 соответственно.

Таким образом, результаты тестирования пространственной памяти у БЭ животных свидетельствуют, что интраназальное введение YB-1 предотвращает ухудшение пространственной памяти, вызванное удалением обонятельных луковиц.

Биохимия

Для выяснения молекулярных механизмов действия белка YB-1 и его пептидных фрагментов на нейродегенерацию альцгеймеровского типа было проведено исследование их влияния на уровень β-амилоида у БЭ мышей.

На фиг.3 показано влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 на уровень β-амилоида в коре головного мозга и гиппокампе БЭ мышей. По вертикальной оси указан уровень β-амилоида в нг/г ткани. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: *** - р<0,001. Установлено, что уровень β-амилоида в мозговых экстрактах коры головного мозга и гиппокампа БЭ животных, получавших белок YB-1 или его фрагменты YB-1_1-219 и YB-1_52-129, оставался на уровне ЛО животных (4.0±0,3 нг/г) и составил 4,6±0,8, 5,2±1,5 и 3,9±0,7 нг/г ткани соответственно, в то время как его уровень у БЭ мышей составил 15,8±0,9 нг/г ткани (р<0,001). По-видимому, предотвращение подъема мозгового β-амилоида у БЭ животных является одним из механизмов, опосредующих нейропротекторное действие белка YB-1 и/или его фрагментов.

Морфология

Тяжесть когнитивных нарушений при БА соответствует выраженности патоморфологических изменений, главным образом, уровню погибших нейронов. Поэтому особое место уделяют анализу морфо-функционального состояния нейронов в областях мозга, ответственных за память - височной коре и полях гиппокампа. Надо отметить, что именно в этих мозговых зонах у БЭ животных наблюдались наиболее выраженные проявления нейродегенерации. Бульбэктомия вызывает увеличение числа патологических нейронов во всех изучаемых структурах и их доля возрастает в среднем с 18% до 45-50%, причем резко увеличивается число пикноморфных клеток, которые уже не являются живыми нейронами, а представляют собой сморщенную внешнюю мембрану. Отмечено также увеличение числа нейронов с явлениями цитолиза, проявляющегося в повреждении внешней мембраны.

Для оценки способности белка YB-1 и его пептидных фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 предотвращать нейродегенеративный процесс проводят морфофункциональное исследование состояния нейронов этих структур мозга БЭ животных с выделением патологии по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации. На фиг.4-6 показано влияние интраназального введения белка YB-1 и его фрагментов YB-_11-219 и YB-1_52-129 на морфофункциональное состояние нейронов височной коры головного мозга (фиг.4А-Д) и полей СА1-СА2 (фиг.5А-Д) и СА3-СА4 (фиг.6А-Д) БЭ мышей, где А - процентная доля нормальных нейронов от общего числа проанализированных клеток; Б, В, и Г - доля нейронов с патологическими проявлениями по типу пикноза, цитолиза и вакуолизации соответственно; Д - плотность нейронов. Достоверность отличия данных по двухвыборочному t-тесту: * - р 0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 (относительно ЛО мышей); + - р<0,05; ++ - р<0,01; +++ - р<0,001 (относительно БЭ мышей).

Полученные данные показывают, что введение белка YB-1 и его фрагментов YB-1_1-219 и YB-1_52-129 оказывало позитивный эффект на морфофункциональное состояние нейронов, что, прежде всего, проявлялось в снижении числа пикноморфных клеток и клеток с явлением цитолиза во всех исследуемых мозговых структурах. За счет этого возросло число нормально функционирующих клеток в коре и полях гиппокампа. Наибольший позитивный нейропротекторный эффект оказывает белок YB-1 на нейроны височной коры, где не отмечено достоверных негативных изменений по показателям нейрональной плотности, числа нормальных клеток и клеток с явлениями цитолиза и пикноза по сравнению с ЛО животными.

Исследование проникновения меченного белка YB-1 в структуры мозга и его локализация в нейронах

Отдельный интерес представляют данные о возможности прохождения гематоэнцефалического барьера молекулами белка YB-1 у БЭ животных. Мышам интраназально вводят белок YB-1, помеченный флуоресцентным красителем цианиновым Cy3. Мышей забивают через два часа и на срезах мозга определяют наличие флуоресценции и ее локализацию в мозговых структурах на конфокальном микроскопе. Анализ полученных результатов выявляет наибольшее скопление флуоресцентных гранул в таких структурах, как гиппокамп, височная кора головного мозга, дорзальное ядро шва, синтезирующее серотонин. При этом флуоресцентная метка локализовалась внутриклеточно в перинуклеарном пространстве (фиг.7). У контрольных животных, которым в тех же количествах вводили немеченный белок YB-1, флуоресценция в срезах мозга отсутствовала.

Эти результаты явились прямым доказательством не только возможности непосредственного попадания в мозг молекул белка YB-1 при его интраназальном введении, но и его проникновения в нейроны тех структур, которые поражаются при болезни Альцгеймера.

Исследование проникновения меченого белка YB-1 в культивируемые клетки эукариот.

Данные о возможности проникновения белка YB-1 в структуры мозга не дают однозначного ответа на вопрос о способности данного белка проникать через клеточную мембрану. Для ответа на этот вопрос используют модельную систему на основе культивируемых клеток эукариот HeLa. Клетки инкубируют 2 часа с флуоресцентно-меченным YB-1 (YB-1-Cy3) или просто с красителем Cy3, в качестве контроля. После инкубации клетки обрабатывают трипсином и анализируют распределение флуоресцентной метки сразу или через 4 часа после инкубации с YB-1. На фиг.8А показано, что краситель Cy3 не проникает в клетки HeLa. Флуоресцентно меченный YB-1, напротив, проникает в клетки и локализуется в гранулярных структурах внутри цитоплазмы. Стоит отметить, что через 4 часа после инкубации с белком YB-1-Cy3 продолжает оставаться внутри клетки, что может свидетельствовать о стабильности проникающего внутрь клетки белка. Полученные результаты позволяют предположить функциональную значимость проникающего внеклеточного белка YB-1 внутрь клетки.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии нейропротекторного эффекта у рекомбинантного белка YB-1 и/или его фрагментов, что проявляется в сдерживании развития нейродегенерации альцгеймеровского типа у БЭ мышей, являющихся моделью наиболее распространенной спорадической формы БА. Результаты также вскрывают механизмы, посредством которых белок YB-1 и/или его фрагменты оказывают протекторное действие на нейроны головного мозга при нейродегенерации альцгеймеровского типа. К ним относятся снижение уровня мозгового β-амилоида и мощный нейропротекторный эффект, защищающий нервную клетку от гибели.

Простота введения препарата, эффективность низких доз, что сводит к минимуму появление неблагоприятных побочных эффектов, а также возможность генно-инженерной наработки значительного количества высоко очищенного белка YB-1 и/или его фрагментов свидетельствуют о целесообразности разработки на этой основе нового лечебного препарата против БА.

Промышленное использование

Фармакологическая композиция, содержащая белок YB-1 или его фрагмент или их производное в ее составе, может найти профилактическое и/или терапевтическое использование для лечения БА. Высокая эффективность композиции на основе белка YB-1 или его фрагментов или их производных включающих одну или более аминокислотных, делеций, и/или замен позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения БА.

Фармакологическая композиция не обладает токсичностью и биосовместима с организмом млекопитающих, в том числе и человека, так как в ней в качестве основного элемента используется рекомбинантный белок YB-1 или его фрагмент. Низкая токсичность композиции позволяет повысить эффективность лечения за счет одновременного комбинированного воздействия белка YB-1 или его фрагментов и дополнительных лекарственных средств и биологически активных агентов.

Это особенно важно при лечении сопутствующих заболеваний, осложняющих лечение БА.

Композиция имеет высокую растворимость и быстро проникает в межклеточное пространство организма, что позволяет лечить заболевания мозга. Композиция совместима с любыми фармацевтически пригодными носителями, не снижающими биологическую активность белка YB-1 и/или его фрагментов. Полученные результаты, приведенные выше, являются экспериментальным доказательством эффективности применения белка YB-1 и/или его фрагментов при развитии нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. Простота введения препарата, эффективность низких доз, возможность генно-инженерной наработки значительного количества высоко очищенного белка YB-1 и/или его фрагментов, сводит до минимума появление неблагоприятных побочных эффектов.

Литература

1. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Нестеров В.И. Состояние холинергических структур переднего мозга у бульбэктомированных мышей / БЭБМ. 2001. Т. 131. С.507-511.

2. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Медвинская Н.И., Александрова И.Ю., Самохин А.Н., Гершович Ю.Г. Активация компенсаторных механизмов в мозге после бульбэктомии / Российский физиологический журнал И.М. Сеченова. 2004. Т.90. №8. С.199-200.

3. Bobkova N.V., Nesterova I.V., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Y., Samokhin A.N., Gershovich Y.G., Gershovich P.M., Yashin V.A. Possible role of olfactory system in Alzheimer's disease genesis / In book «Alzheimer's and Parkinson's disease -AD/PD». Edit. L.Hanin, A.Fisher, Monduzzi. Medimond. 2005. P.91-95.

4. Бобкова Н.В. Модель спорадической формы болезни Альцгеймера на бульбэктомированных животных / В книге «Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты», под ред. М.В. Угрюмова. - М.: Наука. 2010. С.341-350.

5. Nesterova I.V., Bobkova N.V., Medvinskaya N.I., Samokhin A.N., Alexandrova I.Y. Morphofunctional state of neurons in the temporal cortex and hippocampus in relation to the level of spatial memory in rats after ablation of the olfactory bulbs / Neurosci. Behav. Physiol. 2008. V.38. №4. P.349-353.

6. Гаврилова С.И. Болезнь Альцгеймера - клиника и диагностика / В книге «Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты», под ред. М.В.Угрюмова. - М.: Наука. 2010. С.243-251.

7. Бачурин С.О., Воронина Т.А., Гаврилова С.И., Алесенко А.В., Подольский И.Я., Шевцова Е.Ф. Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера / В книге «Нейродегенеративные заболевания. Фундаментальные и прикладные аспекты», под ред. М.В. Угрюмова. - М.: Наука. 2010. С.313-340.

8. Гаврилова С.И., Калин Я.Б. Социальные и факторы внешней среды и ментальное здоровье людей пожилого возраста / Вестник РАМН. 2002. Т.9. С.15-20.

9. Bertoni-Freddari C, Fattoretti P, Casoli Т, Caselli U, Meier-Ruge W. Deterioration threshold of synaptic morphology in aging and senile dementia of Alzheimer's type / Anal Quant Cytol Histol. 1996. V.18. N3. P.209-13.

10. Su J.H., Anderson A.J., Cummings B.J., Cotman C.W. Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease / Neuroreport. 1994. V.5. N18. P.2529-33.

11. Елисеева И.А., Ким Е.Р., Гурьянов С.Г., Овчинников Л.П.. Лябин Д.Н. Y-бокс-связывающий белок (YB-1) и его функции / Успехи биол. Химии. 2011. T.1. С.65-132.

12. Kohno, К., Izumi, Н., Uchiumi, Т., Ashizuka, M. and Kuwano, M. The pleiotropic functions of the Y-boxbinding protein, YB-1 / Bioessays. 2003. V.25. P.691-698.

13. Skabkin M.A., Evdokimova V., Thomas A.A. and Ovchinnikov L.P. The major messenger ribonucleoprotein particle protein p50 (YB-1) promotes nucleic acid strand annealing / J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.44841-44847.

14. Ise, Т., Nagatani, G., Imamura, Т., Kato, K., Takano, Н., Nomoto, M., Izumi, Н., Ohmori, Н., Okamoto, Т., Ohga, Т., Uchiumi, Т., Kuwano, M. and Kohno, K. Transcription factor Y-box binding protein 1 binds preferentially to cisplatin-modified DNA and interacts with proliferating cell nuclear antigen / Cancer Res. 1999. V.59. P.342-346.

15. Chansky, H.A., Hu, M., Hickstein, D.D. and Yang, L. Oncogenic TLS/ERG and EWS/Fli-1 fusion proteins inhibit RNA splicing mediated by YB-1 protein / Cancer Res. 2001.V.61.P.3586-3590.

16. Skabkin M.A., Kiselyova O.I., Chemov K.G., Sorokin A.V., Dubrovin E.V., Yaminsky I.V., Vasiliev V.D. and Ovchinnikov L.P. Structural organization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1 / Nucleic Acids Res. 2004. V.32. P.5621-5635.

17. Davydova, E.K., Evdokimova, V.M., Ovchinnikov, L.P. and Hershey, J.W. Overexpression in COS cells of p50, the major core protein associated with mRNA, results in translation inhibition / Nucleic Acids Res. 1997. V.25. P.2911-2916.

18. Evdokimova, V., Ruzanov, P., Imataka, Н., Raught, В., Svitkin, Y., Ovchinnikov, L.P. and Sonenberg, N. The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5' cap-dependent mRNA stabilizer / EMBO J. 2001. V.20. P.5491-5502.

19. Evdokimova, V., Ruzanov, P., Anglesio, M.S., Sorokin, A.V., Ovchinnikov, L.P., Buckley, J., Triche, T.J., Sonenberg, N., Sorensen, P.H. Akt-Mediated YB-1 Phosphorylation Activates Translation of Silent mRNA Species / Mol. Cell. Biol. 2006. V.26. N1. P.277-292.

20. Ruzanov P.V., Evdokimova V.M., Komeeva N.L., Hershey J.W. and Ovchinnikov L.P. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments / J. Cell Sci. 1999. V.I 12. Pt.20. P.3487-3496.

21.Fotovati A, Abu-Ali S, Wang PS, Deleyrolle LP, Lee C, Triscott J, Chen JY, Franciosi S, Nakamura Y, Sugita Y, Uchiumi T, Kuwano M, Leavitt BR, Singh SK, Jury A, Jones C, Wakimoto H, Reynolds BA, Fallen CJ, Dunn SE. YB-1 Bridges Neural Stem Cells and Brain Tumor-Initiating Cells via Its Roles in Differentiation and Cell Growth / Cancer Res. 2011. V.71. No 16. P.5569-78.

22. Stone J.G., Casadesus G., Gustaw-Rothenberg K., Siedlak S.L., Wang X., Zhu X., Perry G., Castellani R.J., Smith M.A. Frontiers in Alzheimer's Disease Therapeutics / Ther Adv Chronic Dis. 2011. V.2. Nol. P.9-23.

23. Hanssen L., Frye B.C., Ostendorf Т., Alidousty C., Djudjaj S., Boor P., Rauen Т., Floege J., Mertens P.R., Raffetseder U.. Y-box binding protein-1 mediates profibrotic effects ofcalcineurin inhibitors in the kidney / J Immunol. 2011. V.187. N1. 298-308.

24. Lu, Z.H., Books, J.T. and Ley, T.J. YB-1 is important for late-stage embryonic development, optimal cellular stress responses, and the prevention of premature senescence / Mol Cell Biol. 2005. V.25. P.4625-4637.

25. Frye B.C., Halfter S., Djudjaj S., Muehlenberg P., Weber S., Raffetseder U., En-Nia A., Knott H., Baron J.M., Dooley S., Bemhagen J., Mertens P.R..Y-box protein-1 is actively secreted through a non-classical pathway and acts as an extracellular mitogen / EMBO Rep.2009. V.10. N7. P.783-9.

26. Rauen Т., Raffetseder U., Frye B.C., Djudjaj S., Mbhlenberg P.J., Eitner F., Lendahl U., Bemhagen J., Dooley S., Mertens P.R. YB-1 acts as a ligand for Notch-3 receptors and modulates receptor activation / J Biol Chem. 2009. V.284. N39. P.26928-40.

27. Abies J.L., Breunig J.J., Eisch A.J., Rakic P. Not(ch) just development: Notch signalling in the adult brain / Nat Rev Neurosci. 2011. V.12. N5. P.269-83.

28. Morris R.G., Anderson E., Lynch G.S., Baudry M. Selection impairment of learning and blockade of long-term potentiation by an N-methyl-D-asportate receptor antagonist, AP5. Nature, 1986, v. 319, p.774-776.

29.Nudler E. Evgeniev M. Bobkova N. THE USE OF INTRANASALLY ADMINISTERED HSP70 PROTEIN TO TREAT NEURODEGENERATIVE DISEASES, PCT appl. WO 2013006076 (2013-01-10)

30. Guryanov SG, Selivanova OM, Nikulin AD, Enin GA, Melnik BS, Kretov DA, Serdyuk IN, Ovchinnikov LP. Formation of amyloid-like fibrils by Y-box binding protein 1 (YB-1) is mediated by its cold shock domain and modulated by disordered terminal domains. PLoS One. 2012; 7(5):e36969. Epub 2012 May 8.

Изобретение относится к области генной инженерии и медицины. Предложен способ лечения нейродегенеративных заболеваний и болезни Альцгеймера, включающий интраназальное введение субъекту терапевтически эффективного количества белка YB-1, который имеет аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO:1 или кролика SEQ ID NO:7 и/или его активного фрагмента отдельно или в составе композиции, дополнительно содержащей один или более агентов, усиливающих интраназальную доставку композиции в мозг. Изобретение обеспечивает эффективность низких доз белка, снижение побочных эффектов, а также возможность использования высокоочищенного генно-инженерного белка. 5 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

1. Способ лечения нейродегенеративных заболеваний с ненормальным синтезом белка и гибелью нейронов у субъекта, нуждающегося в этом, заключающийся в интраназальном введении субъекту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала терапевтически эффективное количество полноразмерного белка YB-1_1-324,который имеет аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO: 1 или кролика SEQ ID NO: 7, или активного фрагмента белка YB-1_1-219, который имеет аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO: 3 или кролика SEQ ID NO: 9, или активного фрагмента белка YB-1_52-129, который имеет аминокислотную последовательность человека SEQ ID NO: 5 или кролика SEQ ID NO: 11, в дозе 0,2 мкг - 1 мг на 1 кг массы тела, в виде одной суточной дозы в течение периода от 3 недель до 5 месяцев, необходимого для достижения терапевтического эффекта, при этом белок YB-1 или его активный фрагмент применяют в терапевтически эффективном количестве отдельно или в составе композиции, дополнительно содержащей один или более агентов, усиливающих интраназальную доставку композиции в мозг.

2. Способ по п. 1, в котором нейродегенеративное заболевание связано с ненормальным синтезом белка и входит в группу: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона, старческое слабоумие, сосудистая деменция, деменция с тельцами Леви, лобно-височная деменция, смешанная деменция, болезнь Крейцтфельда-Якоба, гидроцефалия нормального давления, синдром Вернике-Корсакова, рассеянный склероз, когнитивные нарушения, прионные заболевания.

3. Способ по п. 1, в котором белок YB-1 или его активный фрагмент входят в композицию по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом в форме комбинированного препарата для совместного, раздельного или последовательного введения при лечении нейродегенеративного заболевания, при этом терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из: агента для улучшения памяти, антидепрессанта, анксиолитика, антипсихотического средства, агента против бессоницы, противовоспалительного агента, антиоксиданта, агента, модулирующего уровень холестерина.

4. Способ по п. 1, в котором терапевтически эффективное количество белка YB-1 или его активного фрагмента составляет 0,2 мкг - 100 мкг на 1 кг массы тела в день.

5. Способ по п. 1, в котором терапевтически эффективное количество белка YB-1 или его активного фрагмента составляет 100 мкг - 1 мг на 1 кг массы тела в день.

6. Способ по п. 1, в котором терапевтически эффективное количество белка YB-1 или его активного фрагмента составляет приблизительно 10 мкг - 100 мкг на 1 кг веса тела в день.