СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ САПРОТРОФНОГО МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/02 C12N1/00 

Изобретение относится к экологии, сельскому хозяйству, а именно, оценке экологической устойчивости микробной системы почвы.

Функциональная устойчивость (functional stability) микробного сообщества почв определяется как способность сообщества к сохранению своих функций при воздействии нарушающих факторов (Seybold, С.А., Herrick, J.E., Brejda, J.J., 1999. Soil resilience: a fundamental component of soil quality. Soil Science 164, 224-234., Griffiths, B.S., Ritz, K., Bardgett, R.D., Cook, R., Christensen, S., Ekelund, F., Sørensen, S., Bååth, E., Bloem, J., de Ruiter, P.C., Dolfing, J., Nicolardot, В., 2000. Ecosystem response of pasture soil communities to fumigation-induced microbial diversity reductions: an examination of the biodiversity ecosystem function relationship. Oikos 90, 279-294). Данное свойство сообщества в определенной мере связано как с множественным дублированием функций (functional redundancy), так и гетерогенностью пищевых ресурсов (resourse heterogeneity) (Yachi, S., Loreau, M., 1999. Biodiversity and ecosystem productivity in a fluctuating environment: the insurance hypothesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 1463-1468, Tilman, D., 1982. Resource Competition and Community Structure. Princeton University Press, Princeton, N.J.).

С общеэкологических позиций принято считать, что чем выше размах колебания показателя при воздействии нарушающего фактора, тем менее устойчива система (Nannipieri, P., Ascher, J., Ceccherini, М.Т., Landi, L., Pietramellara, G., Renella, G., 2003. Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science 54, 655-670, Griffiths, B.S., Kuan, H.L., Ritz, K.L., Glover, A., McCaig, A.E., Fenwick, C, 2004. The relationship between microbial community structure and functional stability, tested experimentally in an upland pasture soil. Microbial Ecology 47, 104-113, Zhang В., Wang H., Yao S., Bi L. 2013. Litter quantity confers soil functional resilience through mediating soil biophysical habitat and microbial community structure on an eroded bare land restored with mono Pinus massoniana // Soil Biology & Biochemistry 57, 556-567).

Функциональную устойчивость микробного сообщества определяют по отклику того или иного показателя биологической активности почвы на стресс. Преобладающее большинство этих способов направлено на оценку отклика микробного сообщества почвы как целого. Для этих целей обычно применяют дыхательный отклик сообщества как интегральной характеристики последнего. Этот подход вполне обоснован для общеэкологических оценок состояния почвы. Между тем, для целей агроэкологического мониторинга необходим учет активности наиболее мобильной (культивируемой) части микробного сообщества. В частности, сапротрофной группы, достаточно быстро реагирующей на изменение состояния органического вещества почвы.

Известен способ, согласно которому испытуемые образцы почвы подвергают двум видам стресса: вносят соли меди и нагревают при температуре 40°С градусов течение 18 часов, затем вносят в почву растительные остатки и измеряют динамику дыхательной активности почвы. Повторяя эту процедуру несколько раз, определяют функциональную устойчивость микробного сообщества почвы (Griffiths B.S., Bonkowski М., Roy J., Ritz К. 2001. Functional stability, substrate utilisation and biological indicators of soils following environmental impacts // Applied Soil Ecology 16, 49-61).

Недостатки способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключаются в следующем: а) многоступенчатость процедуры, б) для измерения отклика сообщества применяется только один субстрат - растительные остатки в) в качестве критерия отклика сообщества на стресс применяется интегральная характеристика сообщества - дыхание.

Известен также способ определения функциониональной устойчивости микробного сообщества путем определения динамики продуцирования СО₂ почвой при внесении в испытуемые образцы спектра пищевых субстратов (Degens В.Р., Schipper L.A., Sparling G.P., Duncan L.C. 2001. Is the microbial community in a soil with reduced catabolic diversity less resistant to stress or disturbance? // Soil Biology & Biochemistry. V. 33, P. 1143-1153), в котором устойчивость количественно оценивается по критерию выравненности функционального спектра Е по формуле:

$$E=1/{{\displaystyle \sum \left(p_i\right)}}^2$$ ,

где p_i доля балла активности утилизации каждого субстрата в общей сумме баллов по всем субстратам.

Данный способ принят как прототип 1.

Недостаток способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключается в следующем: а) вывод о степени функциональной устойчивости микробного сообщества почвы основывается на однократном определении выравненности функционального спектра микробного сообщества, б) в качестве критерия отклика сообщества на стресс применяется интегральная характеристика сообщества - дыхание.

Известен также способ оценки функциональной устойчивости микробной системы почвы путем вычисления критерия рангового распределения d по результатам мультисубстратного тестирования (Патент РФ №2335543, ПМК C12Q 1/02 (2006.01) опубликован 10.10.2008). Принят за прототип 2.

Недостаток способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключается в том, что состав среды для МСТ не содержит белковых компонентов, что снижает эффективность учета функционального спектра сапротрофной части микробного сообщества почвы.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности процесса определения функциональной устойчивости микробного сообщества почвы без применения специального дорогостоящего оборудования.

Указанный технический результат достигается тем, что образцы почвы компостируют без дополнительных источников углерода в течение 30 дней и на протяжении этого срока 3 раза при помощи метода МСТ определяют степень выравненности функционального спектра микробного сообщества почвы по показателю Е, который вычисляют по известной формуле (Degens et al., 2001):

$$E=1/{{\displaystyle \sum \left(p_i\right)}}^2$$ ,

где p_i - доля балла активности утилизации каждого субстрата в общей сумме баллов по всем субстратам,

и далее вычисляют коэффициент вариации данного показателя в течение опыта (V_E) по известной в вариационной статистике формуле (Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. 293 с.):

V_E=σ/М·100%

где σ - стандартное отклонение, М - средняя арифметическая.

Сущность изобретения заключается в том, что в известных способах определения функциональной устойчивости микробного сообщества почвы, включающих измерение дыхательной активности почвы при внесении в нее спектра субстратов и вычисление критерия выравненности функционального спектра сообщества (Е) по формуле

$$E=1/{{\displaystyle \sum \left(p_i\right)}}^2$$ ,

где p_i - доля балла активности утилизации каждого субстрата в общей сумме баллов по всем субстратам,

или вычисление критерия ранговых распределений d по результатам МСТ, согласно изобретению образцы почвы компостируют без дополнительных источников углерода в течение 30 дней и на протяжении этого срока три раза (через 0, 15, 30 дней после начала компостирования) определяют выравненность функционального спектра сообщества (Е) методом МСТ, по результатам учетов рассчитывают коэффициент вариации показателя Е (V_E=σ/М·100%), где σ - стандартное отклонение, М - средняя арифметическая) между сроками учета и по предложенной шкале оценивают функциональную устойчивость сапротрофного микробного сообщества почвы.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежие образцы почв с влажностью 25% инкубируют в течение 30 суток при температуре 23-25°С. В этих образцах 3 раза (через 0, 15 и 30 суток) определяют показатель выравненности функционального спектра микробного сообщества методом МСТ. Анализ проводят следующим образом (Данилова А.А. Способ оценки детоксикационной активности черноземов в агроценозах. Патент РФ №2525677. Публикация заявки 20.09.2013. Бюл. №26. Опубликован 20.08.2014. Бюл. №23).

Подготовку образца к анализу проводят по обычной схеме для посева на агаризованные среды. 2 г почвы растирают в 20 мл стерильного фосфатного буфера по Соренсену рН 6,5. Суспензию взбалтывают на лабораторной качалке течение 15 минут, подвергают центрифугированию в течение 20 мин при 4000 об/мин. Инокулят объемом 0,1 мл из разведения 1:10 вносят в 0,5 мл среды, содержащей минеральную основу среды Чапека, субстрат, пептон и индикатор трифенилтетразолийхлорид (ТТХ). Для этих целей можно использовать пробирки Еппендорфа с объемом 1 мл с крышкой. Конечная концентрация субстрата в реакционной смеси составляет 0,2%, пептона - 0,1%. Используют набор из 24 тест-субстратов: дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, мальтоза, лактоза, раффиноза, глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, сахароза, крахмал, ацетат натрия, цитрат натрия, цитрат аммония, малат калия, тартрат калия-натрия, мочевина, карбоксиметил целлюлоза, ТВИН-80.

Инкубацию проводят 40 ч при температуре 28°С. После инкубации содержимое пробирок раскапывают в плоскодонные иммунологические планшеты для оценки степени окрашенности культуральной жидкости. Мутность культуральной жидкости после инкубации не позволяет применение иммунологических счетчиков цветных реакций. Поэтому величину окрашенности оценивают следующим образом. Полученный планшет фотографируют при помощи цифровой фотокамеры и сравнивают с заранее заготовленной шкалой на ПК в режиме сравнения фотографий в 5-6-балльной шкале. По результатам МСТ оценивают выравненность функционального спектра микробного сообщества почвы по показателю Е. Затем рассчитывают коэффициент вариации этого показателя по трем срокам определения (V_E). Пример расчета приведен в таблице 1.

На основе полученных данных оценивают степень функциональной устойчивости микробного сообщества почвы по предлагаемой ниже шкале (табл. 2).

Для иллюстрации информативности предлагаемого критерия приводим следующие примеры.

Пример 1. Функциональная устойчивость сапротрофного микробного сообщества чернозема выщелоченного в зависимости от срока отбора проб (n=9)

Как следует примера 1, предлагаемый в заявке критерий зависит от способа использования почвы. А именно, функциональная устойчивость микробного сообщества чернозема выщелоченного была минимальной на фоне бессменного пара, максимальной - на целинном участке. Кроме того, предлагаемый критерий отражает динамику функциональной устойчивости микробного сообщества почвы в течение вегетационного периода. А именно, устойчивость была минимальной в середине периода и повышалась к весне и осени. Ни один из известных способов оценки функциональной устойчивости микробного сообщества почвы не позволяет фиксировать динамику этого свойства в течение вегетационного периода.

Пример 2. Изменение функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества чернозема обыкновенного при прекращении отвальной вспашки (n=3)

Образцы чернозема обыкновенного были отобраны в 2013 г. в ООО «Рубин» Краснозерском районе Новосибирской области на полях, обрабатываемых течение 7 лет по технологии "No Till" (прямой посев). Для сравнения в непосредственной близости были отобраны образцы с полей с традиционной вспашкой и из-под посевов многолетних трав (пласт 7 летний).

Как следует из примера 2, предлагаемый в изобретении критерий хорошо отражает снижение функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы по профилю почвы. При No Till технологии в течение 7 лет микробное сообщество слоя 0-5 см по устойчивости приблизилось к показателям соответствующего слоя под многолетними травами. При этом слой 5-10 см оставался близким к показателям слоя 0-5 см на вспашке. Таким образом, при помощи предлагаемого критерия возможна оценка состояния микробной системы почвы при изменении технологии механической обработки почвы.

Пример 3. Оценка функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества мерзлотных почв термокарстовых котловин (аласов) Центральной Якутии при прекращении выпаса на деградированном пастбище, n=9

Исследования проводились в 2011-2013 гг. Образцы почв были отобраны на территории двух типичных зрелых котловинных провально-термокарстовых аласов, имеющих разную степень антропогенной нагрузки. Аласы находятся на Тюнгюлюнской террасе (пятая надпойменная терраса р. Лена) в северной части Лено-Амгинского междуречья. Географические координаты сильно деградированного аласа Уолэн: N=62°33′24,3″ Е=130°54′01,4″), фонового аласа Тобуруон: N=62°28′29.7″ Е=130°56′40.5″. Травяной покров аласа Уолан нарушен вследствие перевыпаса. На фоновом аласе Тобуруон травостой используется под сенокос. В 2009 г. был заложен опыт по загораживанию участков деградированного аласа с целью изучения восстановления свойств почвы при исключении выпаса.

Как следует из примера 3, при помощи предлагаемого критерия оказалось возможной оценка устойчивости функционирования микробного сообщества мерзлотных почв при пастбищной дигрессии. А именно, пастбищная дигрессия особенно сильно повлияла на состояние микробного сообщества почв лугового пояса. В то же время прекращение выпаса за 4 года способствовало повышению устойчивости сообщества до уровня фонового аласа. Отметим, что эти изменения мы смогли зарегистрировать только при помощи предлагаемого в изобретении критерия. Применение стандартных почвенно-микробиологических показателей (С микробной биомассы, число КОЕ, ферментативная активность, интенсивность нитрификации) не позволило обнаружить достоверных различий между вариантами опыта.

Таким образом, эффективность предлагаемого в изобретении способа оценки функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы обусловлена следующими моментами:

1. оценивается функциональный спектр наиболее мобильной, культивируемой части микробного сообщества почвы, а именно группы, связанной с разложением свежих органических источников углерода и азота (сапротрофов), что достигается добавлением белкового компонента в среду для МСТ;

2. почва подвергается относительно мягкому стрессу - компостированию без дополнительных источников углерода при оптимальных гидротермических условиях;

3. для осуществления способа не требуется специальное дорогостоящее лабораторное оборудование.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ определения функциональной устойчивости сапротрофного микробного комплекса почвы. Проводят компостирование образца почвы в лабораторных условиях. Методом МСТ определяют выравненность функционального спектра микробного сообщества по формуле $$E=1/{{\displaystyle \sum \left(p_i\right)}}^2$$ . Учет показателя выравненности функционального спектра проводят 3 раза: через 0, 15 и 30 суток после начала компостирования. По результатам учетов рассчитывают коэффициент вариации показателя выравненности функционального спектра сапротрофного микробного сообщества почвы (V_E) между сроками учета. Оценивают функциональную устойчивость сапротрофного микробного комплекса почвы. Устойчивость считается высокой, если величина критерия V_E не превышает 20%, средней, если колеблется в пределах 20-50%, низкой - 50-100%, очень низкой - превышает 100%. Преимуществом способа является оценка функционального спектра наиболее мобильной, культивируемой части микробного сообщества почвы, а также почва подвергается относительно мягкому стрессу - компостированию без дополнительных источников углерода. 5 табл., 3 пр.

Способ определения функциональной устойчивости сапротрофного микробного комплекса почвы, включающий компостирование образца почвы в лабораторных условиях, определение выравненности функционального спектра микробного сообщества методом МСТ по формуле
Е=1/Ʃ(p_i)²,
где p_i - доля балла активности утилизации каждого субстрата в общей сумме баллов по всем субстратам, отличающийся тем, что учет показателя выравненности функционального спектра Е проводят 3 раза: через 0, 15 и 30 суток после начала компостирования без дополнительных источников углерода, по результатам учетов рассчитывают коэффициент вариации показателя выравненности функционального спектра микробного сообщества почвы (V_E) между сроками учета и по предлагаемой шкале оценивают функциональную устойчивость микробного сообщества почвы, причем устойчивость считается высокой, если величина критерия V_E не превышает 20%, средней, если колеблется в пределах 20-50%, низкой - 50-100%, очень низкой - превышает 100%.