Способ культивирования почвенного микробного сообщества Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и предназначено для культивирования ранее некультивируемых микроорганизмов из почвенного микробного сообщества, используемых при разработке удобрений, пробиотиков, стимуляторов роста, противогрибковых и противомикробных веществ, включая новые медицинские лекарственные препараты, биостимуляторы очистки сточных вод, продуцентов новых ферментов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Проблема состоит в том, что большая часть микроорганизмов в почве некультивируема. Поиск потенциальных продуцентов и других полезных для хозяйственной деятельности человека бактерий среди культивируемых микроорганизмов происходит уже давно, поэтому вероятность найти там нечто принципиально новое очень низка. При этом любая разработка бактериальных препаратов начинается с поиска микроорганизмов. Следовательно, существует потребность расширить этот скрининг и включить в него ранее недоступные штаммы. Для этого необходим поиск новых способов культивирования почвенных микроорганизмов, ранее не культивируемых. Доля культивируемых в лабораторных условиях микроорганизмов от всего разнообразия прокариот составляет, по самым оптимистичным оценкам, не более 0,1%. При этом метагеномные и метатранскриптомные методы анализа микробных сообществ ежегодно выявляют новые таксономические группы микроорганизмов, не имеющие культивируемых представителей [1].

Сформулировано множество причин резкого спада биоразнообразия микробиома при помещении его из материала окружающей среды в лабораторные условия, а также предложено множество способов его сохранения, от модификации состава питательных сред до управляемого культивирования in situ с помощью таких технологий как iChip. Несмотря на определённые успехи этих подходов в накоплении ранее не поддававшихся культивированию групп микроорганизмов, твердофазное культивирование на питательных гелях всё ещё остается оптимальным подходом к изучению чистых культур. Такой способ обеспечивает простоту, дешевизну, повторяемость экспериментов и возможность длительного хранения, использования и изучения изолятов микроорганизмов. В связи с этим актуальна разработка новых методов и технологий культивирования микробных сообществ на твёрдых питательных средах, способных воспроизвести большую долю разнообразия в сравнении с традиционными подходами.

Среди большого числа параметров, которые влияют на культивируемость микроорганизмов, большое значение имеет состав атмосферных газов в среде [2, 3]. Несмотря на это, данный параметр редко принимается во внимание в экспериментах по культивированию. Между тем для моделирования условий существования микробных консорциумов необходимо приблизить условия культивирования к природным. Так, для сообществ микроорганизмов, существующих на глубине более 10 см, могут быть оптимальными условия с пониженным содержанием кислорода и повышенным - углекислого газа. Предыдущие исследования показывают, что инкубация в условиях концентрации СО2 в газовой смеси равной 5% повышает высеваемость плохо- и некультивируемых микроорганизмов [2]. Во влажных почвах регионов с тёплым климатом содержание СО2 в почвенном воздухе может доходить до 2-5% на глубине 30-40 см. [4]. Кроме того, концентрации углекислого газа будут достигать больших значений ещё и в областях с активными процессами распада органического вещества, например, в ризосферной зоне почв [5].

Известен способ культивирования микроорганизма Methanobrevibacter, который является метаногенной бактерией, чувствительной к кислороду и требующей давления водорода 2 атм. или выше (KR20170108926, МПК C12M1/04; C12M3/00; C12N1/20, 2017-09-27) [6].

В качестве экстремофильных микроорганизмов в эксперименте использовались штаммы Methanobrevibacter ruminatium DSM 1093T и Methanobrevibacter smithii DSM 861T.

Известная среда для культивирования этих бактерий содержит: KH₂PO₄ - 0,5 г; MgSO₄ x 7 H₂O - 0,45 г; NaCl - 0,45 г; NH₄Cl - 0,45 г; CaCl₂ x 2 H₂O - 0,045 г; FeSO₄ x 7 H₂O - 0, р03 г; Раствор микроэлементов SL -10 One - 1,000 мл, дрожжевой экстракт - 1,000 г; Na-ацетат - 1 г; Na-формиат - 2 г; шламовая жидкость - 30 мл; NaHCO₃ - 4 г; смесь жирных кислот - 20 мл, резазурин - 0;001 г; цистеин -HCl x H₂O - 0;500 г; Na₂S x 9 H₂O - 0,500 г; дистиллированная вода - 970 мл; Раствор микроэлементов SL-10 One; Смесь жирных кислот.

Согласно данному способу готовили среду для культивирования и откалибровали ее pH до 7, затем прокипятили ее в течение 5 минут, заместили газ в среде газовой композицией из 80% водорода и 20% углекислого газа во время охлаждения среды и простерилизовали ее. Сразу после инокуляции стерилизованную газовую смесь нагнетали до 3 атм. в анаэробный флакон и инкубировали при 37 °С.

Данный патент представляет способ культивирования архей и других экстремофильных анаэробных микроорганизмов.

Однако состав газовой композиции для культивирования микробных консорциумов, состоящий из 80% водорода и 20% углекислого газа, подходит только для некультивируемых метаногенов. Подобные условия создают селективное преимущество для водород-окисляющих микроорганизмов и в целом отличаются от типичной почвенной газовой смеси. В связи с этим, использование такого газового состава не позволит повысить культивируемое разнообразие широкого спектра представителей типичных почвенных бактериальных групп.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Технической задачей настоящего изобретения является увеличение культивируемого разнообразия широкого спектра представителей типичных почвенных микроорганизмов, способных расти на твердых питательных средах, за счет приближения условий культивирования к реальным условиям в почвах. Для достижения указанного технического результата способ культивирования почвенного микробного сообщества характеризуется следующей последовательностью действий:

а) твердую питательную среду с низкой концентрацией источников углерода стерилизуют в автоклаве для уничтожения всех чужеродных микроорганизмов;

б) затем питательную среду продолжают нагревать в автоклаве и при достижении средой температуры 50-60°С в нее асептически вносят антимикотик в количестве равном 1 мл/л среды, представляющий собой 4%-ный раствор амфотерицина В в диметилсульфоксиде, или 3%-ный раствор флюконазола в диметилсульфоксиде;

в) после внесения антимикотика питательную среду разливают в стерильные чашки Петри и сушат до полного высыхания поверхности среды;

г) затем поверхность твёрдой питательной среды заражают аликвотой разведения почвенного материала в воде в соотношении 1:10000 и равномерно распределяют её по поверхности до полного впитывания аликвоты в толщу среды;

д) после заражения чашки Петри с питательной средой помещают в анаэробный бокс и инкубацию почвенного микробного сообщества производят в газовой смеси при содержании 5% СО₂ в атмосферном воздухе в течение не менее 10 суток.

В частных случаях выполнения способа в качестве твердой питательной среды используют:

- среду R2A [7] с загустителем геллановая камедь;

- среду на основе водной вытяжки почвенного материала (почвенный экстракт) [8] с загустителем геллановая камедь;

- среду на основе солодового экстракта [9] с загустителем геллановая камедь (пример среды с высокой концентрацией питательных веществ);

- среду R2A с загустителем агар-агар;

- среду на основе водной вытяжки почвенного материала с загустителем агар-агар (пример среды с высокой концентрацией питательных веществ);

- среду на основе солодового экстракта с загустителем агар-агар;

- среду без добавления источников углерода «голодный» агар;

- твердую олиготрофную питательную среду стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре 121°С и давлении, равном 1 атмосфере.

Предлагаемые условия инкубации приближены к почвенным. Так, увеличение содержания СО2 в атмосферном воздухе до 5% имитирует газовый состав почвенной среды и способствует росту почвенных микроорганизмов, адаптированных к таким концентрациям и/или к сниженным концентрациям кислорода. Использование питательной среды с низкими концентрациями разнородных источников углерода гораздо лучше имитирует состав питательных веществ, наблюдаемый в почве. В таких условиях быстрорастущие копиотрофные (растущие при высоких концентрациях питательных веществ) микроорганизмы теряют селективное преимущество, а длительный срок инкубации (от 10 суток) является оптимальным для большинства медленнорастущих почвенных микроорганизмов и даёт возможность появиться различимым колониям.

Это обеспечивает приближение условий культивирования к реальным условиям в почвах, что приводит к снижению эффекта влияния копиотрофных быстрорастущих групп микроорганизмов.

ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР ГРАФИЧЕСКОГО ИЗОБРАЖЕНИЯ

Изобретение поясняется иллюстрациями и таблицей.

Фиг.1. Интегральный показатель разнообразия (индекс Шэннона), рассчитанный на основе численности десяти экофизиологических групп, в условиях разных питательных сред и концентрации СО2 в газовой смеси. Каждая точка представляет оценку индекса Шэннона. Над каждой парой сравнения указано p-value значимости различий в данной паре.

Фиг. 2. Индекс развития колоний, рассчитанный на основе численности десяти экофизиологических групп, в условиях разных питательных сред и концентрации СО2 в газовой смеси. Каждая точка представляет оценку индекса. Над каждой парой сравнения указано p-value значимости различий в данной паре.

Фиг. 3. Анализ схожести микробиомов, выросших в различных вариантах опыта (Non-metric Multi-Dimensional Scaling на основе экологических расстояний брэя-кёртиса). Разница между контрольной и опытной группой значима при p=0.015 (PERMANOVA-тест, число пермутаций = 999).

Таблица. Индекс биоразнообразия Шэннона и индекс развития колоний в вариантах опыта.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка

10^-4. Инкубация почвенного микробного сообщества проводилась в течение 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждый вариант опыта был представлен двумя биологическими (два разведения почвенного материала) и минимум 6 аналитическими (минимум 6 чашек, на которых производился учёт КОЕ) повторностями. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ, затем проводился анализ биоразнообразия микробных сообществ, выросших в каждом варианте эксперимента. Прирост КОЕ за каждые сутки считался отдельной микробной экофизиологической группой; на основе данных о представленности каждой из десяти групп рассчитывались показатели альфа-разнообразия: индекс Шэннона (интегральный показатель разнообразия) по формуле -Σ(Pi×log10Pi) [10], а также CD-индекс (индекс развития колоний) по формуле Σ(Pi / i)×100 [11], где Pi это отношение числа КОЕ выросших в день i к общему числу КОЕ за весь срок инкубации. Индекс Шэннона является безразмерным показателем и прямо пропорционален величине разнообразия сообщества. CD-индекс является безразмерным показателем и прямо пропорционален доле экофизиологических групп, приросших в первые несколько суток (r-стратегов, быстрорастущих микроорганизмов). Анализ бета-разнообразия проводился следующим образом: между вариантами эксперимента рассчитывались экологические расстояния брэя-кёртиса (bray-curtis distances) и проводился NMDS-анализ [10]. Определение значимости различий между группами проводились в программном обеспечении R (v. 4.3.1).

Пример 1. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена классическая питательная среда R2A с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава:

агар-агар - 20

дрожжевой экстракт - 0,5

казеин - 0,5

глюкоза - 0,5

растворимый крахмал - 0,5

K₂HPO₄ - 0,3

пируват натрия - 0,3

пептон - 0,25.

панкреатический гидролизат казеина 0,25.

MgSO₄ - 0,024.

Пример 2. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава:

геллановая камедь (gellan gum) - 20 г.

водный экстракт из почвенного материала в соотношении 1:100 в объеме 1 литр.

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась в течение 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

Пример 3. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава, г/л:

геллановая камедь (gellan gum) - 20

солодовый экстракт - 1

дрожжевой экстракт - 0,4

глюкоза - 0,4

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась в течение 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

Пример 4. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава (г/л):

агар-агар - 20

дрожжевой экстракт - 0,5

казеин - 0,5

глюкоза - 0,5

растворимый крахмал - 0,5

K₂HPO₄ - 0,3

пируват натрия - 0,3

пептон - 0,25.

панкреатический гидролизат казеина 0,25.

MgSO₄ - 0,024.

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

Пример 5. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава:

агар-агар - 20 г.

водный экстракт из почвенного материала в соотношении 1:100 на 1 литр.

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

Пример 6. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава (г/л):

агар-агар - 20

солодовый экстракт - 1

дрожжевой экстракт - 0,4

глюкоза - 0,4.

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

Пример 7. Для почвенного посева в условиях 5% содержания углекислого газа в инкубационной газовой смеси была приготовлена питательная среда с pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C следующего состава (г/л):

агар-агар - 20.

K₂HPO₄ - 0,3.

MgSO₄ - 0,024.

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась в течение 10 суток при t=25°C в двух вариантах: в условиях обычного атмосферного воздуха и в модифицированной атмосфере, где доля углекислого газа составляла 5%. Каждые сутки в течение всего срока инкубации производился учёт КОЕ и расчёт индексов разнообразия.

В таблице приведены индексы биоразнообразия Шэннона и индексы развития колоний во всех примерах выполнения. Наибольшие значения индекса разнообразия в сочетании с наименьшими показателями индекса развития колоний (2,05 ± 0,2 и 22 ± 1 условных единиц соответственно) были получены в примере 1: культивированное микробное сообщество на среде R2A в условиях 5% СО2 в атмосферном воздухе продемонстрировало равномерный прирост колоний в течение всего срока инкубации. Схожие, но несколько меньшие показатели были достигнуты в примерах 2 (почвенный экстракт + камедь + 5% СО2) и в примере 5 (R2A + агар + 5% СО2). С другой стороны, на богатых питательными веществами средах, а также в вариантах с инкубацией в обычной атмосфере (примеры 3, 6), все показатели свидетельствовали о низком разнообразии экофизиологических групп. Обильный прирост колоний наблюдался в первые 1-3 суток, о чём говорить высокий показатель индекса развития колоний. В середине и в конце срока инкубации новые колонии прибывали в меньшем количестве и морфологическом разнообразии.

В таблице приведена количественная оценка биоразнообразия: индекс биоразнообразия Шэннона (пропорционален величине разнообразия выросшего микробного сообщества) и индекс развития колоний (пропорционален доле быстрорастущих микроорганизмов) в примерах выполнения 1-7.

Таблица. Индекс биоразнообразия Шэннона и индекс развития колоний в вариантах опыта.

№ примера Индекс разнообразия Шэннона Индекс развития колоний CO2, 5% Контроль CO2, 5% Контроль 1
R2A + Камедь 2,05 ± 0,2 1,85 ± 0,1 22 ± 1 29 ± 2 2
SA + Камедь 2,1 ± 0,1 1,76 ± 0,3 23 ± 1 30 ± 3 3
ME + Камедь 1,65 ± 0,2 1,75 ± 0,3 36 ± 1 37 ± 2 4
R2A/100 + Агар 1,95 ± 0,5 1,87 ± 0,3 23 ± 1 30 ± 2 5
SA+Агар 2 ± 0,4 1,71 ± 0,1 25 ± 1 32 ± 3 6
ME+Агар 1,7 ± 0,2 1,8 ± 0,3 30 ± 1 38 ± 2 7
Агар 1,9 ± 0,2 1,9 ± 0,2 24 ± 1 24 ± 3

На фиг. 1 приведены индексы развития колоний, рассчитанные на основе численности десяти экофизиологических групп, в условиях разных питательных сред и концентрации СО2 в газовой смеси. Визуализированы данные по двум олиготрофным (R2A+камедь, SA+камедь) и одной богатой питательной среде (ME+камедь). Каждая точка представляет отдельную оценку индекса. Над каждой парой сравнения указано p-value значимости различий в данной паре. Можно заметить, что в условиях модифицированной атмосферы на олиготрофных питательных средах SA и R2A индекс развития колоний даёт значимо меньшие значения, чем в варианте опыта с атмосферным воздухом, что связано с гораздо меньшей долей экофизиологических групп, возникающих в первые несколько суток срока инкубации.

На фиг. 2 приведены индексы биоразнообразия Шэннона, рассчитанные как описано выше. Разнообразие культуромов, хотя и не сильно, но значимо возрастает в условиях, предлагаемых настоящим изобретением. Данный результат связан в первую очередь с тем, что создаваемые согласно нашему патенту условия способствуют росту и развитию почвенных микроорганизмов, адаптированных к низкому содержанию питательных веществ и к повышенным концентрациям углекислого газа.

На фиг. 3 приведена визуализация NMDS-анализа на основе экологических расстояний брэя-кёртиса. Данный статистический тест показывает, что экологические расстояния (мера схожести наблюдений) имеют меньший разброс и дисперсию значений между образцами внутри групп по содержанию углекислого газа (образцы инкубировавшиеся при повышенном СО2 и в обычной атмосфере). Проще говоря, характер роста и появления новых колоний отличается между данными условиями, и в условиях повышенного СО2 разнообразие оказывается выше.

Из представленных данных следует, что при посеве почвенного материала на твёрдую питательную среду с заменителем агар-агара и низкой концентрацией питательных веществ (среды SA и R2A), а также с последующей инкубацией в условиях повышенного содержания СО2, наблюдается «выравнивание» экофизиологических групп культивируемых. Индекс развития колоний пропорционален числу КОЕ, приросшему в первые 1-3 суток, и он оказался ниже практически во всех вариантах с модифицированной атмосферой. Это может оказаться значимым для экспериментов по выделению трудно- или ранее некультивируемых видов микроорганизмов. Во-первых, подобные условия инкубации приближены к условиям в почвах. Во-вторых, снижается эффект влияния копиотрофных быстрорастущих групп микроорганизмов. Это дополнительно подтверждается следующим наблюдением: в вариантах опыта с модифицированной атмосферой в меньшем количестве наблюдались изоляты с характерной для родов Bacillus, Micrococcus и Streptomyces морфологией, что также указывает на изменения разнообразия состава культурома. Это может иметь большое значение, поскольку в первые несколько суток на твёрдых питательных средах как правило вырастают представители филумов Bacillota, Actinomycetota и Pseudomonadota (такие как Bacillus spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Xanthomonas spp.), активно истощающие питательный субстрат и продуцирующие большой спектр вторичных метаболитов с антимикробной активностью. С другой стороны, показано, что инкубация при повышенном содержании углекислого газа может приводить к увеличению доли таких крупных ассоциированных с почвенной средой филумов как Acidobacteriota и Verrucomicrobiota в числе изолятов на чашках Петри [2].

Данный способ культивирования может быть использован как для изучения экологии почвенной микробиоты, так и в комбинации с молекулярными и метагеномными методами для выделения труднокультивируемых и новых видов бактерий. Применение разработанного нами способа позволит выделять из почвы микроорганизмы, до того считавшиеся некультивируемыми, и тем самым значительно расширит область скрининга микроорганизмов с необходимыми функциями и разнообразит получаемые результаты. Полученные данным способом микроорганизмы могут обладать качествами, не представленными у известных групп почвенных микроорганизмов, либо значительнее выраженными.

Источники информации:

1. Pallen M. J. The status Candidatus for uncultured taxa of Bacteria and Archaea: SWOT analysis // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2021. - V. 71. - №. 9; p. 1.

2. Stevenson B. S. et al. New strategies for cultivation and detection of previously uncultured microbes // Applied and environmental microbiology. - 2004. - V. 70. - №. 8. - P. 4748-4755; p. 4748.

3. Tegtmeier D. et al. Ereboglobus luteus gen. nov. sp. nov. from cockroach guts, and new insights into the oxygen relationship of the genera Opitutus and Didymococcus (Verrucomicrobia: Opitutaceae) // Systematic and applied microbiology. - 2018. - V. 41. - №. 2. - P. 101-112; p. 1.

4. Paul E., Frey S. (ed.). Soil microbiology, ecology and biochemistry. - Elsevier, 2023.).

5. Sokol N. W. et al. Life and death in the soil microbiome: how ecological processes influence biogeochemistry //Nature Reviews Microbiology. - 2022. - Т. 20. - №. 7. - С. 415-430; p. 420.

6. Preparing Aparatus of Anaerobic Medium for Obligate Anaerobic Archaea and extremophiles. KR20170108926, МПК C12M1/04; C12M3/00; C12N1/20, 2017-09-27.

7. Reasoner D. J., Geldreich E. E. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water //Applied and environmental microbiology. - 1985. - V. 49. - №. 1. - P. 1-7.

8. Hamaki T. et al. Isolation of novel bacteria and actinomycetes using soil-extract agar medium // Journal of bioscience and bioengineering. - 2005. - Т. 99. - №. 5. - С. 485-492.

9. Atlas R. M. Handbook of microbiological media (4th. ed.). - CRC press. - 2010. - P. 1001.

10. Oksanen J. et al. The vegan package //Community ecology package. - 2007. - Т. 10. - №. 631-637. - С. 719.

11. Correa O. S. et al. Bacillus amyloliquefaciens BNM122, a potential microbial biocontrol agent applied on soybean seeds, causes a minor impact on rhizosphere and soil microbial communities // Applied Soil Ecology. - 2009. - V. 41. - №. 2. - P. 185-194; p. 188.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования почвенного микробного сообщества, характеризующийся следующей последовательностью действий: твердую олиготрофную питательную среду с низкой концентрацией источников углерода стерилизуют в автоклаве для удаления всех чужеродных микроорганизмов, затем продолжают нагревать в автоклаве и при достижении средой температуры 50-60°С в нее асептически вносят антимикотик в количестве равном 1 мл/л среды, представляющий собой 4%-ный раствор амфотерицина в диметилсульфоксиде, или 3%-ный раствор флюконазола в диметилсульфоксиде. После внесения антимикотика питательную среду разливают в стерильные чашки Петри и сушат до полного высыхания поверхности среды,) затем поверхность твёрдой питательной среды заражают аликвотой разведения почвенного материала в воде в соотношении 1:10000 и равномерно распределяют её по поверхности до полного впитывания аликвоты в толщу среды. После заражения чашки Петри с питательной средой помещают в анаэробный бокс и инкубацию почвенного микробного сообщества производят в газовой смеси при содержании 5% СО2 в атмосферном воздухе в течение не менее 10 суток. Используют твердую питательную среду R2A] с загустителем геллановая камедь. Изобретение позволяет увеличить культивируемое разнообразие широкого спектра представителей типичных почвенных микроорганизмов, способных расти на твердых питательных средах, за счет приближения условий культивирования к реальным условиям в почвах. 3 ил., 1 табл.

1. Способ культивирования почвенного микробного сообщества, характеризующийся следующей последовательностью действий:

а) твердую олиготрофную питательную среду с низкой концентрацией источников углерода стерилизуют в автоклаве для удаления всех чужеродных микроорганизмов;

б) затем питательную среду продолжают нагревать в автоклаве и при достижении средой температуры 50-60°С в нее асептически вносят антимикотик в количестве равном 1 мл/л среды, представляющий собой 4%-ный раствор амфотерицина в диметилсульфоксиде, или 3%-ный раствор флюконазола в диметилсульфоксиде;

в) после внесения антимикотика питательную среду разливают в стерильные чашки Петри и сушат до полного высыхания поверхности среды;

г) затем поверхность твёрдой питательной среды заражают аликвотой разведения почвенного материала в воде в соотношении 1:10000 и равномерно распределяют её по поверхности до полного впитывания аликвоты в толщу среды;

д) после заражения чашки Петри с питательной средой помещают в анаэробный бокс и инкубацию почвенного микробного сообщества производят в газовой смеси при содержании 5% СО2 в атмосферном воздухе в течение не менее 10 суток.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду R2A] с загустителем геллановая камедь.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду на основе водной вытяжки почвенного материала с загустителем геллановая камедь.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду на основе солодового экстракта с загустителем геллановая камедь.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду R2A с загустителем агар-агар;

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду на основе водной вытяжки почвенного материала с загустителем агар-агар.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду на основе солодового экстракта с загустителем агар-агар.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве твердой питательной среды используют среду без добавления источников углерода - «голодный» агар.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что твердую олиготрофную питательную среду стерилизуют в автоклаве в течение 20 минут при температуре 121°С и давлении, равном 1 атмосфере.