Способ оценки устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы методом мультисубстратного теста Российский патент 2019 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 

Изобретение относится к экологии, сельскому хозяйству, а именно, оценке устойчивости функционирования микробной системы почвы.

Функциональная устойчивость (functional stability) микробного сообщества почв определяется как способность его к сохранению своих функций при воздействии нарушающих факторов. С общеэкологических позиций принято считать, что чем выше размах колебания показателя при воздействии нарушающего фактора, тем менее устойчива система (Одум Ю. Основы экологии. М.: Мир, 1975. 740 с., Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini М.Т., Landi L., Pietramellara G., Renella G. Microbial diversity and soil functions // European Journal of Soil Science. 2003. V. 54. PP. 655-670; Orwin K.H., Wardle D.A. New indices for quantifying the resistance and resilience of soil biota to exogenous disturbances // Soil Biology & Biochemistry. 2004. V. 36. PP. 1907-1912, Botton S., van Heusden M., Parsons J. R., Smidt H., van Straalen N. Resilience of Microbial Systems Towards Disturbances // Critical Reviews in Microbiology, 2006. V. 32. PP. 101-112).

Функциональную устойчивость микробного сообщества (МС) определяют по отклику того или иного показателя биологической активности почвы на стресс. Нахождение почвы как в условиях прекращения поступления растительного вещества (парование), так и внесение в нее органических соединений являются своеобразным стрессом типичным для природных условий.

Преобладающее большинство способов направлено на оценку отклика МС почвы как целого. Для этих целей обычно применяют дыхательный отклик сообщества как интегральной характеристики последнего. Этот подход вполне обоснован для общеэкологических оценок состояния почвы. Между тем, для целей агроэкологического мониторинга необходим учет активности наиболее мобильной (культивируемой) части МС, в частности, сапротрофной группы, достаточно быстро реагирующей на изменение состояния органического вещества почвы. Решение этой задачи возможно, в частности, при помощи мультисубстратного теста (МСТ, CLPP). Rutgersa М., Woutersea М., Drosta S.M., Breurea A.M., Muldera С., Stonec D., Creamerd R.E., Windinge A., Bloemf J. Monitoring soil bacteria with community-level physiological profiles using Biolog™ ECO-plates in the Netherlands and Europe // Applied Soil Ecology. 2016. V. 97. PP. 23-35).

Известен способ оценки устойчивости МС почвы, в котором в качестве стресса используют компостирование почвы без дополнительных источников углерода, в качестве отклика - динамику выравненности функционального спектра МС, определяемой методом МСТ через 0, 14, 30 дней после начала опыта (Данилова А.А., Саввинов Г.Н., Данилов П.П., Петров А.А. Способ оценки функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы. Патент №2562855. Опубликован 10.09.2015. Бюлл. №25.)

Недостатки способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключаются в том, что:

1. высока трудоемкость анализа - для получения конечного результата необходимо выполнить 3 цикла определений в течение 30 дней;

2. способ не применим для почв с исходно низким уровнем активности из-за быстрой потери ее при компостировании без дополнительных источников углерода.

Известен также способ оценки устойчивости МС почвы, в котором в качестве стрессора используют керосин, в качестве отклика - критерий рангового распределения d по результатам МСТ (Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М.: МАКСПресс, 2005. С. 63).

Недостатки способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключаются в том, что:

1) в качестве стрессора применяют чужеродное для почвы соединение - керосин;

2) состав среды для МСТ не содержит белковых компонентов, что снижает эффективность учета функционального спектра сапротрофной части микробного сообщества почвы.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ оценки устойчивости МС почвы, в котором в качестве стрессора используют метсульфуронметил (МСМ) в заданном количестве с последующей инкубацией почвы и определением отклика удельной метаболической активности (УМА) сапротрофного комплекса почвы при помощи МСТ и учета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на разбавленной агаризованной среде. Уровень устойчивости оценивают по относительной величине повышения УМА МС почвы при внесении МСМ в сравнении с показателями почвы без его внесения (Данилова А.А. Способ оценки детоксикационной активности черноземов в агроценозах. Патент РФ №2525677. Опубликован 20.08.2014. Бюл. №23) (Прототип).

Недостатки способа с точки зрения технической задачи предлагаемого изобретения заключаются в следующем:

1) в качестве стрессора применяют чужеродное для почвы соединение -гербицид метсульфуронметил;

2) способ предусматривает учет числа КОЕ сапротрофного сообщества, что существенно повышает трудоемкость осуществления способа;

3) способ предназначен для применения только в условиях агроценозов на черноземных почвах.

Техническая задача изобретения. Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности процесса определения устойчивости микробного сообщества почвы за счет применения в качестве стрессора естественного субстрата, причем в дозах реальных для природных условий, сокращения длительности компостирования и сокращения необходимой аналитической работы.

Сущность изобретения заключается в том, что в отличие от известных способов оценки функциональной устойчивости микробного сообщества почвы, предусматривающих применение в качестве стрессоров керосина, метсульфуронметила или компостирование почвы без дополнительных источников углерода с последующим определением отклика сообщества по методу МСТ, согласно изобретения в образец почвы вносят природный субстрат - измельченную солому злаков в дозе 300 мг/100 г, инкубируют почву в течение 10-14 дней при температуре 23-25°C, и в конце инкубирования при помощи мультисубстратного теста вычисляют индекс устойчивости (У) микробного сообщества почвы по формуле Orwin, Wardle (2004) с учетом в качестве контроля показателей почвы, инкубированной в тех же условиях без внесения соломы, причем устойчивость считают высокой, если величина критерия (У) колеблется в пределах 0,3-1, средней 0-0,3, низкой 0 - - 0.5, очень низкой - ниже - 0.5.

Способ осуществляется следующим образом

В увлажненные до 60% от полной полевой влажности (ППВ) образцы почвы вносят измельченную пшеничную солому в дозе 300 мг/100 г, что соответствует примерно 5-6 т/га соломы и инкубируют их течение 10-14 дней при температуре 23-25°С. В конце инкубирования при помощи МСТ вычисляют индекс устойчивости микробного сообщества почвы по формуле Orwin, Wardle (2004). В качестве контроля используют почву, в которую не вносили солому и инкубировали в одинаковых условиях с опытными образцами почвы.

Анализ проводят следующим образом (Данилова А.А. Способ оценки детоксикационной активности черноземов в агроценозах. Патент РФ №2525677. Опубликован 20.08.2014. Бюл. №23). Подготовку образца к анализу проводят по обычной схеме для посева на агаризованные среды. 2 г почвы растирают в 20 мл стерильного фосфатного буфера по Соренсену pH 6,5. Суспензию взбалтывают на лабораторной качалке течение 15 минут, подвергают центрифугированию в течение 20 мин при 4000 об/мин. Инокулят объемом 0,1 мл из разведения 1:10 вносят в 0,5 мл среды, содержащей минеральную основу среды Чапека, субстрат, пептон и индикатор трифенилтетразолийхлорид (ТТХ). Для этих целей можно использовать пробирки Еппендорфа с объемом 1 мл с крышкой. Конечная концентрация субстрата в реакционной смеси составляет 0,2%, пептона - 0,1%. Используют набор из 24 тест-субстратов: дульцит, инозит, маннит, сорбит, глицерин, мальтоза, лактоза, раффиноза, глюкоза, арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, фруктоза, сахароза, крахмал, ацетат натрия, цитрат натрия, цитрат аммония, малат калия, тартрат калия-натрия, мочевина, карбоксиметил целлюлоза, ТВИН-80. Инкубацию проводят 40 ч при температуре 28°C. После инкубации содержимое пробирок раскапывают в плоскодонные иммунологические планшеты для оценки степени окрашенности культуральной жидкости. Мутность культуральной жидкости после инкубации не позволяет применять иммунологические счетчики цветных реакций. Поэтому величину окрашенности оценивают следующим образом. Полученный планшет фотографируют при помощи цифровой фотокамеры и сравнивают с заранее заготовленной шкалой на ПК в режиме сравнения фотографий в 5-6-балльной шкале. По результатам МСТ вычисляют показатель устойчивости микробного сообщества почвы по формуле Orwin, Wardle (2004):

У=1-2(С-К)/К+(С-К),

где С - сумма баллов активности в образце, куда внесли солому, К- то же в образце без внесения соломы.

(Orwin K.H., Wardle D.A. New indices for quantifying the resistance and resilience of soil biota to exogenous disturbances // Soil Biology & Biochemistry. 2004. V. 36. P. 1907-1912)

Расчет показателя устойчивости (У) приведен в таблице 1.

Почва - чернозем выщелоченный, Новосибирское Приобье. Образцы почвы были отобраны в 2016 г на многолетнем полевом опыте по изучению эффективности различных доз азотных удобрений в зерновом севообороте (опыт заложен в 2004 г).

Как видно из табл. 1 постепенное повышение дозы азотного удобрения приводит к снижению отклика микробного сообщества почвы на внесение соломы, то есть способствует повышению функциональной устойчивости микробного сообщества почвы.

В таблице 2 представлена разработанная шкала для оценки степени устойчивости микробного сообщества почвы. Каждая градация устойчивости имеет физический смысл в виде величины отклика активности на внесение соломы.

Для иллюстрации информативности предлагаемого способа приводим следующие примеры.

Пример 1. Оценка влияния минеральных удобрений на устойчивость сапротрофного микробного сообщества выщелоченного чернозема Приобья в условиях зернопарового севооборота

Почва - чернозем выщелоченный, Новосибирское Приобье. Зернопаровые (пар - пшеница-пшеница) севообороты с различным количеством поступающего растительного вещества. Как видно из примера 1, при помощи предлагаемого способа удалось количественно оценить влияние минеральных удобрений на устойчивость микробного сообщества почвы, а именно, применение технологически обоснованных доз минеральных удобрений сопровождается повышением функциональной устойчивости микробного сообщества почвы на 1-2 градации по сравнению с фоном без удобрений.

Пример 2. Оценка устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы при водной эрозии

Исследования проведены в АО «Полевод» Искитимского района Новосибирской области (N54° 33', Е 83°40'), центральная лесостепь Приобья, склон южной экспозиции с уклоном 3-4°, зерновые культуры, наблюдается сильный смыв почвы по склону.

При помощи предлагаемого способа удалось оценить состояние пахотных почв, подверженных водной эрозии. Функциональная устойчивость микробного сообщества эродированных почв была существенно ниже, чем в почве целинного участка. При этом в условиях одинакового уровня эрозии (визуальная оценка) устойчивость микробного сообщества серых почв была ниже в сравнении с черноземами, что связано с типологическими особенностями изученных почв.

Пример 3. Оценка потенциала отвальных грунтов к самовосстановлению (образцы отобраны спустя 2 года после рекультивации)

Исследования проведены на опытном участке, заложенном в 2006 г. на левом берегу р. Маят, на участке «Средний», в 50 м вниз по течению р. Маят от устья руч. Кула. Блок разработки №39, отработка россыпного месторождения была произведена в 2005 г. (ОАО «Алмазы Анабара». N 71.15'349'' Е 114.24764''). Рекультивация заключалась в планировке поверхности и посеве многолетних трав без внесения и с внесением минеральных удобрений. При помощи предлагаемого способа удалось оценить состояние отвальных грунтов после разработки россыпных месторождений алмазов в полярной Якутии. Как следует из примера 3, способ позволил оценить исходное состояние грунтов на разных отвалах. Оказалось, что в исходном состоянии отвалы существенно различались по биологическому потенциалу. Соответственно, отклик на рекультивационные мероприятия был различным. Таким образом, при помощи предлагаемого способа возможна оценка экономической целесообразности или очередности проведения тех или иных рекультивационных мероприятий. Например, объект «Гусиный» имел высокий потенциал к самовосстановлению, в то время как объект «Каменистый» требовал первоочередной рекультивации, как имеющий низкий потенциал к самовосстановлению.

Пример 4. Оценка результатов рекультивационных мероприятий отвалов после разработки россыпных месторождений алмазов

На объекте, описанном в примере 3, показали, что применение предлагаемого способа позволяет сравнить эффективность различных способов биологической рекультивации отвалов разработки россыпных месторождений алмазов в полярной Якутии. Образцы почвы были отобраны через 8 и 9 лет после начала опыта. В 2014 г анализировали средний образец из 4 повторений полевого опыта, в 2016 - два средних образца, составленных по двум повторениям опыта. То есть анализы имели повторности во времени и пространстве. Как видно из примера 4, в делянках, оставленных на самозарастание и засеянных травами, устойчивость сообщества была практически одинаковой. Посев трав на фоне применения минеральных удобрений способствовал повышению показателя до уровня целинной почвы. Следовательно, посев трав на фоне применения удобрений является наиболее быстрым способом рекультивации изученных отвалов.

Пример 5. Оценка устойчивости микробного сообщества отвальных грунтов и молодых почв на техногенных ландшафтах Южной Якутии

При помощи предлагаемого способа можно оценить степень почвообразования на техногенных ландшафтах. В примере 5 показана тесная корреляция показателя устойчивости от степени развития растительности на отвалах. Это особенно актуально для угольных отвалов, где определение скорости почвообразования по накоплению органического вещества затруднено из-за наличия в почве угольных частиц.

Таким образом, при помощи предлагаемого в изобретении способа оценки функциональной устойчивости сапротрофного микробного сообщества возможна количественная оценка состояния почв при применении минеральных удобрений, водной эрозии, рекультивации промышленных отвалов. Разработанная оценочная шкала позволяет применять предлагаемый показатель устойчивости для составления картограмм состояния антропогенно преобразованных почв. В зависимости от изучаемого объекта градации разработанной оценочной шкалы могут быть более детализированы.

Приведенные примеры доказывают, что способ достаточно информативен для оценки устойчивости функционирования микробной системы широкого спектра почв как при агроиспользовании, так и при рекультивации промышленных отвалов

Повышение эффективности предлагаемого в изобретении способа оценки устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы обусловлено следующими моментами:

1. почву подвергают стрессу, типичному для природных условий - внесению растительных остатков, причем в дозах близких для реальных полевых условий;

2. оценивают функциональный спектр наиболее мобильной, культивируемой части микробного сообщества почвы, а именно группы, связанной с разложением свежих органических источников углерода и азота - сапротрофов;

3. сокращения длительности инкубации;

4. уменьшения необходимой аналитической работы;

5. способ прост в осуществления и не требует дорогостоящих реактивов и оборудования.

Изобретение относится к экологии, сельскому хозяйству, а именно к способу определения устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы. Способ предусматривает внесение в образец почвы измельченной соломы злаков. Образец инкубируют в течение 12-14 дней при температуре 22-23°C и влажности 60%. Определяют функциональный спектр микробного сообщества методом мультисубстратного теста и вычисляют показатель устойчивости микробного сообщества почвы по формуле

У=1-{2(С-К)/[К+(С-К)]},

где С - сумма баллов активности микробного сообщества почвы по результатам МСТ в образце, куда внесли солому, К - то же в образце без внесения соломы. В качестве контроля используют почву, инкубированную в тех же условиях без внесения соломы, и оценивают устойчивость сапротрофного микробного сообщества почвы. Причем устойчивость считают высокой, если величина показателя устойчивости (У) колеблется в пределах 0,3-1; средней, если величина показателя колеблется в пределах 0-0,3; низкой, если величина показателя колеблется в пределах 0-(-)0,5, очень низкой, если величина предела колеблется ниже (-)0,5. Изобретение позволяет упростить способ, сократить длительность способа и длительность компостирования. 5 табл., 5 пр.

Способ определения устойчивости сапротрофного микробного сообщества почвы, предусматривающий внесение в образец почвы чужеродных для почвы органических веществ, инкубирование, определение отклика сообщества по функциональному спектру микробного сообщества методом мультисубстратного теста (МСТ), вычисление показателя устойчивости по формуле критерия рангового распределения или по величине изменения удельной метаболической активности сообщества, отличающийся тем, что в образец почвы вносят естественное для почвы органическое вещество - измельченную солому злаков в дозе 300 мг/100 г, после инкубирования показатель устойчивости микробного сообщества почвы вычисляют по формуле

У=1-{2(С-К)/[К+(С-К)]},

где С - сумма баллов активности микробного сообщества почвы по результатам МСТ в образце, куда внесли солому, К - то же в образце без внесения соломы, в качестве контроля используют почву, инкубированную в тех же условиях без внесения соломы, и по предлагаемой шкале оценивают устойчивость сапротрофного микробного сообщества почвы, причем устойчивость считают высокой, если величина показателя устойчивости (У) колеблется в пределах 0,3-1, средней - при 0-0,3, низкой - при 0-(-)0,5, очень низкой - ниже (-)0,5.