СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ in vitro РАСТЕНИЙ ЗЕМЛЯНИКИ (Fragaria L.) Российский патент 2015 года по МПК A01H4/00 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии и растениеводству и может быть использовано в садоводстве для сохранения растений in vitro.

Сохранение коллекций ценных клонов растений часто становится необходимым для обеспечения непрерывности производственного процесса в научно-исследовательских и промышленных лабораториях, которые используют технологию культивирования растительного материала in vitro для размножения растений вегетативным способом.

Уровень техники

Существуют разработанные ранее разнообразные биотехнологические приемы увеличения продолжительности сохранения растений in vitro без смены питательной среды: хранение растений земляники в стеклянных пробирках при комнатной температуре (Самсонова О.К., Трушечкин В.Г. Способ сохранения in vitro жизнеспособности растений: АС №1630708 // Бюл. изобр. 1991. - №8. - С. 16) и при низкой положительной температуре (Высоцкая О.Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники // Физиология растений. 1994. Т. 41. №6. С. 935-941);

хранение растений земляники в пакетах из газопроницаемого пластика (Reed В.M. Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage of strawberry germplasm // Plant Cell Rep. 1991. 10. №9. P. 431-434);

хранение растений земляники в стеклянных пробирках, газопроницаемых пластиковых пакетах и пластиковых коробках (Reed В.M. Cold storage of strawberries in vitro: A comparison of three storage systems // Fruit Varieties Journal. 1992. 46. P. 98-102);

хранение растений земляники в режиме 12-часового освещения при температуре 4°С {Reed В.M. Photoperiod improves long-term survival of in vitro-stored strawberry plantlets // Hort. Science. 2002. 37. P. 811-814);

хранение растений земляники в темноте при 4°С в стеклянных банках закрытых пластиковыми крышками на среде, дополненной глюкозой или маннитом (Lisek A., Orlikowska Т. Factors influencing long-term storage of strawberry shoots in vitro // Acta Horticulturae. 2001. 560. P. 189-192).

Однако все эти методы не могут обеспечивать сохранение живых растений земляники достаточно долго, например, более двух лет.

Известно, что если сосуды с растительным материалом герметично изолированы от окружающей среды пробками из разнообразных материалов: вата, пластик, фольга, пара-филм или полиэтиленовая пленка, то газовый состав внутри сосудов культивирования будет отличаться от состава атмосферы вне культивационных сосудов. Существуют опубликованные данные о том, что внутри культивационных сосудов накапливается этилен (Perl A., Aviv D., Galun E. Ethylene and in vitro culture of potato: Suppression of ethylene generation vastly improves protoplast yield, plating efficiency and transient expression of an alien gene // Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 403-406). Избыток этилена в сосудах культивирования стимулирует рост растяжением растений земляники (Qin Y., Zhang. S., Zhang L., Zhu D., Syed A. Response of in vitro strawberry to silver nitrate AgNO₃//Hort Science. 2005. 40. №3. P. 749-751). Избыток этилена ускоряет старение листьев у растений культивируемых in vitro (Podwyszynska M., Goszcynska D.M. Effect of inhibitors of ethylene biosynthesis and action, as well as calcium and magnesium on rose shoot rooting, shoot-tip necrosis and leaf senescence in vitro // Acta Physiologiae Plantarum. 1998. V. 20. №1. P. 91-98).

Следовательно, полная изоляция сосудов культивирования, которую используют для предотвращения подсушивания питательной среды и дегидратации растительного материала (Самсонова О.Н., Трушечкин В.Г. Способ сохранения in vitro жизнеспособности растений: АС №1630708 // Бюл. изобр. 1991. - №8. - С. 16; Reed В.М. Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage of strawberry germplasm//Plant Cell Rep. 1991. 10. №9. P. 431-434), может быть причиной снижения жизнеспособности растений in vitro. В данной ситуации, логично предположить, что ингибирование накопления этилена внутри культивационных сосудов должно увеличивать сроки хранения в них растений без применения пересадок, проветривания или обновления питательной среды. Применение ингибиторов синтеза этилена существенно улучшало физиологическое состояние растений картофеля (Curtis R.W. Antiethylene properties of silver thiosulphate in mung bean are lost in the dark // Plant Science Letters. 1984. V. 37. №1-2. P. 53-55). Растения картофеля сохранялись в закрытых пленкой сосудах (Sarkar D., Sub K.С, Chakrabarti S.K., Naik P.S. Growing of potato micro-plants in the presence of alginate-silver-thiosulfate capsules reduces ethylene-induced culture abnormalities during minimal growth conservation in vitro // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. 68. P. 79-89). Это стимулировало образование адвентивных побегов на листовых дисках земляники (Qin Y, Zhang. S., Zhang L, Zhu D., Syed A. Response of in vitro strawberry to silver nitrate AgNO₃//HortScience. 2005. 40. №3. P. 749-751).

Наиболее близким техническим решением является способ сохранения in vitro жизнеспособности растений, основанный на использовании модифицированной питательной среды для сохранения in vitro растений земляники в условиях комнатной температуры (Самсонова О.Н., Трушечкин В.Г. Способ сохранения in vitro жизнеспособности растений: АС №1630708 // Бюл. изобр. 1991. - №8. С. 16).

Недостатком этого способа является то, что он позволяет сохранять живыми всего 50% растений земляники в течение 8 месяцев или 40% растений земляники в течение 12 месяцев. Тем не менее, использование одной из модификаций данного метода позволило сохранять живыми, в среднем, 60% растений земляники при пониженной положительной температуре (2-4°С) в течение 24 месяцев (Высоцкая О.Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники // Физиология растений. 1994. Т.41. №6. С. 935-941).

Известно, что введение в состав питательной среды нитрата серебра - ингибитора этилена инициирует in vitro формирование усов у растений земляники, минуя стадию цветения (Zatykó JM, Kiss G, Radics ZS, Simon I. Initiation of strawberry runner formation in vitro // Acta Horticulturae. 1989. V. 265. P. 349-352), а также стимулирует образование адвентивных побегов на листовых дисках (Qin Y, Zhang. S., Zhang L, Zhu D., Syed A. Response of in vitro strawberry to silver nitrate AgNO₃ // Hort Science. 2005. 40. №3. P. 749-751). Однако наши попытки использовать данный технологический прием для долговременного сохранения коллекции растений земляники in vitro не принесли успеха. Растения, сохраняемые в таких условиях длительное время, часто страдали разнообразными морфологическими нарушениями: хлороз, витрификация и, как правило, погибали в течение 12-16 месяцев.

Тем не менее, существуют опубликованные данные об использовании ионов серебра для ингибирования синтеза этилена у сохраняемых in vitro микро-растений картофеля (Sarkar D., Sub K.С., Chakrabarti S.K., Naik P.S. Growing of potato micro-plants in the presence of alginate-silver-thiosulfate capsules reduces ethylene-induced culture abnormalities during minimal growth conservation in vitro // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. 68. P. 79-89). Для этого в пробирки с растениями помещали тиосульфат серебра, заключенный в оболочку из альгината кальция. Затем, пробирки, закрытые пластиковыми крышками и пленкой парафилм, помещали в холодильную камеру (температура 6°С при 16-часовом освещении интенсивностью в 20 µmol/m^-2·s^-1). Данный прием обеспечивал нормализацию морфологии микрорастений картофеля, которые сохраняли в пробирках в течение 16 месяцев в условиях ингибирующих рост на питательной среде Мурасиге и Скуга (МС), дополненной 20 г/л маннита и 40 г/л сахарозы (Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures // Physiol. Plant., 1962, V. 15, №4, P. 473-497).

Метод, описанный выше, не может быть в полной мере применен для долговременного сохранения растений земляники, поскольку питательная среда, модифицированная для растительного материала картофеля, не подходит для культивирования земляники in vitro.

Сущность изобретения

Задача изобретения

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, является создание нового способа, использование которого обеспечит долговременное сохранение in vitro коллекций растений земляники в состоянии ингибированного роста без смены питательной среды в течение двух и более лет.

Решение задачи

Поставленная задача решается тем, что создан новый способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на поверхность агаризованной среды выкладывают гранулы тиосульфата серебра, заключенные в оболочку из альгината кальция, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк.

Перечень фигур, чертежей и иных материалов

Таблица 1 - изменение жизнеспособности растений земляники, сохранявшихся in vitro по заявленному способу.

Таблица 2 - состав питательных сред для культивирования растений земляники.

Таблица 3 - данные визуального учета состояния 50 клонов земляники (Fragaria L.), сохраняемых in vitro по заявляемому способу (среда ДЕП-1).

Таблица 4 - данные визуального учета состояния 50 клонов земляники (Fragaria L.), сохраняемых in vitro по заявляемому способу (среда ДЕП 2).

Фиг. 1 - растения земляники садовой (Fragaria × ananassa Duch.) сортов Гренада и Marmolada, которые сохраняли по заявляемому способу на среде ДЕП 1 (пример №1) с 2010 по 2012 г.

Фиг.2 - растения земляники садовой (Fragaria × ananassa Duch.) сорта Senga Sengana, которое сохраняли более 4 лет в условиях ингибирования роста по заявляемому способу (пример №1) с 02.11.2005 г. по 25.12.2009 г.

Фиг. 3. - растения земляники садовой (Fragaria × ananassa Duch.) сортов Гренада и Marmolada, которые сохраняли на среде ДЕП-2 по заявляемому способу (пример №2) с 2012 по 2014 г.

Сущностью настоящего технического решения является то, что заявляемый способ, в основном, представляющий собой совокупность модифицированных нами методов сохранения растений in vitro, известных ранее, эффективно обеспечивает сохранение 100% клонов культуры земляники в течение двух и более лет.

Новизна изобретения

Новизной способа является вся заявленная совокупность признаков и заключается в том, что для долговременного хранения живых растений земляники используют модифицированную питательную среду, дополненную органической солью кальция (глюконат кальция) вместо его неорганических солей, что позволяет снизить концентрации ионов хлора (Cl^-) и нитрат-ионов (ΝΟ₃ ^2-). Гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра впервые применяют для ингибирования синтеза этилена у растений земляники с целью продления срока хранения растительного материала в закрытых пробирках.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Растения 50 сортов земляники (табл. 1) из экспериментальной коллекции группы криосохранения растений ИФР РАН (Высоцкая О.Н. 25 лет сохранения in vitro коллекции земляники (Fragaria L.) // Плодоводство и ягодоводство России. 2014. Т. XXXVIII. Ч. 1. С. 74-81) после размножения in vitro на среде МС-Р (табл. 2) помещают в пробирки на модифицированную питательную среду ДЕП-1 (табл. 2), дополненную 6 мМ (2700 мг/л) глюконата кальция, 6% сахарозы, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1 мг/л паклобутразола и 12 г/л агар-агара. В пробирки с растениями земляники, на поверхность агаризованной питательной среды выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра. Затем, пробирки с растениями закрывают стеклянным колпачком, который закрепляют на пробирке несколькими слоями тонкой пищевой полиэтиленовой пленки и сохраняют в течение трех лет с 2010 по 2013 г. в условиях пониженной температуры (4-10°С), 6-часовом дне и освещенности 0,5-0,8 клк. После 24 месяцев хранения 69% растений земляники 50 сортов оставались в жизнеспособном состоянии (табл. 1, 3; фиг. 1). Еще через 6 месяцев количество живых растений снизилось до 53%. Оставшиеся живыми растения извлекают из пробирок и изолируют из них меристематические верхушки, которые на агаризованной питательной среде МС-В (табл. 2) восстанавливают свой рост. Некоторые из растений, сохраняемые предложенным способом, остаются живыми и после 4 лет хранения (фиг. 2). Таким образом, показано, что заявляемый способ, можно использовать для долговременного сохранения коллекций живых растений земляники.

Пример 2.

Растения земляники 50 сортов (табл.1) из экспериментальной коллекции группы криосохранения растений ИФР РАН (Высоцкая О.Н. 25 лет сохранения in vitro коллекции земляники (Fragaria L.) // Плодоводство и ягодоводство России. 2014. Т. XXXVIII. Ч. 1. С. 74-81) после размножения in vitro на среде МС-Р (табл. 2) помещают в пробирки на питательную среду ДЕП-2(табл. 2), модифицированную 6 мМ (2700 мг/л) глюконата кальция, 6% сахарозы, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,5 мг/л паклобутразола и 10 г/л агар-агара. В пробирки с растениями земляники, на агаризованную питательную среду выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра. Затем, пробирки закрывают стеклянным колпачком и закрепляют его на пробирке несколькими слоями тонкой пищевой полиэтиленовой пленки и сохраняют в течение трех лет с 2012 по 2014 г. в условиях пониженной температуры (4-10°С), 6-часовом дне и освещенности 0,5-0,8 клк. После 24 месяцев хранения 65% растений земляники 50 сортов оставались в жизнеспособном состоянии (табл. 4, фиг. 3). Следует отметить, что при использовании среды ДЕП 2 (табл. 2) для долговременного хранения у растений многих сортов земляники (фиг. 3) черенки листьев не вытягиваются, а признаки этиолирования, как правило, отсутствуют. После хранения, живые растения извлекают из пробирок и изолируют из них меристематические верхушки, которые на агаризованной питательной среде МС-В (табл. 2) восстанавливают свой рост. Таким образом, показано, что заявляемый способ можно использовать для долговременного сохранения коллекций живых растений земляники.

Результаты изобретения

Заявляемый способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.) обеспечивает долговременное сохранение in vitro коллекций растений земляники в состоянии ингибированного роста без смены питательной среды в течение двух и более лет. Заявляемый способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.) позволяет увеличить продолжительность хранения в жизнеспособном состоянии 65-69% растений земляники, а также 100% клонов этой культуры до двух и более лет и использовать его для научных и промышленных целей.

Изобретение относится к области биотехнологии и растениеводства. Изобретение представляет собой способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на ее поверхность выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк. Заявленное изобретение обеспечивает долговременное сохранение in vitro коллекций растений земляники в состоянии ингибированного роста без смены питательной среды в течение двух и более и позволяет увеличить продолжительность хранения в жизнеспособном состоянии 65-69% растений земляники, а также 100% клонов этой культуры до двух и более лет и использовать его для научных и промышленных целей. 3 ил., 4 табл., 2 пр.

Способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на поверхность агаризованной среды выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк.