Способ сохранения IN VIтRо жизнеспособности растений Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к садоводству, и может быть использовано для депонирования in vitro фитопатологически чистого генетически однородного материала плодовых и ягодных растений, преимущественно

земляники.

Цель изобретения - повышение длительности хранения растений в жизнеспособном состоянии и упрощение культивирования в период хранения.

Способ состоит в том, что дифференцированное растение, полученное при клональном микроразмножении меристем, помещают в пробирку с модифицированной питательной средой, закрывают ватной пробкой и герметично запаивают в полиэтиленовую пленку, при этом питательная среда, содержа-i

щая азотнокислый аммоний, азотнокислый калий, азотнокислый кальций, ка- лий фосфорнокислый однезамещенный, магний сернокислый, железо сернокислое, трилон-Б, марганец сернокислый, натрий молибденовокислый, борную кислоту, цинк сернокислый, калий йодистый, кобальт хлористый, сернокислую медь, маннит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, глицин, мезоинозит, сахарозу, агар-агар, воду «бидистиллйрован- ную, отличается тем, что соотношение ионов аммония к нитратным ионам, сос- тавляет 1: (3,+0,5), а концентрация маннита от 1 до 4 мг/лэ при следую- , щем соотношении компонентов, мг/л: Азотнокислый аммоний 1200-2000 Азотнокислый калий 1517-2528 Азотнокислый кальций 820-2461

О СО

о

«vl

О 00

Фосфорнокислый одно- замещенный калий 169-171 Сернокислый магний 369-371 Сернокислое железо 55,6-55,8 Трилон-Б74,4-74,6

Сернокислый марганец 22,2-22,4 Молибденовокислый натрий0,24-0,26

Борная кислота 6,1-6,3 Сернокислый цинк 8,5-8,7 Йодистый калий 0,82-0,84 Хлористый кобальт 0,024-0,026 Сернокислая медь 0,024-0,026 Маннит1,000-4,000

Тиамин0,49-0,51

Пиридоксин0,49-0,51

Никотиновая кислота 0,49-0,51 Аскорбиновая кислота j0,9-1,1 Глицин 1,9-2,1

Мезоинозитол99-101

Сахароза29000-31000

Агар-агар6900-7100

Бидистшшированная водаДо 1000 мл

рН (кислотная реакция)5-, 5-5,6 Пример 1. Способ основан на , использовании модифицированной питательной среды, содержащей ионы аммо- ния и нитратные ионы в следующем соотношении: шЈ : N0 1:(3+0,5) и

маннит от 1 до 4 г/л.

В табл. 1 приведены данные, харак теризующие влияние различных соотношений ионов аммония к ионам нитрата на сохранение жизнеспособности растений земляники через различные отрезки времени после посадки их на конкретную питательную среду.

Составы питательных сред приведе- ны в табл. 2.

Оптимальным вариантом питательной среды является среда, содержащая 1 азотнокислого аммония 1201 мг/л; азотнокислого калия 1517 мг/л; азот нокислого кальция 1641 мг/л, где выдерживается соотношение иона аммония к иону нитрата 1:3,3 (вариант 6 в

табл. 1).

П р и м е р 2. Способ основан на i использовании питательной среды сос- тава, приведенного в примере 1, при дополнительном введении в питательную среду 1 г/л маннита (вариант 2, табл. 2). Выбор оптимальной дозы маннита (достаточный минимум) основан на опытных данных, приведенных в табл. 3.

10

15

, ,Q 1

- ,

6307084

ПримерЗ. Способ осуществляют следующим образом. Дифференцированные растения, полученные размножением меристематических верхушек in vitro, например земляники, помещают в пробирки с 10 мл модифицированной питательной среды, используемой в примере 2, затем пробирку закрывают стерильной ватой и дополнительно запаивают в полиэтиленовую пленку. Именно сочетание ватных пробок и полиэтиленовых кассет позволяет надежно предохранить растения в пробирках от иссушения и инфекции, а следовательно, и сохранить длительное время жизнеспособность растений. Стерилизацию пробирок с питательной средой проводят в автоклаве при давлении 1 атм в течение 15 мин. Все операции по пересадке растений проводят в асептических условиях в пылезащитной камере КП-5, которые создаются за счет непрерывного потока стерильного воздуха через камеру. Ватные пробки и салфетки для пересадки растений автоклавируют при 2 атм в течение 1 ч. Инструменты для работы со стерильным растительным материалом прокаливают в сушильном шкафу, предварительно завернув их в фольгу. Введение меристематических верхушек в культуру и их размножение проводят по общепри- нятой методике.

20

25

35

0

5

0

5

Для исследования характера влияния способа изоляции растений на длитель- ность сохранения их жизнеспособности был поставлен опыт, результаты которого позволяют сравнить данные предлагаемого способа с другими возможными вариантами изоляции (табл.4).

Iч

Изобретение позволяет без исполь- зования биологически активных веществ и без специального оборудования добиться увеличения сроков хранения растений in vitro при комнатной температуре, (табл. 5-6).

Кроме того, использование предлагаемого способа сохранения in vitro жизнеспособности растений земляники исключает повторное инфицирование оздоровленных растений, как это бывает при обычных способах оздоровле- ния растений и размножения уже оздо-i ровленных растений.

Формула изобретени

Способ сохранения in vitro жизне способности растений, включающий помещение растений в пробирки, закрытые ватными пробками, на питательную среду, содержащую азотнокислый аммоний, азотнокислый калий, азотнокислый кальций, фосфорнокислый однозаме щенный калий, сернокислый магний, сернокислое железо, трилон-Б, сернокислый марганец, молибденовокислый натрий, борную кислоту, сернокислый цинк, йодистый калий, хлористый ко-- бальт, сернокислую медь, маннит, тиамин, пиридоксин, никотинову о кислоту аскорбиновую кислоту, глицин, мезои- нозитол, сахарозу, агар-агар, бидкс- тиллированную воду, и последующее длительное выращивание на ней, отличающийся тем, что, с целью повышения длительности хранения растений в жизнеспособном состоянии и упрощения культивирования в период хранения, пробирки с растениями дополнительно герметично запаивают в полиэтиленовую пленку, а соотношение ионов аммония к нитратным ионам в питательной среде устанавливают рав

,

10

15

20

25

30

1-4 мг/л при следующем соотношении компонентов среды, мг/л:

Азотнокислый аммоний

Азотнокислый калий

Азотнокислый кальций

Фосфорнокислый однозамещенный калий

Сернокислый магний

Сернокислое железо

Трилон Б

Сернокислый марганец

Молибденовокислый

натрий

Норная кислота Сернокислый цинк

Йодистый калий

Хлористый кобальт

Сернокислая медь

Маннит

Тиамин

Пиридоксин г

Никотиновая кислота

Аскорбиновая кислота

Глицин

Мезоинозитол

Сахароза

Агар-агар

Бидистиллированная

вода

рН (кислотная реак1200-20001517-2528 820-2461

169-171

369-371

55,6-55,8

74,4-74,6

22,2-22,4

0,24-0,26

6,1-6,3

8,5-8,7

0,82-0,84

0,024-0,026

0,024-0,026

1,000-4,000

0,49-0,51

0,49-0,51

0,49-0,51

0,9-1,1

1,9-2,1.

99-101

29000-31000

6900-7100

До 1000 мл

Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в садоводстве при длительном хранении ценных сортов ягодных культур, преимущественно земляники. Целью изобрете ния является повышение длительности хранения растении в жизнеспособном состоянии без пересадки на свежие питательные среды и без внесения дополнительных доз свежего питательного раствора в первоначальную среду в период хранения. Способ состоит в том, что растения, полученные при микроклональном размножении, помещают в пробирки, закрытые ватными пробками,, на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 1 - 4 мг/л маннита, и при соотношении в среде ионов аммония и нитратных ионов 1:(3+0,5), при этом пробирки запаивают в полиэтиленовую пленку. 6 табл. i КО

Вариант питательной среды, т.2 NH4NOj, мг/л KNOj, мг/л Ca(NOj), мг/л Живые растения, %

900 691

1

1650 1900 1623

5

1601 2022 1641

6

1201 1517 1641

7

1201 2528 2461

Таблица 2

1630708

Таблица 3

Влияние концентрации маннита в питательной среде на сохранение жизнеспособности растений в разные сроки хранения (% живых растений)

Примечание. Для указанного опыта используют питательную среду 1 (табл. 2).

8 Продолжение табл.2

Зависимость сохранений жизнеспособности растений от способа изоляции внутренней среды провнрох при различном сроке хранения (X живых растений)

I инфекции на 8 нес

О

Примечание.

В спите используют среду кз примера 2. Растения земляники на предлагаемой питательной среде 8 пробирках, закрытых ватными пробками и эапажГйых D полнэт-.меновые пакеты на толстой плетен (толщина 120&2& микрон) марки 10403020, сохраняются до двух лет, причем выживают па овщей массы около 50Х растений. Тонкая пленка, использованная в сравнительном опыте называется термоусадоч - ной (толянна 0,4-0,5 микрон) и применяется для изоляции растений в склянках со средой при Кж размножении.

Таблица 5 Влияние сортовых особенностей на сохранение растениями земляники жизнеспособности при их хранении in vitro на питательной среде, не 75 содержащей маннитГ(% живых растений).

Сорт

Время Культивирования, мес

Т

а

85 53 60 83 85 73

Таблиц ft

15

О

Таблица 6 Влияние сортовых особенностей на сохранение жизнеспособности рас- тениями земляники при хранении их in vitro на предлагаемой среде, co-w держащей маннит (% живых растений).

40 30 10 30 20 26