СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА И ВАКЦИН Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 A61K39/42 

Область техники изобретения

Настоящее изобретение принадлежит к области фармацевтической промышленности и относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей вирусный антиген из оболочечного вируса.

Описание уровня техники изобретения

В настоящее время вирусы, которые используют для производства фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты или их промежуточные формы, размножают в системах культивирования на основе яиц или на основе клеток. Независимо от соответствующей используемой системы, обработка вирусных антигенов из каждой системы культивирования является очень важным и решающим шагом в производстве фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты. Что касается системы на основе яиц, основным требованием обработки является достаточное удаление яично-эмбриональных белков, таких как овальбумин, а что касается системы на основе клеток, обработка должна соответствовать таким требованиям, как значительное уменьшение количества ДНК клеток-хозяев и белков клеток-хозяев. Кроме того, не относящиеся к продукту вирусы должны быть в значительной степени удалены.

Что касается очистки вирусных белков, в EP 1982727 A1 раскрыт способ очистки вирусного мембранного белка, включающий стадии отделения клеток, микроносителей и клеточных агломератов от культуральной среды путем осаждения, проведения химической инактивации указанного осадка и солюбилизации указанного осадка, добавления холата натрия, центрифугирования смеси, уменьшения количества детергента путем обработки амберлитом и проведения аффинной хроматографии с последующим элюированием целевого белка.

В US 2011/0014230 A1 описан способ получения вакцинных антигенов, включающий, главным образом, стадию инактивации очищенных вирионов с последующим расщеплением указанных вирионов при помощи детергента.

В US 2009/0060950 A1 раскрыт способ получения противовирусных вакцин, включающий стадии размножения вируса в клетке, накопления указанного вируса в клеточном супернатанте, инактивации указанного вируса, очистки его ультрацентрифугированием в градиенте плотности и обработки его детергентом.

В US 4327182 раскрыт способ получения очищенной субъединичной вакцины против гриппа с использованием метода мембранной фильтрации.

В US 6048537 описан способ получения очищенных антигенов вируса гриппа, включающий стадии концентрирования, очистки и фрагментации.

Другими документами, которые относятся к способам очистки, являются US 2010/0119552 A1; US 2010/0158944 A1; Kalbfuss et al., 2007, Biotech & Bioeng. Vol. 96, No. 5, pp 932-944; Onions et al., 2010, Biologicals, Vol.38, pp 544-551; US 2008/0118970; WO 03/097797; Goerke et al., 2005, Biotechnology and Bioengeneering, Vol. 91, No. 1, pp 12-21; Krober et al., Chem. Eng. Technology 2010, Vol. 33, pp 941-959 и WO 2010/052214 A2.

Несмотря на описанные выше способы, по-прежнему существует потребность и, следовательно, задача создания усовершенствованного способа получения вирусного антигена, в частности, препарата вирусного антигена, и конкретно, фармацевтической композиции, такой как вакцина. В частности, существует необходимость в способе получения, обеспечивающем высокий выход продукта при относительно низкой стоимости производства, который не зависит от штамма вируса, для которого необходимо лишь минимальное количество стадий и который при этом соответствует строгим требованиям низкого содержания ДНК и белков клеток-хозяев, а также посторонних веществ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к следующим аспектам, объектам и предпочтительным вариантам осуществления, которые, соответственно, отдельно или в сочетании, способствуют достижению цели настоящего изобретения:

(1) Способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающий следующие стадии в указанном порядке:

a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,

b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, приводящее к получению жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,

c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), для получения концентрированного жидкого продукта,

d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей или состоящей из катионного детергента, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии c),

e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d),

f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии e),

и

g) очистка вирусного антигена,

при этом за стадией c) непосредственно следует стадия d).

В предпочтительном варианте осуществления основную стадию очистки, в частности, основную стадию очистки, направленную на очистку оболочечного вируса, предпочтительно хроматографию, не проводят до стадии e). После стадии e) проводят основную стадию очистки. Эта основная стадия очистки, имеющая место после стадии e), направлена на очистку вирусного антигена. Она не направлена на очистку целого вируса или целых вирионов, соответственно. Что касается определения термина «основная стадия очистки» (или «основной способ очистки», соответственно), ссылка делается на определение, приведенное в другом разделе данного документа.

В следующем предпочтительном варианте осуществления единственную выполняемую стадию хроматографии выполняют на стадии g).

В следующем предпочтительном варианте осуществления центрифугирование в градиенте плотности (например, ультрацентрифугирование в градиенте плотности, например, ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы) не проводят до стадии e).

В следующем варианте осуществления можно применять дополнительную стадию инактивации вируса, такую как стадия химической инактивации вируса, и/или дополнительную стадию удаления вируса. Тем не менее, вполне возможно, что при применении настоящего изобретения использование такой дополнительной стадии инактивации вируса и/или дополнительной стадии удаления вируса не является необходимым для достижения достаточной инактивации любых патогенов и достаточной очистки, то есть, для достижения инактивации и очистки, которые отвечают соответствующим предписаниям. Это является преимуществом, поскольку пропуск такой дополнительной стадии инактивации вируса и/или дополнительной стадии удаления вируса также способствует усовершенствованию способа, например, с точки зрения минимизации стресса, которому подвергаются желаемые вирусные антигены, и/или уменьшения продолжительности процесса. Однако если проводят дополнительную стадию инактивации вируса, такую как стадия химической инактивации вируса, и/или дополнительную стадию удаления вируса, эту стадию/и не проводят между стадиями c) и d). Как описано в другом разделе, непосредственное следование за стадией c) стадии d), среди прочего, способствует повышению выхода вирусного антигена. В другом аспекте указанную дополнительную стадию инактивации вируса и/или дополнительную стадию удаления вируса не проводят до стадии e). В следующем варианте осуществления указанную дополнительную стадию инактивации и/или дополнительную стадию очистки, например, проводят после стадии g). Кроме того, если проводят такую дополнительную стадию инактивации вируса и/или дополнительную стадию удаления вируса, концентрация химических веществ, необходимая и используемая для получения конечного продукта, который отвечает предписаниям, ниже по сравнению с концентрацией химических веществ, обычно необходимой и используемой для получения конечного продукта, который отвечает предписаниям. Это может быть выгодно, например, с точки зрения уменьшения создаваемого стресса и химических модификаций применительно к вирусным антигенам. Это может стать дополнительным преимуществом для эффективности продукта и, возможно, стабильности продукта.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «очистка вирусного антигена» означает основные способы очистки или основные стадии очистки, такие способы очистки, как хроматография или ультрацентрифугирование в градиенте плотности. В одном варианте осуществления основной способ очистки не включает селективную мембранную фильтрацию. Используемой хроматографией может быть ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, комбинированная хроматография, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное. В соответствии с настоящим изобретением, термин «основной способ очистки» или «основная стадия очистки» относится к способам, которые являются основными способами очистки, используемыми для очистки (конечного) желаемого продукта. Иными словами, основные способы/стадии очистки направлены на специфическую очистку (конечного) желаемого продукта. В настоящем изобретении, например, указанный (конечный) желаемый продукт представляет собой вирусный антиген, который нужно очистить, но не целый оболочечный вирус до солюбилизации. Другие способы, которые не являются «основным способом очистки», могут служить различным целям, например, цели осветления, цели концентрирования или цели осаждения, иногда с сопутствующим эффектом дополнительной очистки желаемого (конечного) продукта. Результатом применения такой стадии способа, не являющейся «основной стадией очистки» или «основным способом очистки», является то, что эффект очистки желаемого (конечного) продукта после осуществления такого способа/стадии ниже по сравнению с эффектом очистки, который достигается при осуществлении «основного способа/стадии очистки». После проведения основной стадии очистки, предпочтительно, не проводят дополнительные стадии очистки (например, в целях выполнения соответствующих предписаний, вследствие того, что примеси все еще присутствуют в композиции). Стадии удаления вируса и инактивации, такие как стадии химической инактивации, не рассматриваются в качестве основных стадий очистки с этой точки зрения. В соответствии с настоящим изобретением, такие «основные стадии/способы очистки» не проводят до стадии e).

(2) Способ по пункту (1), отличающийся тем, что после стадии d) и до стадии g) удаляют детергент, который был добавлен на стадии d).

В одном варианте осуществления не используют стадию хроматографии для удаления детергента.

(3) Способ по пункту (1) или (2), отличающийся тем, что коэффициент уменьшения объема на стадии c) составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5.

В предпочтительном варианте осуществления коэффициент уменьшения объема составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 12, даже более предпочтительно по меньшей мере 13, или по меньшей мере 15, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25. Типичный максимальный коэффициент уменьшения объема составляет 30, 35, 40 или 45.

В одном варианте осуществления уменьшение объема на стадии c) проводят на одной единственной стадии. В соответствии с настоящим изобретением, выражение «одна единственная стадия» означает, что проводят только одну стадию уменьшения объема, и эту единственную стадию уменьшения объема не повторяют.

(4) Способ по любому из пунктов (1)-(3), отличающийся тем, что конечная концентрация катионного детергента составляет по меньшей мере примерно 2000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 2500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5500 мкг/мл и также предпочтительно по меньшей мере примерно 6000 мкг/мл.

(5) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что катионный детергент имеет в основе катионы четверичного аммония, такие как цетилтриметиламмоний бромид или другие соли алкилтриметиламмония, соли алкиламина, такие как стеариламиноацетат или кокосовый алкиламиноацетат, бензалкония хлориды и бромиды, например, бензэтония хлорид или метилбензэтония хлорид, стеариламинполигликолевый эфир или олеиламинполигликолевый эфир, предпочтительно, катионный детергент представляет собой цетилтриметиламмоний бромид (CTAB).

В следующем варианте осуществления детергент представляет собой смесь детергентов, которая включает, в качестве детергентов, катионный детергент, описанный в данном документе, предпочтительно CTAB, и неионный детергент, описанный в данном документе, предпочтительно член семейства Tween, предпочтительно Tween-80.

(6) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что за стадией b) непосредственно следует стадия c), за которой непосредственно следует стадия d).

В следующем варианте осуществления за стадией d) непосредственно следует стадия e).

(7) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что не происходит замены детергента.

(8) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что нуклеазу или другой расщепляющий ДНК фермент, предпочтительно бензоназу^®, не добавляют до стадии d), предпочтительно нуклеазу не добавляют на всех стадиях способа.

(9) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что оболочечный вирус выбран из группы, состоящей из оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или оболочечных ретровирусов, при этом оболочечные РНК вирусы включают флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и оболочечные ДНК вирусы включают гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы, предпочтительно, оболочечный вирус выбран из оболочечных РНК вирусов, более предпочтительно, оболочечный вирус представляет собой ортомиксовирус, наиболее предпочтительно вирус гриппа, такой как вирус гриппа A, B или C.

(10) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что жидкость на стадии a) получена из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток или культуры для размножения оболочечного вируса на основе яиц.

(11) Способ по пункту (10), отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе клеток содержит клетки клеточной линии млекопитающего, предпочтительно клеточной линии животного.

(12) Способ по любому из пунктов (10) или (11), отличающийся тем, что клетки клеточной линии млекопитающего выбраны из группы, состоящей из Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK и WI-38, предпочтительно, клетки представляют собой клетки MDCK.

(13) Способ по любому из пунктов (10)-(12), отличающийся тем, что клетки культивируют как адгезивные клетки.

(14) Способ по пункту (10), отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе яиц включает куриные яйца.

(15) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что жидкость на стадии a) получают с использованием одноразового биореактора.

Использование одноразового биореактора может способствовать дальнейшему усовершенствованию способа по настоящему изобретению по сравнению с общепринятыми способами, например, в отношении самого полученного продукта, например, с точки зрения качества и/или чистоты. Это, в частности, является преимуществом, если способ применяют в крупном масштабе, например, в промышленных масштабах.

(16) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию осветления b) проводят с применением метода, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования, проточной фильтрации вдоль потока и глубинной фильтрации.

В одном варианте осуществления условия центрифугирования соответствуют, например, равно или менее чем 10000 g RCF (относительной центробежной силы) в течение менее чем 2 мин, предпочтительно, равно или менее чем 3000 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин, более предпочтительно, равно или менее чем 500 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин, даже более предпочтительно, равно или менее чем 300 g RCF в течение равно или менее чем 2 мин. В соответствии с настоящим изобретением, «g» относится к стандартному ускорению, вследствие силы тяжести на поверхности земли.

В одном варианте осуществления для проточной фильтрации вдоль потока размер пор микрофильтрационных мембран составляет, например, по меньшей мере 0,2 мкм, предпочтительно по меньшей мере 0,45 мкм, и даже более предпочтительно по меньшей мере 0,65 мкм.

В одном варианте осуществления для глубинной фильтрации, например, используют фильтры 0,2 мкм-7 мкм. Кроме того, в целях дальнейшего повышения выхода продукта и/или предотвращения засорения фильтра можно использовать предварительный фильтр.

(17) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию концентрирования c) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из проточной фильтрации вдоль потока (TFF), ультрацентрифугирования и осаждения. TFF представляет собой TFF ультрафильтрацию или TFF ультрафильтрацию и диафильтрацию на одной стадии (TFF ультрафильтрация/диафильтрация).

В одном варианте осуществления, если для стадии c) используют проточную фильтрацию вдоль потока, порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран может, например, быть равен или менее чем 1000 кДа, предпочтительно равен или менее чем 750 кДа, более предпочтительно равен или менее чем 500 кДа, даже более предпочтительно равен или менее чем 300 кДа и наиболее предпочтительно 100-300 кДа. В предпочтительном варианте осуществления порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран составляет не менее чем 50 кДа.

В предпочтительном варианте осуществления при применении проточной фильтрации вдоль потока на стадии c) уменьшение объема находится в диапазоне 5-40 раз, предпочтительно объем уменьшается более чем в 10 раз, более предпочтительно объем уменьшается более чем в 15 раз. Предпочтительно, чтобы объем уменьшался не более чем в 30 раз. Это может приводить к улучшению результатов следующих стадий обработки.

В одном варианте осуществления, если для стадии c) используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования могут соответствовать, например, 30000 g-200000 g в течение более чем 10 мин. В предпочтительном варианте осуществления при применении ультрацентрифугирования на стадии c) объем при ультрацентрифугировании уменьшается более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 30 раз, даже более предпочтительно более чем в 40 раз.

В одном варианте осуществления, если концентрирование проводят путем осаждения, подходящие химические вещества известны специалистам в данной области и могут, например, представлять собой соль, метиловый и этиловый спирт, и полиэтиленгликоль в соответствующей концентрации. Подходящие химические вещества в соответствующей концентрации осаждают продукт, например, частицы, содержащие вирусный антиген, но не оказывают или оказывают минимальный отрицательный эффект на указанные вирусные антигены. Химические вещества выбирают таким образом, что они не вступают в реакцию с (конечным) желаемым продуктом, например, вирусными антигенами. В предпочтительном варианте осуществления при применении осаждения на стадии c) объем уменьшается более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 30 раз, даже более предпочтительно более чем в 40 раз.

(18) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на стадии d) солюбилизацию проводят в течение периода времени и при температуре, которые достаточны для солюбилизации практически всех оболочечных вирусов, присутствующих в жидком продукте.

Как правило, период времени и температура, достаточные для солюбилизации практически всех оболочечных вирусов, могут быть определены специалистом в данной области. В одном варианте осуществления период времени составляет от 0,2 ч до 20 ч при температуре выше 0°C, предпочтительно при температуре от 2°C до 30°C, предпочтительно период времени составляет от 0,5 ч до 6,0 ч при температуре 2-25°C, и более предпочтительно при температуре 2-8°C.

(19) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что, в случае ее проведения, стадию e) проводят, применяя способ, выбранный из группы, состоящей из ультрацентрифугирования и проточной фильтрации вдоль потока.

В одном варианте осуществления, если на стадии e) используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования для осаждения предпочтительно соответствуют 30000 g - 200000 g в течение более чем 10 мин, предпочтительно более чем 60000 g в течение более чем 30 мин, более предпочтительно более чем 90000 g в течение более чем 30 мин, даже более предпочтительно более чем 120000 g в течение более чем 30 мин.

В одном варианте осуществления, если на стадии e) используют проточную фильтрацию вдоль потока, порог отсечения по молекулярной массе ультрафильтрационных мембран предпочтительно составляет более чем 100 кДа и более предпочтительно, более чем 300 кДа. Кроме того, порог отсечения по молекулярной массе мембран предпочтительно составляет не более чем 500 кДа.

(20) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадию f) проводят, применяя хроматографию, предпочтительно, хроматографию выбирают из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии, комбинированной хроматографии, псевдоаффинной хроматографии, жидкостно-жидкостной хроматографии и эксклюзионной хроматографии, более предпочтительно, хроматографию выбирают из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, псевдоаффинной хроматографии, аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.

(21) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вирусный антиген является частью оболочечного вируса, предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок, и более предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок, такой как вирусный поверхностный белок.

(22) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что вирусный белок представляет собой вирусный поверхностный белок HA и/или NA из вируса гриппа. В другом варианте осуществления вирусный белок представляет собой белок M из вируса гриппа.

(23) Способ по любому из предшествующих пунктов, включающий дополнительную стадию формулирования полученного вирусного антигена в фармацевтическую композицию.

(24) Способ по пункту (23), отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму, предпочтительно фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против оболочечного вируса, более предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против вируса гриппа.

(25) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия g) включает применение композиции, имеющей проводимость в диапазоне от равно или более чем 3,0 до менее чем 5,0 мсек/см, предпочтительно от равно или более чем 3,5 до равно или менее чем 4,7 мсек/см, даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 3,6 до равно или менее чем 4,65 мсек/см, в условиях температуры 25°C.

В предпочтительном варианте осуществления стадия g) включает стадию хроматографии, такой как ионообменная хроматография, и композиция, имеющая вышеуказанную проводимость, представляет собой буфер, например, буфер для нанесения и/или буфер для уравновешивания, содержащий соль, который подходит для использования в сочетании с соответствующим используемым хроматографическим методом.

Проводимость композиции можно измерять любым подходящим методом, известным специалисту в данной области, например, с использованием электронных устройств, таких как измеритель проводимости.

(26) Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что стадия g) включает применение композиции, имеющей молярную концентрацию в диапазоне от равно или более чем 1,0 M до равно или менее чем 3,5 M, предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,0 M до равно или менее чем 3,0 M, более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 M до равно или менее чем 3,0 M, и даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 M до равно или менее чем 2,6 M, в условиях температуры 25°C.

В предпочтительном варианте осуществления стадия g) включает стадию хроматографии, такой как хроматография гидрофобного взаимодействия, и композиция, имеющая вышеуказанную молярную концентрацию, представляет собой буфер, например, буфер для нанесения и/или буфер для уравновешивания, содержащий соль, который подходит для использования в сочетании с соответствующим используемым хроматографическим методом.

Молярную концентрацию можно измерять любым подходящим методом, известным специалисту в данной области.

Использование композиции, описанной в пунктах (25) и/или (26), может еще больше способствовать усовершенствованию способа получения вирусного антигена, в частности, с точки зрения выхода вирусного антигена.

(27) Применение способа производства вакцинного препарата, содержащего вирусный антиген, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, включающего следующие стадии в указанном порядке:

i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым, получение концентрированного жидкого продукта, и

ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии i),

при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и

при этом уменьшение ДНК клеток-хозяев, присутствующей в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log, предпочтительно по меньшей мере 3,0 log, более предпочтительно по меньшей мере 3,5 log, даже более предпочтительно по меньшей мере 4,0 log.

Уменьшение на по меньшей мере 2,5 log ДНК клеток-хозяев в вакцинном препарате достигается путем сочетания только стадий i) и ii), в лучшем случае, дополнительно, стадий b), e), f) и/или g) пункта (1). В любом случае, дополнительные относящиеся к ДНК стадии, в частности, стадии обработки ДНК-расщепляющим ферментом и удаляющая ДНК хроматография (аффинная хроматография, гель-хроматография и тому подобное), и/или стадии инактивации, необязательно или даже совсем не нужно проводить для достижения вышеуказанного уменьшения содержания ДНК клеток-хозяев. В случае проведения дополнительных относящихся к ДНК стадий и/или стадий инактивации, эти стадии (и, таким образом, способ в целом) можно проводить существенно усовершенствованным образом, например, с точки зрения экономичности способа, поскольку, например, требуется значительно более низкое количество расщепляющего ДНК фермента или композиции для инактивации, чтобы достичь вышеуказанного уменьшения содержания компонентов клеток-хозяев.

Что касается терминов «вакцинный препарат», «вирусный антиген», «на основе клеток», «жидкий продукт», «оболочечный вирус» и «детергент», делается ссылка на спецификацию.

В предпочтительном варианте осуществления до стадии i) из жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, удаляют клеточный детрит и/или микроносители.

(28) Применение по пункту (27), отличающееся тем, что стадии i) и ii) соответствуют стадиям c) и d), описанным в вышеприведенных пунктах.

(29) Применение по пункту (27) или (28), отличающееся тем, что до стадии i) проводят стадии a) и b), описанные в вышеприведенных пунктах, и после стадии ii) проводят стадии e), f) и/или g), описанные в вышеприведенных пунктах.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение далее будет описано более подробно с помощью предпочтительных вариантов осуществления и примеров, которые, однако, приведены исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Вирусы, которые используют для получения фармацевтических композиций, таких как вакцинные препараты или их промежуточные формы, можно размножать в системах либо на основе клеток, либо на основе яиц. В зависимости от соответствующей используемой системы указанные фармацевтические композиции обычно классифицируют либо как композиции на основе яиц, либо как композиции на основе клеток. Для вакцинных препаратов или вакцин основным требованием обработки является достаточное удаление примесей, например, в случае систем размножения вируса на основе яиц, яично-эмбриональных белков, таких как овальбумин, а также удаление не относящихся к продукту вирусов, а в случае систем размножения вируса на основе клеток, в процессе обработки должны быть выполнены дополнительные требования, такие как значительное снижение количества ДНК клеток-хозяев и белков клеток-хозяев.

В контексте настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что сочетание конкретных стадий способа, выполняемых в определенном порядке, создает усовершенствованный способ по сравнению с общепринятыми способами, например, в отношении самого процесса, например, с точки зрения упрощения всего процесса, и/или в отношении получаемых продуктов, например, с точки зрения качества, выхода и/или чистоты. Применяя способ по настоящему изобретению, можно получать указанные полезные и удивительные эффекты при условии, что способ включает стадию уменьшения объема жидкого продукта, содержащего размноженные вирусы, что приводит к концентрированию вируса (также называемого вирусными частицами) и других составляющих в указанном жидком продукте, и стадию солюбилизации, на которой происходит солюбилизация вируса, присутствующего в уменьшенном объеме жидкого продукта. В частности, и в отличие от способов предшествующего уровня техники, стадия очистки, присутствующая в способе по настоящему изобретению, имеет место только после завершения стадии солюбилизации и, кроме того, ее применяют к вирусному антигену, вместо того, чтобы применять к целым вирусным частицам. Таким образом, благодаря применению способа по настоящему изобретению, можно избежать больших потерь продукта, трудоемкой, продолжительной и дорогостоящей стадии(й) очистки, предназначенной для, и направленной на очистку целых вирусных частиц до солюбилизации, при этом получая композиции с удовлетворительными чистотой и выходом. Более того, стадии солюбилизации непосредственно предшествует стадия уменьшения объема. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что эти стадии, то есть, стадия солюбилизации, непосредственно следующая за стадией уменьшения объема, могут способствовать преимуществам способа, поскольку стадия концентрирования c) может увеличивать концентрацию ДНК клеток-хозяев, что, в свою очередь, может быть выгодным с точки зрения эффективности осаждения.

Удивительно, и в отличие от общепринятых способов получения фармацевтических композиций, таких как вакцины, содержащие вирусный антиген, способ по настоящему изобретению представляет собой усовершенствованный, надежный способ, позволяющий получать повышенный выход продукта, и в то же время требующий меньшее число стадий способа по сравнению с общепринятыми способами. Это сокращенное число необходимых стадий способа дополнительно способствует повышению надежности способа, а также снижению производственных затрат и времени, обычно необходимого для получения вакцинных композиций. Это особенно полезно в случае пандемической или сезонной вспышки вирусной инфекции, такой как грипп, поскольку появляется необходимость в быстром производстве и выпуске пандемической или сезонной вакцины на рынок, и еще более полезно в случае, если вакцины производят с использованием культуральных систем для размножения вируса на основе яиц, которые, как известно, занимают очень много времени.

Более того, с уменьшением числа стадий в способе, применяемом к фармацевтической композиции, уменьшается стресс, налагаемый на присутствующий вирус и вирусные антигены, что может приводить к повышению эффективности и стабильности конечного продукта (например, вакцины) и его промежуточных форм.

Кроме того, с применением способа по настоящему изобретению, несмотря на снижение количества стадий в способе по сравнению с общепринятыми способами, можно производить вакцинные препараты, которые отвечают конкретным административным требованиям относительно допустимого максимального количества примесей белка и ДНК. Например, для вакцинных препаратов против гриппа максимальное допустимое количество в настоящее время (2011) составляет 120 мкг белка, не являющегося гемагглютинином, (HA)/дозу и 10 нг ДНК/дозу (в этом случае, 1 доза соответствует 500 мкл вакцинного препарата). Дополнительным преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что его можно применять независимо от вируса, который размножают в системе на основе клеток или на основе яиц. Таким образом, например, если для размножения вирусов используют систему на основе клеток, способ по настоящему изобретению обеспечивает значительное уменьшение примесей ДНК клеток-хозяев, а если для размножения вирусов используют систему на основе яиц, способ обеспечивает уменьшение примесей, связанных с культивированием в яйце.

Благодаря повышенному выходу полученного вирусного антигена, большее число доз вакцины можно получать на производственную партию. Это может, например, быть особенно полезным в случае повышенного спроса на вакцинные препараты, что происходит, например, при сезонных вспышках гриппа.

Типичной и полезной вакциной, о которой идет речь, является вакцина против гриппа, в частности, субъединичная вакцина.

Кроме того, способ по настоящему изобретению можно применять с различными штаммами вируса, это означает, что способ является менее зависимым от штамма. Это особенно важно при использовании вирусов, у которых наблюдается постоянный дрейф и изменчивость генома, таких как вирусы гриппа.

В целом, способ по настоящему изобретению может представлять собой значительно усовершенствованный способ, например, с точки зрения надежности, выхода продукта, времени и затрат на производство, а также примесей, присутствующих в конечном продукте или его промежуточных формах.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающему следующие стадии в указанном порядке:

a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,

b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, с получением жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,

c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), с получением концентрированного жидкого продукта,

d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии c),

e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d),

f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии e),

и

g) очистка вирусного антигена,

при этом за стадией c) непосредственно следует стадия d).

Вирусный антиген получают из оболочечного вируса. Эти оболочечные вирусы могут быть любыми оболочечными ДНК или РНК вирусами, с одно- или двухцепочечным геномом, смысловым или антисмысловым, непрерывным или сегментированным. Например, вирусы выбирают из группы оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или ретровирусов, при этом группа оболочечных РНК вирусов включает флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и при этом группа оболочечных ДНК вирусов включает гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы. В предпочтительном варианте осуществления вирусы выбирают из группы оболочечных РНК вирусов, включающей вирусы гепатита D, ортомиксовирусы и парамиксовирусы, особенно предпочтительным оболочечным РНК вирусом является ортомиксовирус, такой как вирус гриппа A, вирус гриппа B или вирус гриппа C.

На стадии a) способа по настоящему изобретению получают жидкость, содержащую описанный выше оболочечный вирус. Эту жидкость получают из культуры для размножения вируса на основе клеток или культуры для размножения вируса на основе яиц. Как известно специалисту в данной области, вирусы, такие как описанные выше оболочечные вирусы, можно размножать в системах культивирования на основе клеток или в системах культивирования на основе яиц. Подходящие клеточные линии, которые используют для размножения вирусов, таких как вирус гриппа, как правило, получены от млекопитающих и, таким образом, представляют собой клеточные линии млекопитающих, предпочтительно клеточные линии животных. Подходящие клеточные линии животных известны специалистам в данной области и могут включать линии клеток хомяка, крупного рогатого скота, приматов (включая человека и обезьян) и собаки. В некоторых вариантах осуществления клетки клеточной линии млекопитающих выбирают из группы, состоящей из Vero, PerC6, BHK, 293, COS, PCK, MRC-5, MDCK, MDBK и WI-38, предпочтительно, клетки представляют собой клетки MDCK. Вирусы можно выращивать на клетках любым подходящим способом, известным специалистам в данной области. Например, вирусы можно выращивать в культуре адгезивных клеток или в культуре суспензионных клеток. В одном варианте осуществления клетки выращивают на микроносителях. В другом варианте осуществления клетки также можно адаптировать для выращивания в суспензии. Для систем культивирования на основе клеток можно использовать любую подходящую среду. В предпочтительном варианте осуществления клетки культивируют в бессывороточной и/или безбелковой среде. Для размножения вирусов на основе клеток, как правило, вирус или препарат живого вируса, соответственно, инокулируют в клеточную культуру, где он размножается. Размножение вирусов можно осуществлять в периодическом режиме или в периодическом режиме с подпиткой, или в перфузионном режиме. Через 2-5 дней при 25-37°C размножение вируса, как правило, прекращается. Содержащую вирус жидкость, находящуюся в биореакторе для размножения вируса, можно непосредственно использовать для процесса очистки или переносить в отдельную емкость. Затем содержащую вирус жидкость в отдельной емкости используют для процесса очистки вакцины.

Альтернативно, вирусы можно размножать в системах на основе яиц. В процессе производства на основе яиц, как правило, рабочий посевной материал вируса инъецируют в куриные яйца с эмбрионами. Вирусы начинают размножаться в аллантоисной жидкости (яичном белке) яйца, увеличивая количество вируса. Через два-три дня инкубации яйца охлаждают до 2-8°C и аллантоисную жидкость из отдельных яиц собирают и объединяют с использованием ручной или автоматизированной системы вакуумного харвестера. Собранная содержащая вирус аллантоисная жидкость представляет собой содержащую вирус жидкость на основе яиц, и затем ее используют в последующем процессе очистки.

В зависимости от системы культивирования, используемой для размножения вируса, жидкость, содержащая размноженные вирусные частицы, может иметь различные примеси. Например, потенциальными примесями, присутствующими в культуре на основе яиц, являются яичный белок, такой как яичный альбумин, или антибиотики, тогда как типичной примесью, присутствующей в культуре на основе клеток, является остаточная ДНК клеток-хозяев. Преимуществом является то, что способ по настоящему изобретению не ограничен с точки зрения системы, используемой для размножения вируса; напротив, благоприятного эффекта можно достичь при использовании жидкости, содержащей вирусы, размноженные в системах культивирования на основе клеток, а также в системах культивирования на основе яиц.

Жидкость на стадии a) можно получать с использованием одноразового биореактора. При использовании такого одноразового биореактора, например, сам полученный продукт может быть улучшен, например, с точки зрения качества и/или чистоты. Это, в частности, является преимуществом, если способ применяют в крупном масштабе, например, в промышленных масштабах.

Жидкость, содержащую оболочечный вирус, проводят через стадию осветления. Стадию осветления применяют к жидкости, содержащей вирусные частицы, но не к осажденному центрифугированием или иным образом осажденному материалу. В соответствии с настоящим изобретением, целью данной стадии осветления является удаление частиц из жидкости, таких как клеточный детрит, белковые примеси и/или вспомогательный материал, используемый для выращивания клеток, такой как микроносители. В соответствии с настоящим изобретением, стадия осветления, например, удаляет частицы из жидкости, но сохраняет более 80% вирусных антигенов из оболочечного вируса. Белковые примеси могут, например, представлять собой аллантоин, коллаген и/или альбумин, такой как овальбумин. Для осветления можно использовать любые подходящие средства или способы, известные специалисту в данной области. В частности, можно использовать проточную фильтрацию вдоль потока (TFF), глубинную фильтрацию или центрифугирование. Вследствие этого, параметры каждого из применяемого, соответственно, способа (TFF, глубинная фильтрация, центрифугирование) выбирают таким образом, чтобы указанная выше цель была достигнута. Как правило, с учетом данной цели, указанные параметры для каждого из соответствующих способов известны специалисту в данной области. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения при применении центрифугирования можно использовать центробежную силу, равную или меньшую чем 10000 g, в течение периода времени, равного или меньшего чем 2 минуты (мин). Использование меньшей центробежной силы в течение периода времени, равного или меньшего чем 2 минуты, на данной стадии осветления, например, равной или меньшей чем 1000 g, предпочтительно равной или меньшей чем 500 g, более предпочтительно равной или меньшей чем 300 g, еще больше способствует благоприятным эффектам настоящего изобретения, например, может способствовать дополнительному увеличению выхода вирусного антигена. Что касается дополнительных параметров при применении центрифугирования, а также что касается параметров для проточной фильтрации вдоль потока или глубинной фильтрации, они описаны в другом разделе данной спецификации.

В соответствии с настоящим изобретением, полученную осветленную жидкость называют «жидким продуктом».

Одним из ключевых аспектов способа по настоящему изобретению является уменьшение объема осветленной жидкости, содержащей размноженные вирусные частицы, за которым непосредственно следует стадия солюбилизации/обработки детергентом вирусных частиц, присутствующих в имеющем меньший объем, концентрированном жидком продукте. Неожиданно было обнаружено, что это уменьшение объема, за которым непосредственно следует обработка вирусных частиц детергентом, как описано в другом разделе данного документа, приводит к лучшему извлечению и, таким образом, более высокому выходу вирусного антигена. Более того, неожиданно было установлено, что, если размножение вируса проводили с использованием систем на основе клеток, можно было достичь непредвиденно более существенного снижения количества ДНК клеток-хозяев.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «непосредственно следует» означает, что, например, никаких стадий обработки или никаких специальных стадий активной очистки не проводят между стадиями c) и d). Это означает, что, например, никаких стадий обработки не применяют к жидкому продукту между стадиями c) и d), например, не проводят стадии инактивации или очистки. Это также может означать, что никаких дополнительных реагентов не отбирают или не добавляют к жидкому продукту между стадиями c) и d). В другом аспекте за стадией b) непосредственно следует стадия c), за которой непосредственно следует стадия d). Это может дополнительно способствовать усилению способа по настоящему изобретению, например, с точки зрения простоты или с точки зрения сокращения времени и снижения расходов, при этом сохраняется высокая степень извлечения продукта (вирусного антигена), выход и/или чистота.

Инактивация приводит к устранению инфекционности вируса и ее, как правило, проводят путем обработки вирусов эффективным количеством одного или более из следующих химических средств: детергенты, формальдегид, β-пропиолактон, метиленовый синий, псорален, карбоксифуллерен (C60), бинарный этиламин, ацетилэтиленимин или их сочетания. Другие способы инактивации известны специалисту в данной области и включают, например, обработку вируса физическими средствами, такими как гамма-облучение и/или УФ-свет.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения не проводят инактивацию путем применения того же детергента, который используют для солюбилизации оболочечного вируса (стадия d)). В других вариантах осуществления настоящего изобретения не проводят инактивацию, в частности, инактивацию, включающую обработку вируса формальдегидом, β-пропиолактоном и/или УФ-светом (таким как УФ-C), предпочтительно, формальдегидом и/или β-пропиолактоном, до стадии d). В другом аспекте можно применять стадию инактивации вирусов после стадии солюбилизации оболочечного вируса, то есть, после стадии d). В еще одном аспекте совсем никакой стадии инактивации не проводят на протяжении стадий a)-f). Это может дополнительно способствовать усилению способа по настоящему изобретению, например, с точки зрения расходов и/или трудозатрат. Иногда β-пропиолактон также используют для инактивации остаточной ДНК клеток-хозяев, которая может присутствовать, если размножение вируса проводили в системах на основе клеток. Однако β-пропиолактон является алкилирующим средством, которое алкилирует не только ДНК, но и продукты-антигены (вирусные антигены), и вследствие этого может отрицательно влиять на качество, например, с точки зрения стабильности и/или иммуногенности, указанных антигенов. Вследствие этого, преимуществом способа по настоящему изобретению является то, что, как это ни удивительно, но, несмотря на отказ от использования таких средств инактивации, как β-пропиолактон, требование о пределах максимально допустимого количества примесей ДНК клеток-хозяев в конечном продукте (таком как вакцинный препарат) может быть выполнено.

Концентрирование жидкого продукта на этапе c) можно осуществлять подходящими методами. Указанные методы направлены на уменьшение объема жидкого продукта. Целью данной стадии не является специфическая очистка вирусных частиц, то есть, эта стадия не является основной стадией очистки. Скорее, цель применения данной стадии заключается в уменьшении объема жидкого продукта, содержащего частицы оболочечного вируса, для получения концентрированного жидкого продукта.

Во время стадии уменьшения объема может случиться так, что мелкие примеси отделяются от жидкого вирусного продукта. Мелкие примеси могут быть любыми материалами, такими как молекулы, частицы или компоненты среды, имеющими размер, который меньше чем размер оболочечного вируса, предпочтительно менее чем примерно 1000 кДа, более предпочтительно, менее чем примерно 500 кДа, даже более предпочтительно, менее чем примерно 300 кДа. Это отделение мелких примесей, если оно имеет место, основано только на размере отделяемых примесей, но не на плотности примесей. Отделение примесей, основанное не только на размере указанных примесей, но также и на плотности указанных примесей, имеет место при осуществлении способов очистки, которые включают применение градиентов, например, градиентного центрифугирования. Примером градиентного центрифугирования является ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Стадия уменьшения объема, например, способствует получению более высокого выхода вирусных антигенов и/или лучшего удаления ДНК клеток-хозяев.

В предпочтительном варианте осуществления объем можно уменьшать путем применения TFF ультрафильтрации или TFF ультрафильтрации и диафильтрации на одной стадии (TFF ультрафильтрация/диафильтрация), ультрацентрифугирования или осаждения, предпочтительно, для уменьшения объема используют TFF ультрафильтрацию. Вследствие этого, параметры каждого из применяемого, соответственно, способа концентрирования (TFF, TFF ультрафильтрация/диафильтрация, ультрацентрифугирование или осаждение) выбирают так, чтобы была достигнута указанная выше цель, то есть, уменьшение объема и концентрирование вирусных частиц. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения уменьшения объема достигают, применяя TFF ультрафильтрацию/диафильтрацию с использованием мембран с порогом отсечения 50-1000 кДа, предпочтительно мембран с порогом отсечения 100-300 кДа и предпочтительно не менее чем 50 кДа.

В одном варианте осуществления, если для уменьшения объема используют ультрацентрифугирование, условия ультрацентрифугирования могут, например, соответствовать 30000 g - 200000 g RCF в течение более чем 10 мин.

В одном варианте осуществления, если концентрирование проводят, используя осаждение, подходящие химические вещества известны специалисту в данной области и могут, например, представлять собой соль, метиловый и этиловый спирт, и полиэтиленгликоль в соответствующих концентрациях. Подходящие химические вещества в соответствующей концентрации осаждают продукт, например, частицы, содержащие вирусный антиген, но не оказывают или оказывают минимальный отрицательный эффект на указанные вирусные антигены. Химические вещества выбирают таким образом, что они не вступают в реакцию с нужными антигенами, например, вирусными антигенами, и не изменяют иммуногенность нужных антигенов.

Также предпочтительно, если стадию уменьшения объема на стадии c) не проводят с использованием метода центрифугирования в градиенте плотности, такого как ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы. Ультрацентрифугирование в градиенте является дорогостоящей и трудоемкой стадией способа, требующей высокого уровня обслуживания, и сама операция стоит дорого. Таким образом, за счет отказа от стадии ультрацентрифугирования в градиенте сам способ может быть усилен, например, с точки зрения снижения производственных расходов и трудозатрат.

В одном варианте осуществления коэффициент уменьшения объема составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5, или по меньшей мере 9, также предпочтительно по меньшей мере 12, также предпочтительно по меньшей мере 13, или по меньшей мере 15, и также предпочтительно по меньшей мере 20, или по меньшей мере 25. Типичный максимальный коэффициент уменьшения объема составляет 30, 35, 40 или 45. В настоящем изобретении было установлено, что уменьшение объема с коэффициентом, указанным в данном документе, особенно в сочетании с детергентом в концентрации, указанной ниже, дополнительно способствует повышению выхода вирусного антигена. Кроме того, если для размножения вируса используют систему на основе клеток, можно достичь неожиданно более существенного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев, например, уменьшения на по меньшей мере 2,5 log.

Эту концентрированную жидкость в уменьшенном объеме, содержащую частицы оболочечного вируса, непосредственно подвергают стадии солюбилизации. Вирусные антигены могут присутствовать в различных формах, таких как крупные частицы, или в агрегатах и/или прикрепленные к клеткам и клеточному дебрису, нитевидные формы вируса, неповрежденные и свободные сферические частицы вируса, вирусные фрагменты и свободные вирусные антигены, не связанные с вирусом. Стадию солюбилизации проводят для того, чтобы высвободить вирусные антигены из различных структур.

Солюбилизацию оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, проводят путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей или состоящей из катионного детергента, к жидкому продукту, полученному после стадии c). Катионные детергенты известны специалисту в данной области и имеют в основе катионы четверичного аммония, такие как цетилтриметиламмоний бромид или другие соли алкилтриметиламмония, соли алкиламина, такие как стеариламиноацетат или кокосовый алкиламиноацетат, бензалкония хлориды и бромиды, например, бензэтония хлорид или метилбензэтония хлорид, стеариламинполигликолевый эфир или олеиламинполигликолевый эфир, при этом CTAB (цетилтриметиламмоний бромид) является предпочтительным. Более предпочтительно, если используют смесь из по меньшей мере двух детергентов. Предпочтительно, смесь детергентов содержит или состоит из катионных и неионных детергентов. Предпочтительно, смесь детергентов содержит или состоит из катионного детергента, предпочтительно CTAB, и неионного детергента, такого как алкилполиэтиленоксид, алкилполигликозид, включая: октилгликозид и децилмальтозид, например, сурфактанты нонидет P10 или нонидет P40, MEGA-8, -9 или -10, Triton X 100 и родственные детергенты или полисорбаты, такие как детергенты семейства Tween, например, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, APO-10, APO-12, C8E6, C10E6, C12E6, C12E8, C12E9, C12E10, C16E12, C16E21, гептан-1,2,3-триол, люброл PX, семейство генаполов, n-додецил-b-D-глюкопиранозид, тезит, семейство плюроников и так далее; предпочтительно, используют полисорбат, такой как полисорбат 80.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения несколько детергентов добавляют в виде премикса (это означает, что они находятся в смеси) или добавляют отдельно, но одновременно или непосредственно один за другим. Предпочтительно не проводить замену детергентов, когда первый детергент удаляют, прежде чем добавить второй детергент.

Общее количество, то есть конечная концентрация катионного детергента(ов), предпочтительно CTAB, является высокой, это означает, что она выше, чем конечная концентрация, обычно используемая для целей солюбилизации. Таким образом, конечная концентрация составляет по меньшей мере примерно 2000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 2500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 3500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 4500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 5500 мкг/мл и также предпочтительно по меньшей мере примерно 6000 мкг/мл. Возможное максимальное количество катионного детергента(ов) составляет примерно 8000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 7000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 6000 мкг/мл. Особенно предпочтительными диапазонами являются примерно 4000 мкг/мл - примерно 6000 мкг/мл, примерно 4500 мкг/мл - примерно 6000 мкг/мл, примерно 4000 мкг/мл - примерно 5000 мкг/мл, примерно 4500 мкг/мл - примерно 5000 мкг/мл.

Общее количество, то есть конечная концентрация неионного детергента(ов), предпочтительно полисорбата, составляет по меньшей мере примерно 300 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 500 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 800 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 900 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1000 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1200 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1400 мкг/мл, также предпочтительно по меньшей мере примерно 1800 мкг/мл. Предпочтительное максимальное количество неионного детергента(ов) составляет примерно 4000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 3000 мкг/мл, также предпочтительно примерно 2000 мкг/мл. Особенно предпочтительными диапазонами являются примерно 300 мкг/мл - примерно 1500 мкг/мл, примерно 300 мкг/мл - примерно 1100 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл - примерно 1500 мкг/мл, примерно 900 мкг/мл - примерно 1200 мкг/мл.

В следующем варианте осуществления коэффициент уменьшения в объеме жидкого вирусного продукта составляет по меньшей мере 20 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 5000 мкг/мл, или коэффициент уменьшения в объеме продукта составляет по меньшей мере 15 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 4000 мкг/мл, или коэффициент уменьшения в объеме продукта составляет по меньшей мере 10 в присутствии конечной концентрации катионного детергента по меньшей мере 2500 мкг/мл. При применении данных условий можно достичь особенно полезных результатов с точки зрения выхода продукта. Кроме того, если для размножения вируса используют систему на основе клеток, в дополнение к повышенному выходу продукта можно добиться более существенного уменьшения примесей ДНК клеток-хозяев.

Солюбилизацию можно проводить в условиях, подходящих для достижения солюбилизации практически всех, предпочтительно всех вирусных частиц, присутствующих в концентрированном жидком продукте. В предпочтительном варианте осуществления солюбилизацию проводят путем инкубации концентрированного вирусного продукта в течение периода времени от 0,2 ч до 20 ч при температуре выше 0°C, предпочтительно при температуре от 2°C до 30°C, предпочтительно в течение периода времени от 0,5 ч до 6,0 ч при температуре 2-25°C, более предпочтительно при температуре 2-8°C.

При использовании для размножения вируса системы на основе клеток, предпочтительно не добавлять нуклеазу, например, ДНКазу, такую как бензоназа^®, до стадии d), или на протяжении всех стадий от a) до f). В способах предшествующего уровня техники жидкость, содержащую вирус, или жидкий продукт обрабатывают нуклеазой и/или β-пропиолактоном (BPL), и/или используют зональное ультрацентрифугирование, и/или выполняют стадии хроматографии, чтобы разрушить и/или удалить нуклеиновые кислоты клеток-хозяев, и, таким образом, свести к минимуму примеси ДНК клеток-хозяев. Например, в случае способов очистки вируса гриппа часто нужно добиться уменьшения более чем на 4 log количества ДНК клеток-хозяев для выполнения административных предписаний. В настоящее время неожиданно обнаружено, что путем применения способа по изобретению можно добиться достаточно большого уменьшения количества ДНК клеток-хозяев для выполнения административных предписаний, даже без обработки нуклеазой, например, обработки бензоназой^®. Это значительно усиливает способ с точки зрения экономической эффективности и времени. Кроме того, обработка BPL не требуется и ее можно ограничивать случаями, когда это желательно, если таковые имеются. В конкретных вариантах осуществления обработку BPL не проводят до стадии d), в некоторых вариантах осуществления обработку BPL не проводят совсем.

После стадии d) можно проводить стадию e) отделения вирусных ядер, полученных после стадии d), от композиции. Отделение вирусных ядер можно проводить любым подходящим методом, который приводит к указанному желаемому результату.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эту стадию отделения проводят путем осаждения вирусных ядер, например, ультрацентрифугированием (однако в предпочтительном варианте осуществления не ультрацентрифугированием в градиенте плотности). Вирусные поверхностные белки, например, белки (поверхностные) вируса гриппа, такие как HA, NA (нейраминидаза) или белок M, остаются в супернатанте и могут быть подвергнуты дальнейшим стадиям способа, чтобы в конечном итоге получить противовирусную субъединичную вакцину. Например, условия центрифугирования, выбираемые для осаждения вирусных ядер, известны специалисту в данной области. Например, ультрацентрифугирование можно проводить либо в периодическом режиме, либо в непрерывном режиме, и применяемые условия ультрацентрифугирования соответствуют от 30000 g в течение более чем 10 минут (мин) до 200000 g в течение более чем 10 мин, соответственно, при подходящей температуре, например, при 2-25°C, более предпочтительно при 2-8°C. В одном варианте осуществления условия ультрацентрифугирования для осаждения полученных вирусных ядер соответствуют 100000 g в течение 30 мин при температуре в диапазоне 2-8°C.

В следующем варианте осуществления после стадии d) и до стадии g) детергент из стадии d) можно удалять. Это удаление детергента можно выполнять любым способом, подходящим для этой цели, например, путем обработки амберлитом или TFF. При использовании обработки амберлитом, и после проведения стадии e), в предпочтительном варианте осуществления амберлит добавляют к супернатанту, собранному после осаждения вирусных ядер, при соотношении массы амберлита и массы катионных детергентов примерно 100:1, инкубируют при подходящей температуре, например, температуре в диапазоне 2-8°C, в течение подходящего времени, например, в течение 8-24, предпочтительно в течение 16 часов. Затем амберлит удаляют любым подходящим методом, известным специалисту в данной области, например, с использованием общепринятой проточной фильтрации/тупиковой фильтрации, сит или TFF. При использовании фильтра, его следует выбирать таким образом, чтобы он был способен удерживать частицы крупнее, чем 5 мкм или крупнее чем 7 мкм. Кроме того, амберлит можно удалять при помощи сит. Отверстия соответствующих сит находятся в диапазоне 30-200 мкм, предпочтительно менее чем 150 мкм, более предпочтительно менее чем 100 мкм, даже более предпочтительно примерно 50 мкм. В одном варианте осуществления для удаления детергента(ов) не используют хроматографию.

Наконец, на стадии g), которая является основной стадией очистки или основным способом очистки, соответственно, вирусный антиген очищают. В соответствии с настоящим изобретением, термин «вирусный антиген» означает часть вируса, предпочтительно оболочечного вируса, которая способна вызывать иммунный ответ у субъекта против указанного антигена. Предпочтительно, вирусный антиген представляет собой вирусный белок. Предпочтительно, вирусный мембранный белок представляет собой мембранный белок, такой как HA, NA или белок M, предпочтительно вирусный мембранный белок представляет собой HA и/или NA.

Очистку вирусного антигена можно проводить любым методом, подходящим для специфической очистки вирусного антигена из композиции, полученной после стадии e), или, в случае проведения стадии f), после стадии f). Предпочтительными методами очистки являются такие методы очистки, как хроматографические методы, например, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное. В одном варианте осуществления предпочтительными методами очистки являются ионообменная хроматография и хроматография гидрофобного взаимодействия.

Способ по настоящему изобретению можно использовать как часть общего производственного процесса получения противовирусного вакцинного препарата, предпочтительно противовирусной вакцины, более предпочтительно вакцины против вируса гриппа, такой как субъединичная вакцина.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу по настоящему изобретению, который используют в производстве вакцины, предпочтительно в производстве вакцины против гриппа. Произведенная вакцина может быть субъединичной вакциной.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу, описанному в данном документе, также включающему дополнительную стадию формулирования полученного очищенного вирусного антигена в фармацевтическую композицию, при этом, предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму. В особенно предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против гриппа. Эта дополнительная стадия(и) представляет(ют) собой стадию(и), которую, возможно, придется проводить для получения фармацевтической композиции. Такой стадией может, например, быть стадия инактивации вируса, такая как стадия облучения, например, стадия облучения УФ-C. Как правило, такая стадия гарантирует, что вирусный антиген является неактивным и свободным от активных загрязняющих вирусов. Чтобы свести к минимуму загрязнение микроорганизмами, например, может понадобиться проведение фильтрования для уменьшения микрофлоры. Кроме того, например, если вирусный антиген должен быть сформулирован в противовирусную вакцину, может случиться так, что потребуется добавлять адъювант(ы) в определенной концентрации. Еще одной дополнительной стадией может быть добавление дополнительного вирусного антигена, например, вирусного антигена, полученного из другого вирусного штамма. Еще одной дополнительной стадией может быть добавление буфера и/или включение консерванта. Еще одной дополнительной стадией может быть стадия осветления или стадия стерильной фильтрации.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «фармацевтическая композиция» означает композицию, которую можно принимать внутрь или использовать на поверхности тела для предотвращения, диагностики, облегчения, терапии или лечения заболевания у человека или животных. Предпочтительно, такая фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточный продукт, более предпочтительно, вакцинный препарат против оболочечного вируса, такой как вакцинный препарат против вируса гриппа, включая, например, сезонный, пандемический или эпидемический вакцинный препарат против вируса гриппа. Примерами пандемического или эпидемического вакцинного препарата против вируса гриппа являются вакцинные препараты против птичьего, человеческого или свиного вируса гриппа.

Настоящее изобретение также относится к применению способа производства вакцинного препарата, содержащего вирусный антиген из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, включающего следующие стадии в указанном порядке:

i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым получение концентрированного жидкого продукта, и

ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии а),

при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и

при этом уменьшение количества ДНК клеток-хозяев, присутствующих в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log, предпочтительно по меньшей мере 3,0 log, более предпочтительно по меньшей мере 3,5 log. Что касается терминов «вакцинный препарат», «вирусный антиген», «на основе клеток», «жидкий продукт», «оболочечный вирус» и «детергент», делается ссылка на спецификацию. Неожиданно было обнаружено, что благодаря использованию вышеуказанного способа в производстве вакцинного препарата загрязнение ДНК клеток-хозяев можно значительно уменьшить.

В предпочтительном варианте осуществления стадии i) и ii) соответствуют стадиям c) и d), определенным на протяжении всей спецификации.

В следующем варианте осуществления до стадии i) проводят стадии a) и b), определенные на протяжении всей спецификации, и после стадии ii) проводят стадии e) и f), определенные на протяжении всей спецификации.

Описание фигур

Фиг.1: На данной фигуре показан эффект концентрации CTAB и общего коэффициента концентрирования, то есть, конечной концентрации продукта после добавления детергента CTAB, на выход основного поверхностного антигена HA. Фиг.1 является примером многих результатов и графиков.

Фиг.2: На данной фигуре показан эффект концентрации CTAB и общего коэффициента концентрирования, то есть, конечной концентрации продукта после добавления детергента CTAB, на уменьшение количества ДНК. Фигура 2 является примером многих результатов и графиков.

Примеры

Пример 1

Данный пример демонстрирует, каким образом перевести собранный вирус гриппа в частично очищенный промежуточный продукт вирусных поверхностных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) с минимальной потерей продукта и с уменьшением более чем на три логарифма содержания ДНК клеток-хозяев. Полученный промежуточный продукт будет дополнительно очищен с помощью хроматографии.

Общий обзор стадий способа приведен в следующей далее схеме производственного процесса:

Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Собранные жидкости осветляли центрифугированием при 3220 g в течение 8 мин. Осветленный продукт концентрировали примерно в 4-13,7 раз при помощи TFF с использованием 100-300 кДа кассеты. Осветленный и концентрированный продукт солюбилизировали с помощью 2400-3000 мкг/мл CTAB и 600-900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленный, концентрированный и солюбилизированный продукт центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатант собирали. В собранный супернатант добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли фильтрованием суспензии через 5-мкм фильтры. Фильтрат представлял собой частично очищенный промежуточный продукт вирусных поверхностных антигенов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Количество HA определяли простой радиальной иммунодиффузией (SRD) и ДНК измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР).

Результаты представлены далее.

Выход HA из A/Uruguay X-175C, осветление при 3220 g в течение 8 мин, 10× концентрирование с использованием 300 кДа кассеты, солюбилизация при 900 мкг/мл Tween-80 и 3000 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 4×.

Образец HA [мкг/мл] Общий выход HA [%] Продукт 32   Фильтрат осветленного, 10× концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 4 120 92%

Выход HA из B/Malysia/2506/2004WT, условия осветления: 300 g в течение 2 мин, 4× концентрирование с использованием 100 кДа кассеты, солюбилизация при 600 мкг/мл Tween-80 и 2400 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 1,8×.

Образец HA [мкг/мл] Общий выход HA [%] Продукт 25 100% Осветленный и 4× концентрированный (100 кДа) продукт 93,5 94% Фильтрат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 1,8× 42 93%

Выход HA из A/California X-179A, условия осветления: 300 g в течение 2 мин, 13,7× концентрирование с использованием 100 кДа кассеты, солюбилизация: 900 мкг/мл Tween-80 и 3000 мкг/мл CTAB, центрифугирование при 100000 g в течение 30 мин и обработка продукта амберлитом. После поправки на разведение, произошедшее во время солюбилизации, общий коэффициент концентрирования составил 4,8×.

Образец HA [мкг/мл] Общий выход HA [%] ДНК [нг/мл] ДНК Log уменьшения Продукт 25 100% 72513 0 Осветленный и 13,7× концентрированный (100 кДа) продукт 292 85% 42187 1,4

Фильтрат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, центрифугированного, обработанного амберлитом продукта. Общий коэффициент концентрирования равен 4,8× 112 93% 53 3,8

Пример 2

Пример 2 демонстрирует, что антигены HA и NA фильтрата осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта можно в достаточной степени очищать ионообменной хроматографией, так что в нем общий белок (ОБ)/100 мкг HA составляет менее чем 240 мкг/100 мкг HA, и в нем ДНК клеток-хозяев составляет менее чем 20 нг/100 мкг HA. Антиген NA очищается вместе с антигенами HA.

Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Собранные жидкости осветляли центрифугированием при 300 g в течение 2 мин или 3220 g в течение 8 минут. Осветленные продукты концентрировали примерно в 10 раз при помощи TFF с использованием 300 кДа кассеты. Осветленные и концентрированные продукты солюбилизировали с помощью 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленные, концентрированные и солюбилизированные продукты центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатанты собирали. В собранные супернатанты добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли пропусканием суспензии через 5-мкм глубинные фильтры. Фильтрат кондиционировали перед нанесением на хроматографические колонки Capto^® Q. После промывания буфером для нанесения антигены HA и NA элюировали. Протекший через колонку буфер после промывания и элюат собирали по фракциям. На основании УФ-сигнала несколько фракций были выбраны для анализа HA-SRD, NA, ДНК, общего белка. Результаты приведены ниже.

Capto Q Штамм Проводимость нанесенного материала и буфера для уравновешивания pH нанесенного материала и буфера для уравновешивания Выход HA в собранных элюированных фракциях Общий белок, мкг/100 мкг HA ДНК, нг/100 мкг HA NA A/California X-179A 6 8 45% 104 4 Не измерено A/California X-175C 5 7,3 55% 208   Не измерено A/California X-179A 4,65 8 92% 225 ≥1 Присутствует A/California X-179A 3,6 8 91% 189 ≥1 Присутствует A/California X-179A 3,9 8 85% 189 ≥1 Присутствует

Как можно видеть, на выход HA из A/California влияла проводимость. Если проводимость находилась в диапазоне 3,6-4,65 мсек/см, выход HA составлял 85%-92%. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 80% в случае A/California. NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.

В случае A/Uruguay выход HA составлял 55%, если проводимость была 5 мсек/см при pH 7,3. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 50% в случае A/Uruguay. Антиген NA не измеряли. Содержание ОБ соответствовало спецификации для него. ДНК клеток-хозяев не измеряли. При понижении проводимости, как в случае A/California, выход HA для A/Uruguay, как ожидается, также увеличится.

Пример 3

Пример 3 демонстрирует, что антигены HA и NA фильтрата осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта можно в достаточной степени очищать хроматографией гидрофобного взаимодействия так, что в нем общий белок /100 мкг HA составляет менее чем 240 мкг/мл и содержание в нем ДНК клеток-хозяев составляет менее чем 20 нг/100 мкг HA. Антиген NA очищается вместе с антигенами HA.

Препарат осветленного, концентрированного, солюбилизированного, обработанного амберлитом продукта был таким же, как препарат в примере 2. Фильтрат кондиционировали перед нанесением на колонки для хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). После промывания буфером для нанесения, антигены HA и NA элюировали. Протекший через колонку буфер после промывания и элюат собирали по фракциям. На основании УФ-сигнала несколько фракций были выбраны для анализа HA-SRD, NA, ДНК, общего белка. Результаты приведены ниже.

HIC Штамм Концентрация соли в нанесенном материале и буфере для уравновешивания pH
нанесенного материала и буфера для уравновешивания Выход HA в собранных элюированных фракциях Общий белок, мкг/100 мкг HA ДНК нг/100 мкг HA NA A/California X-179A 2,3M 7,4 68% 152 19 Присутствует A/Uruguay
X-175C 2,6M 7,4 91% 88 15 Присутствует B/Malaysia 1,5M 7,4 73% 202 8 Присутствует B/Malaysia 1,7M 7,4 68% 118 15 Присутствует B/Malaysia 2,0M 7,4 71% 180 9 Присутствует

Как можно видеть, выход HA в случае A/California при использовании хроматографии гидрофобного взаимодействия составил 68%-91% в тестируемых условиях. Концентрация соли влияла на выход HA. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA может составлять примерно 60-80% в случае A/California. NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.

В случае B/Malaysia выход HA составлял примерно 70%, если используемая концентрация соли была 1,5-2,0M при pH 7,4. Принимая во внимание выход HA из препарата, наносимого на колонку на стадии хроматографии, на стадиях осветления, концентрирования, солюбилизации и обработки амберлитом, общий выход HA составлял 60% в случае B/Malaysia. Антиген NA очищался вместе с антигенами HA. Содержание ДНК и ОБ клеток-хозяев соответствовало спецификации для них.

Пример 4

Метод и материалы

Вирус гриппа размножали в клетках MDCK. Продукты осветляли центрифугированием при 300 g в течение 2 мин или 3220 g в течение 8 мин. Осветленные продукты концентрировали в различное количество раз при помощи TFF с использованием 100-300 кДа кассеты. Осветленные и концентрированные продукты солюбилизировали с помощью 600-3000 мкг/мл CTAB и 300-900 мкг/мл Tween-80 при 2-8°C. Осветленные, концентрированные и солюбилизированные продукты центрифугировали при 100000 g в течение 30 мин при 2-8°C. Супернатанты собирали. В собранные супернатанты добавляли амберлит при соотношении массы амберлита и массы CTAB, равном 100:1. После инкубации при 2-8°C в течение 16 ч добавленный амберлит удаляли пропусканием суспензии через 5-мкм глубинные фильтры. В фильтрате определяли количество HA-SRD (в анализе простой радиальной иммунодиффузии), проводили анализ на NA, ДНК и общий белок.

Пример 4.1

Данный пример демонстрирует, что сочетание высокого коэффициента концентрирования и высокой концентрации катионного детергента является предпочтительным как для выхода антигена, так и для удаления ДНК клеток-хозяев. Используемым штаммом был B/Brisbane. После осветления и концентрирования продукт инкубировали в присутствии детергентов при различных условиях. Варьировали концентрацию детергентов, время инкубации и коэффициенты концентрирования. Эффект концентрации CTAB и коэффициентов концентрирования на выход основного поверхностного антигена HA и уменьшение количества ДНК показан на фиг.1 и фиг.2. Как можно видеть, повышение концентрации катионных детергентов и коэффициента концентрирования является полезным как для выхода продуктов (фиг.1), так и для уменьшения количества ДНК клеток-хозяев (фиг.2).

Пример 4.2

Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из B/Florida/4/2006, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.

Образец и описание ДНК [нг/мл] ДНК, Log уменьшения SRD [мкг/мл] Выход HA Примечание Осветленный и 8,4× концентрированный продукт 26349   42     Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом 1 4,0 23 ≥95% 2,5× разведенный

Пример 4.3

Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/Wisconsin, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.

Образец и описание ДНК [нг/мл] ДНК, Log уменьшения SRD [мкг/мл] Выход HA Примечание Осветленный и 8,4x концентрированный продукт 32895   258     Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом 2 3,8 97 94% 2,5x разведенный

Пример 4.4

Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/Victoria, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.

Образец и описание ДНК [нг/мл] ДНК, Log уменьшения SRD [мкг/мл] Выход HA Примечание Осветленный и 10,2× концентрированный продукт 37417   185     Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом 5 3,5 87 ≥95% 2,5× разведенный

Пример 4.5

Данный пример демонстрирует, что как высокого выхода продукта из A/California, так и значительного уменьшения количества ДНК клеток-хозяев можно добиться путем использования 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween-80 с последующим центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин.

Образец и описание ДНК [нг/мл] ДНК, Log уменьшения SRD [мкг/мл] Выход HA Примечание Осветленный и 13,7× концентрированный продукт 42187   292     Солюбилизированный при 3000 мкг/мл CTAB и 900 мкг/мл Tween 80, центрифугированный и обработанный амберлитом 53 2,5 112 96% 2,5× разведенный

Настоящее изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложены способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса и применение этого способа в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген. Предложенный способ включает получение и осветление жидкости, содержащей оболочечный вирус, получение концентрированного жидкого продукта, солюбилизацию оболочечного вируса, находящегося в концентрированном жидком продукте, отделение вирусного антигена и его очитку. При этом после стадии получения концентрированного жидкого продукта непосредственно следует стадия солюбилизации оболочечного вируса, присутствующего в концентрированном жидком продукте. Стадия солюбилизации осуществляется путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент. Предложенный способ выделения позволяет получить высокий выход выделенного вирусного антигена при минимальном количестве стадий, при этом получаемый вирусный антиген имеет высокую чистоту. Предложенный способ получения вирусного антигена может быть использован в фармацевтической промышленности для получения вакцинного препарата. 2 н. и 26 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл., 4 пр.

1. Способ получения вирусного антигена из оболочечного вируса, включающий следующие стадии в указанном порядке:
a) обеспечение жидкости, содержащей оболочечный вирус,
b) осветление жидкости, содержащей указанный оболочечный вирус, приводящее к получению жидкого продукта, содержащего указанный оболочечный вирус,
c) уменьшение объема жидкого продукта, полученного после стадии b), для получения концентрированного жидкого продукта,
d) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии с), что приводит к распадению вирусных частиц на вирусные поверхностные белки и вирусные ядра,
e) отделение вирусных ядер от композиции, полученной после стадии d), и
f) необязательно, удаление катионного детергента из композиции, полученной после стадии е),
и
g) очистка вирусного антигена,
при этом за стадией с) непосредственно следует стадия d).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадию очистки, направленную на специфическую очистку оболочечного вируса, не проводят до стадии d).

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что единственную стадию хроматографии, которую проводят, проводят на стадии g).

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что ультрацентрифугирование в градиенте плотности и/или хроматографию не проводят до стадии d).

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что проводят стадию инактивации и/или стадию удаления вируса.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что коэффициент уменьшения объема на стадии с) составляет по меньшей мере 4, предпочтительно по меньшей мере 5.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что конечная концентрация катионного детергента составляет по меньшей мере 2000 мкг/мл.

8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что катионный детергент имеет в основе катионы четверичного аммония.

9. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что за стадией b) непосредственно следует стадия с), за которой непосредственно следует стадия d).

10. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что не происходит замены детергента.

11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что нуклеазу или другой расщепляющий ДНК фермент не добавляют до стадии d), предпочтительно, нуклеазу не добавляют на всех стадиях способа.

12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что оболочечный вирус выбран из группы, состоящей из оболочечных РНК вирусов, оболочечных ДНК вирусов или оболочечных ретровирусов, при этом оболочечные РНК вирусы включают флавивирусы, тогавирусы, коронавирусы, вирусы гепатита D, филовирусы, рабдовирусы, буньявирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы и аренавирусы, и оболочечные ДНК вирусы включают гепаднавирусы, вирусы герпеса и поксвирусы, предпочтительно, оболочечный вирус выбран из оболочечных РНК вирусов, более предпочтительно, оболочечный вирус представляет собой ортомиксовирус, наиболее предпочтительно вирус гриппа, такой как вирус гриппа А, В или С.

13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что жидкость на стадии а) получена из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток или культуры для размножения оболочечного вируса на основе яиц.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе клеток содержит клетки клеточной линии животного, предпочтительно клеточной линии млекопитающего.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что клетки культивируют как адгезивные клетки.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что культура для размножения оболочечного вируса на основе яиц включает куриные яйца.

17. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что жидкость на стадии а) получают с использованием одноразового биореактора.

18. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию b) проводят с применением метода, выбранного из группы, состоящей из центрифугирования, проточной фильтрации вдоль потока и глубинной фильтрации.

19. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию с) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из проточной фильтрации вдоль потока, ультрацентрифугирования и осаждения.

20. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию е) проводят, применяя метод, выбранный из группы, состоящей из ультрацентрифугирования и проточной фильтрации вдоль потока.

21. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что стадию g) проводят, применяя хроматографию, предпочтительно хроматографию, выбранную из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии.

22. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, отличающийся тем, что вирусный антиген представляет собой часть оболочечного вируса, предпочтительно вирусный антиген представляет собой вирусный белок.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что вирусный белок представляет собой НА и/или NA из вируса гриппа.

24. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16 или 23, включающий дополнительную стадию формулирования полученного вирусного антигена в виде фармацевтической композиции.

25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что фармацевтическая композиция представляет собой вакцинный препарат или его промежуточную форму, предпочтительно, фармацевтическая композиция представляет собой вакцину против гриппа.

26. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, 23 или 25, отличающийся тем, что стадия g) включает использование композиции, имеющей проводимость в диапазоне от равно или более чем 3,0 до менее чем 5,0 мсек/см, предпочтительно от равно или более чем 3,5 до равно или менее чем 4,7 мсек/см, даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 3,6 до равно или менее чем 4,65 мсек/см, в условиях температуры 25°C.

27. Способ по любому из пп. 1, 2, 14-16, 23 или 25, отличающийся тем, что стадия g) включает использование композиции, имеющей молярную концентрацию в диапазоне от равно или более чем 1,0 М до равно или менее чем 3,5 М, предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,0 М до равно или менее чем 3,0 М, более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 М до равно или менее чем 3,0 М, и даже более предпочтительно в диапазоне от равно или более чем 1,5 М до равно или менее чем 2,6 М, в условиях температуры 25°C.

28. Применение способа получения вирусного антигена, полученного из оболочечного вируса, в производстве вакцинного препарата, содержащего указанный вирусный антиген, где указанный способ включает следующие стадии в указанном порядке:
i) уменьшение объема жидкого продукта, содержащего оболочечный вирус, полученный из культуры для размножения оболочечного вируса на основе клеток, тем самым получение концентрированного жидкого продукта, и
ii) солюбилизация оболочечного вируса, присутствующего в жидком продукте, путем добавления детергента или смеси детергентов, содержащей катионный детергент, к концентрированному жидкому продукту, полученному на стадии i),
при этом за стадией i) непосредственно следует стадия ii), и
при этом уменьшение ДНК клеток-хозяев, присутствующей в вакцинном препарате, составляет по меньшей мере 2,5 log.