Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа Российский патент 2021 года по МПК A61K39/145 C12N7/04 A61P31/16 

Изобретение относится к медицине, иммунологии, фармакологии и касается производства инактивированных гриппозных вакцин, содержащих четыре вида антигенов для использования при вакцинации населения России против гриппа.

В настоящее время для вакцинации против гриппа используется два типа вакцин: «инактивированные» вакцины и «живые» вакцины. Инактивированные вакцины подразделяются на цельновирионные, расщепленные, субъединичные и виросомальные. Большая часть вакцин, представленных на мировом рынке инактивированных вакцин, занимают расщепленные. Это обусловлено тем, что такие вакцины обладают высокой иммуногенностью, как и цельновирионные вакцины, однако, их реактогенность существенно ниже цельновирионных вакцин. Субъединичные вакцины обладают очень низкой реактогенностью, однако, их иммуногенность уступает иммуногенности расщепленных вакцин для профилактики гриппа.

Известно несколько средств, предназначенных для профилактики гриппа, и способов производства этих средств.

Известны средство и способ получения расщепленных антигенов (RU 2283139, 10.09.2006), в их технологическом процессе для разрушения очищенных вирионов используют детергент β-октилглюкозид, а окончательная очистка антигенов осуществляется методом хроматографии на носителе Сефадекс-50 фирмы «GE» (Швеция). Инактивируют вирусную активность на стадии разведения вирусного концентрата методом облучения ультрафиолетом. Очистку вирионов проводят последовательной комбинацией метода сорбции-элюции на формализированных куриных эритроцитах и метода хроматографической очистки. Однако используемая технология очистки вирионов не позволяет воспроизводить параметры такой очистки из-за нестандартности куриных эритроцитов. Кроме того, описанный метод хроматографии не всегда эффективен для очистки вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с большим содержанием разрушенных клеток. Носитель Сефадекс-50, используемый на стадии окончательной очистки антигена, не эффективен для разделения гриппозных антигенов и овальбумина, вследствие неоптимального предела отсечения самого носителя. Инактивация с использованием ультрафиолетового облучения не всегда дает воспроизводимый результат, поскольку в случае высокоагрегированных вирусных концентратов не все вирусные частицы подвергаются действию облучения. Соответственно, средство обладает повышенным риском реактогенности у вакцинированных людей, а также опасностью остаточной инфекционности в готовой лекарственной форме вакцины.

Известны также (RU 2535153, 10.12.2014) средство и способ получения высокоочищенного вирусного концентрата с использованием методов обработки вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) полиэлектролитом ПЭГ 6000 для снижения процесса агрегации с последующей микрофильтрацией на 2 каскадах картриджей (диаметр пор 10 мкм и 1 мкм), ультрафильтрацией на кассетах с порогом отсечения 300 кДа и окончательной очисткой вируса в градиенте плотности сахарозы. Для дальнейшего производства инактивированных вакцин для профилактики гриппа из концентратов, полученных данным способом, необходима инактивация с использованием метода ультрафиолетового облучения, как и в предыдущем способе, что существенно снижает его привлекательность. В качестве электролита здесь используют раствор ПЭГ-6000 в достаточно высокой концентрации. ПЭГ-6000 безвреден и применяется в медицинской промышленности, однако, его стоимость высока, и с учетом тех количеств, которые используются для обработки ВАЖ, применение этого реагента существенно увеличивает себестоимость. Кроме того, с помощью данного известного способа можно получить только очищенный вирусный концентрат, а не лекарственную форму как таковой вакцины для профилактики гриппа. Для получения лекарственной формы вакцины необходим дополнительный блок технологии разрушения, выделения и очистки вирусных антигенов. При этом получаемое лекарственное средство будет обладать опасностью остаточной инфекционности в готовой лекарственной форме вакцины.

Известны вакцины против гриппа и способы их получения, описанные в RU 2493872, 27.09.2013; и RU 2523614, 20.07.2014.

Первый патент описывает средство и способ очистки вирусов гриппа с использованием микрофильтрации и ультрафильтрации (без использования формализированных куриных эритроцитов, ФКЭ). Для микрофильтрации используют картриджи с очень маленьким диаметром пор (0,45+0,22 мкм). Ультрафильтрацию проводят на кассетах с пределом отсечения 300-500 кДа. Очищенный таким образом вирус далее дополнительно очищается методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. В данном патенте не описан способ инактивации вируса гриппа, но из текста следует, что процесс инактивации будут проводить уже после стадии получения очищенного вирусного концентрата. Следует отметить, что использование в процессе микрофильтрации картриджей с диаметром пор 0,45+0,22 мкм, как правило, приводит к быстрому засорению картриджей при очистке ВАЖ, поскольку в результате размножения вирусов и разрушения клеток куриных эмбрионов в ВАЖ присутствует большое количество дебрисных культур различных размеров. Таким образом, из-за неоптимального размера пор срок эксплуатации вышеуказанных картриджей очень укорочен. И если засорение картриджей происходит в производственном процессе очистки ВАЖ, то их замена приводит к нарушению условий стерильности технологического процесса, что создает большие проблемы с логистикой. Поэтому лучше использовать картриджи с более крупными размерами пор для микрофильтрации ВАЖ. В частности, в RU 2535153 описано применение каскада картриджей с порами 10 мкм и 1 мкм, которые позволяют очищать от дебриса значительные объемы ВАЖ.

Во втором патенте, RU 2523614, описаны расщепленная вакцина против гриппа и способ ее получения с использованием методов осветления (центрифугирования), микрофильтрации, концентрирования, расщепления концентрата вируса гриппа с последующей ультрафильтрацией полученного вирусного лизата. Особенностью здесь является использование нейтральных или основных аминокислот, а также NaCl в концентрации 0,3-2,0 М в качестве стабилизаторов. Однако не указано, на какой стадии и каким способом производят инактивацию вирусной активности. Для расщепления очищенных вирионов здесь используют различные детергенты (катионные, анионные, и неионные). Однако далеко не все детегенты позволяют выделять антигены гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА) с полным сохранением их иммунокомпетентности. В частности, наиболее известный и доступный анионный детергент N-лаурилсаркозинат Na у некоторых серотипов вируса гриппа вызывает деструкцию гемагглютинина и резко снижает его антигенную и иммуногенную активность. Другой известный неионный детергент Тритон Х-100 является очень мягким для разрушения вирусов гриппа реагентом, однако, он очень плохо отделяется от выделенных антигенов в процессе их очистки. Поэтому выбор оптимального детергента для разрушения вируса является основной частью технологии производства современных гриппозных инактивированных вакцин. Кроме того, в данном известном патенте описаны способы стабилизации выделенных антигенов с использованием различных аминокислот в конечных концентрациях до 0,5 М, или же детергентом твином 80 до конечной концентрации до 0,2%.

Однако известно, что некоторые аминокислоты являются биологически активными веществами и в высоких концентрациях (до 0,5 М) могут быть реактогенными при массовой вакцинации людей. Кроме того, эти реагенты в случае применения на различных стадиях технологического цикла могут существенно увеличить себестоимость технологии.

Известна также вакцина для профилактики гриппа и способ ее получения по EP 3111953 A1, 06.10.2019, где описано, что WIV (целый вирус гриппа) или его антигены могут быть получены из межпандемных (однолетних или сезонных) штаммов гриппа. Альтернативно, WIV или его антигены могут быть получены из штаммов гриппа, способных вызвать вспышку пандемии. В зависимости от конкретного сезона и природы антигена, включенного в вакцину, WIV или его антигены могут быть получены из одного или нескольких следующих подтипов гемагглютинина: H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16. Предпочтительно, вирус гриппа или его антигены относятся к подтипам H1, H2, H3, H5, H7 и H9. WIV или его антигены также могут быть получены из одного или нескольких подтипов нейраминидазы: N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9. При этом WIV может содержать любую комбинацию подтипов гемагглютинина и нейраминидазы. WIV с определенной комбинацией H-и N-подтипов может использоваться индивидуально или в любой комбинации с одним или несколькими WIV, имеющими другие комбинации H - и N-подтипов.

При этом способ получения такой вакцины хорошо известен в данной области техники (см., например, серию технических докладов ВОЗ, № 927, 2005, Приложение 3 и другую документацию по адресу http://www.who.int/biologicals/vaccines/influenza/en/). Целые вирионы гриппа для WIV могут находиться в эмбриональных яйцах или в клеточных линиях, таких как, например, клетки Vero. Для инактивации целых вирионов гриппа В известны, например, химические средства инактивации, которые включают обработку эффективным количеством одного или нескольких из следующих агентов: моющие средства (например Тритон Х-100), формальдегид, формалин, БПЛ или мертиолят. Возможна также инактивация вируса с помощью ультрафиолета или гамма-облучения. Предпочтительно для инактивации целых вирионов гриппа в данном известном способе используют формалин (40% v/v формальдегид) или БПЛ (2-оксетанон).

В вакцине WIV по данной публикации также предпочтительно используют для повышения клеточного иммунного ответа, такого как CTL-ответ против антигена, предпочтительно с использованием пептида, содержащего эпитоп антигена в качестве иммуногена. Антиген может быть антигеном опухоли или инфекционного агента, например, вируса, такого, как вирус гриппа. WIV особенно подходит для повышения клеточного иммунного ответа против сохраненных, предпочтительно не подвергающихся поверхностному воздействию, эпитопов вирусов, таких как грипп.

Известна также противогриппозная вакцина по EP 2939692 A4, 06.07.2016. При этом композицию противогриппозной вакцины получают, используя инактивированный цельный вирус гриппа в качестве одобренного антигена, но без использования адъюванта, который проявляет высокую эффективность и низкие побочные эффекты. Данная композиция противогриппозной вакцины предназначена для спрей-введения в слизистую оболочку носа (что позволяет длительно сохранять ее в данной зоне) и содержит инактивированный цельный вирус гриппа и гелевый базовый материал, содержащий карбоксивиниловый полимер, который обрабатывают добавлением внешнего сдвигающего усилия для придания эффективности распыления. Причем он не содержит адъювант. Количество инактивированного цельного вируса гриппа в композиции составляет 1-500 мкг/мл на тип вакцинного штамма вируса.

Таким образом, данная композиция для введения в слизистую оболочку носа содержит инактивированный цельный вирус гриппа в качестве активного ингредиента, но не содержит адъювант, который индуцирует высокий иммунный ответ, несмотря на малый уровень антигена, и низкие побочные эффекты, поскольку композиция не содержит адъюванта.

Известна также расщепленная вакцина для профилактики гриппа и способ ее получения (CN 102068692 A, 25.05.2011), которые позволяют снизить дозировку антигена вируса гриппа и себестоимость производства вакцины, а также обеспечить быстрое улучшение возможностей поставки противогриппозной вакцины под угрозой глобальной пандемии. Каждая доза вакцины с расщепленным вирусом гриппа содержит три гемагглютинина и нейраминидазы гриппа, а именно H1N1, H3N2 и тип B, адъювант CpG ODN и алюминиевый адъювант. Способ получения вакцины включает стадии: размножение вирусов гриппа в курином эмбрионе; выполнение ультрафильтрации и концентрирования; центрифугирование и очистку; расщепление; выполнение вторичной очистки; инактивацию; разбавление и упаковку. Более конкретно, данный известный способ приготовления включает следующие этапы:

-Получение противогриппозной вакцины на курином эмбрионе: инокулируют вирусы гриппа H1N1, H3N2 и B-типа в 10-дневной здоровой куриной эмбриональной аллантоидной полости, увеличивая количество вирусов гриппа.

-Ультрафильтрационная концентрация: аллантоидные жидкости с вирусами гриппа H1N1, H3N2 и типа B собирали и концентрировали ультрафильтрацией с использованием ультрафильтрационной мембраны.

-Центробежная очистка: концентрированный ультрафильтрацией образец жидкости с вирусом гриппа был очищен центрифугированием с сахарозным градиентом.

-Лизис: очищенный вирусный раствор собирали и очищали с помощью Triton X-100 для получения лизатов вируса гриппа H1N1, H3N2 и B.

-Вторичная очистка: лизат вируса гриппа очищали центрифугированием с сахарозным градиентом, далее – вторичная очистка путем ультрафиолетового мониторинга.

-Инактивация: вторично очищенная жидкость с вирусом гриппа инактивируется формальдегидом.

Однако в данной известной публикации отсутствуют данные о достаточной химической стойкости данной вакцины и ее высокой иммуногенности.

Известны также вакцины из реассортантного вируса гриппа (WO 2010077986, 08.07.2010), для которых используют любой штамм вируса гриппа А и гриппа В. В одном варианте осуществления реассортантный вирус может иметь любую комбинацию из восьми генов от вируса гриппа А.

Кроме того, этот реассортантный вирус может иметь любую комбинацию из восьми генов от вируса гриппа В.

Такая усовершенствованная вакцина содержит реассортантный вирус, имеющий как вирусные структурные белки, гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НA), так и вирусные внутренние гены (PBl, PB2, PA, NS (NSl, NS2), Ml, M2 и NP), полученные из различных штаммов гриппа. Эти известные вакцины представляют собой вакцины, в которых вирусные внутренние гены получены из конкретного штамма гриппа, а гены ГА и HA получены из одного и того же штамма. Но штамм, из которого получены внутренние гены, является подтипом гриппа A или штаммом гриппа B, который отличается от подтипа гриппа A или штамма гриппа B, из которого получены гены HA и ГА.

Дополнительные предполагаемые антигены вирусов гриппа А и В включают, но не ограничиваются ими: A/Brisbane/59/2007 (HlNl); A/Brisbane/10/2007 (H3N2); B/Johannesburg/5/99; В/Виктория/504/2000; В/Сычуань/379/99; В/Пекин/184/93; B/Яманаши/166/98.

После получения аттенуированного вируса данную вакцину готовят стандартными методами. Вирус очищают с помощью стандартных методов, известных в данной области техники, например, с помощью хроматографии, высокоскоростного (ультра)центрифугирования или градиентов сахарозы.

Сплит-вакцины представляют собой убитые вакцины, полученные путем обработки вируса детергентом для солюбилизации белков в оболочке. В одном варианте осуществления неионные моющие средства используют для производства расщепленных вакцин. Примеры неионных детергентов включают: Нонаноил-N-Метилфукамид (Мега 9), Тритон Х-100, Октилглюкозид. Инактивированные вирусные вакцины получают путем инактивации собранного вируса и формулирования его с использованием известных методов для использования в качестве вакцины для индуцирования иммунного ответа у млекопитающего. Инактивация осуществляется с использованием агентов, включающих, но не ограничиваясь ими, формальдегид, УФ-облучение, БПЛ. Инактивирующие агенты применяют в концентрации, достаточно высокой для инактивации практически всех вирусных частиц в растворе. На стадии инактивации происходит очистка субъединиц и/или расщепление до или после очистки вируса от клеточной культуры.

Таким образом, данная известная вакцина против вируса гриппа содержит реассортантный вирус, имеющий ген ГА и ген НА из одного и того же подтипа вируса гриппа А или штамма вируса гриппа В, и внутренние гены из другого подтипа вируса гриппа А или штамма вируса гриппа В.

Однако ее производство является достаточно дорогим и длительным.

Из CN 104888212 A, 09.09.2015, известна субъединица вакцины для профилактики вируса гриппа и способ ее получения. Субъединичная вакцина вируса гриппа образуется путем дальнейшей очистки крекинговых вирусных белков с помощью крекинг-агента и нового способа очистки; каждый агент субъединичной вакцины содержит более 80% гемагглютинина гриппа типа H1N1, H3N2 и B и не содержит адъювант, тиомерсал или другие средства удаления коррозии. Способ получения такой вакцины включает стадии: инокуляцию вируса, культивирование, размножение вируса, сбор аллантоиновой жидкости, осветление, инактивацию, ультрафильтрацию и концентрирование, крекинг и сверхскоростную центробежную очистку, гель-фильтрацию, хроматографическую очистку, смешивание, фильтрационную стерилизацию, субпакетирование, упаковку и т.д.

При этом вакцина не содержит консервантов, таких как тиомерсал, что исключает возможность токсических побочных эффектов (контактный дерматит, аллергический конъюнктивит и ототоксичность).

При ее получении одновалентные исходные растворы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и B смешивают в соответствии с концентрацией гемагглютинина 1:1:1 и контролируют концентрацию гемагглютинина каждого типа вируса от 30 до 36 мкг/мл.

При проведении фильтрации и стерилизации вирусный раствор после смешивания на предыдущей стадии фильтруют через фильтр 0,22 мкм для получения субъединицы вируса гриппа вакцины.

Такая вакцина субъединицы вируса гриппа может улучшить безопасность, исключить неблагоприятные влияния, причиняемые адъювантом, и исключить токсические и побочные эффекты, причиняемые тиомерсалатом. Однако ее производство длительно и дорогостояще.

В публикации Theone C. Kon et al. (Influenza Vaccine Manufacturing: Effect of Inactivation, Splitting and Site of Manufacturing. Comparison of Influenza Vaccine Production Processes//PLoS One. 2016; 11(3): e0150700. Published online 2016 Mar 9. PMCID: PMC4784929, PMID: 26959983, doi: 10.1371/journal.pone.0150700, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) также представлена характеристика производства противогриппозной вакцины, проведено сравнение различных процессов производства противогриппозных вакцин. Показано, что процесс их производства в целом состоит из основных операций: инокуляция 11-дневных эмбриональных яиц вирусом гриппа (грипп A/H3N2 штамма A/Uruguay/716/2007 X-175C, Solvay Weesp, Нидерланды), инкубация инокулированных яиц в течение 72 ч при 35 °C и охлаждение в течение ночи до 2-7 °C. Аллантоисную жидкость собирали и осветляли центрифугированием. Осветленный результат использовали в качестве исходного материала и делили в равных количествах в течение шести различных процессов очистки. Чтобы обеспечить инактивацию формальдегидом, проводили зональное ультрацентрифугирование, в 60% сахарозы в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Для фракции, подлежащей инактивации БПЛ, проводили этап в 60% сахарозе в 125 мм натриевом цитратном буфере рН 7,8 (Invitrogen), поскольку индуцированная бета-пропиолактоном (БПЛ) инактивация требует более высокой буферной емкости для предотвращения значительного снижения рН.

Инактивацию формальдегидом (24 ч при 2-7°С) проводили при конечной концентрации 0,02% формалина, тогда как инактивацию на основе БПЛ (24 ч, 18-22°С) проводили при конечной концентрации БПЛ 0,1%.

Две полученные фазы разделяли центрифугированием. Часть фракций разделяли 1% Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich) в присутствии 500 мг/л Твина при перемешивании в течение 1 ч при 20°C, детергенты удаляли из фракций рециркуляцией через колонку (колонка XK50/20, GE healthcare), заполненную Amberlite™ XAD-4 (Sigma-Aldrich), при 20-25°C и линейном расходе 0,5 см/мин в течение 3-6 часов.

Удаление детергента контролировалось UV280 до тех пор, пока УФ-поглощение не переставало уменьшаться.

Все эти известные способы, хотя и описывают отдельные преимущества тех или иных компонентов состава противогриппозной вакцины, а также последовательности стадий ее получения, однако, не обеспечивают одновременно оптимальной иммуногенности, минимальной реактогенности, длительной стойкости вакцины при хранении в приемлемых условиях, а также снижения стоимости получения и ускорения технологического процесса.

В качестве аналогов предлагаемой четырехвалентной инактивированной вакцины могут быть рассмотрены импортные четырехвалентные вакцины против гриппа (Vaccine Excipient. Summary Excipients Included in U.S. Vaccines, by Vaccine, January 2019, https://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/B/excipient-table-2.pdf, дата обращения 04.10.2019):

-Fluarix, содержащая также TRITON X-100, α-токоферилгидрогена сукцинат, твин 80, гидрокортизон, гентамицина сульфат, овальбумин, формальдегид, деоксихолат натрия, изотонический раствор натрия хлорида в фосфатном буфере;

-Flublok, содержащая также натрия хлорид, моно- и диосновной натрия фосфат, твин 20, бакуловирус и клеточные белки Spodoptera frugiperda, клеточную ДНК, Triton X-100;

-Flucelvax, содержащая клеточные протеины MDCK, раствор фосфатного буфера, белок иной, чем гемагглютинин (ГA), клеточную ДНК MDCK, полисорбат 80, цетилтриметиламмония бромид, БПЛ, тимерозал;

-Flulaval, содержащая также овальбумин, формальдегид, деоксихолат натрия, α-токоферилгидрогена сукцинат, полисорбат 80, тимерозал, раствор фосфатного буфера;

-Fluzone, также содержащая формальдегид, яичный белок, октифенола этоксилат (Triton X-100), изотонический раствор натрия хлорида в фосфатном буфере, тимерозал;

-Fluzone, содержащая высокодозный яичный белок, октифенола этоксилат (Triton X-100), изотонический раствор натрия хлорида в фосфатном буфере, формальдегид;

-FluMist, содержащая глутамат натрия, гидролизованный желатин, аргинин, сукроза, моно- и двухосновный калия фосфат, овальбумин, гентамицина сульфат, этилендиаминотетрауксусную кислоту (EDTA).

Кроме того, в качестве прототипа может быть рассмотрена отечественная четырехвалентная инактивированная вакцина Гриппол® Квадривалент (ООО «НПО «Петровакс Фарм», Россия) - инактивированная субъединичная адъювантная вакцина (рег. номер ЛП-004951 от 23.07.2018 года, https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=df187e16-c6c8-4e25-996d-d24609d80ffe&t=, дата обращения 21.04.2020 г.). Содержит два штамма вируса гриппа типа А и два штамма обеих циркулирующих линий вируса гриппа В в количестве по 5 мкг каждого и иммуноадъювант полиоксидоний, показан к применению с 6 до 60 лет.

Однако, как видно из изложенного, все эти четырехвалентные вакцины, помимо антигенных компонентов, содержат целый ряд дополнительных ингредиентов, включая адъюванты и антибиотики, которые могут явно влиять на реактогенность готового медицинского препарата. Кроме того, в отечественной четырехвалентной вакцине Гриппол® Квадривалент содержится низкое количество антигенов (по 5 мкг), что не соответствует международным стандартам, согласно которым содержание каждого антигена должно быть по 15 мкг в дозе 0,5 мл (например, вакцина «Ваксигрип», PRODUCT MONOGRAPH VAXIGRIP® Inactivated Influenza Vaccine Trivalent Types A and B (Split Virion) Suspension for Injection Active Immunizing Agent for the Prevention of Influenza ATC Code: J07BB, August 2006).

В качестве прототипа способа получения предлагаемой нами вакцины рассмотрен известный способ получения противогриппозной инактивированной вакцины по RU 2584594 C1, 20.05.2016 (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России). Способ включает заражение куриных эмбрионов вирусом гриппа, инкубацию зараженных эмбрионов, охлаждение инкубированных эмбрионов. Затем проводят сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), ее обработку с целью дезагрегации и последующей инактивации, микрофильтрацию ВАЖ на 2 каскадах картриджей, ультрафильтрацию ВАЖ и очистку вирусного концентрата в градиенте плотности сахарозы. Проводят расщепление очищенного инактивированного вирусного концентрата с помощью детергента бета-октилглюкозида. Удаление недоразрушенных вирионов и комплексов рибонуклеопротеидов с мембранным белком проводят методом ультрацентрифугирования, окончательную очистку выделенных антигенов осуществляют на хроматографическом носителе. После этого в полученные антигены добавляют стабилизатор. Причем инактивацию вирусной активности проводят на стадии обработки ВАЖ с использованием дезинфектанта БПЛ, а дезагрегацию вирусов при обработке ВАЖ осуществляют хлористым натрием в конечной концентрации 0,22 М. Окончательную очистку антигенов проводят на хроматографическом носителе WorkBeads, 40/100/sec фирмы «Bio-works» (Швеция) и стабилизируют с использованием детергента Тритон Х-100 в концентрации 100-300 мкг/мл. Обеспечивается получение трехвалентной вакцины, антигенная активность которой превышает таковую вакцины «Ваксигрип®».

Однако получаемая данным известным способом вакцина является лишь трехвалентной (содержит два вида вируса типа А и один – типа В), не является оптимальным и качественный состав вакцины.

Для устранения вышеперечисленных недостатков нами предлагается четырехвалентная инактивированная расщепленная вакцина для профилактики гриппа и способ ее получения, для обеспечения эффективной иммунизации с длительным сохранением иммунитета против четырех типов вируса гриппа: двух типов вируса гриппа А – H1N1 и H3N2, и двух – типа В: линии Ямагата и линии Виктория, в которой концентрация гемагглютинина (ГА) для каждого типа доведенная до количества – не менее 30 мкг в дозе 0,5 мл. Кроме того, предлагаемый способ получения обеспечивает достаточную стойкость вакцины как медицинского препарата при ее хранении.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке новой технологии для производства и получения новой российской четырехвалентной инактивированной вакцины для профилактики гриппа.

Таким образом, получаемым техническим результатом является расширение спектра профилактики, при котором получаемая предлагаемым таким способом вакцина направлена одновременно против четырех видов гриппа типов А и В, при этом имеет высокую иммуногенность при сниженной реактогенности (высокой степени очистки антигенов вакцины) и стойкость сохранности иммуногенных свойств при надлежащих условиях хранения.

Для достижения указанного результата предлагается:

Способ получения противогриппозной вакцины, инактивированной, четырехвалентной, включающий получение антигенов вируса гриппа типа А: H1N1 и H3N2, и типа В: линии Ямагата и линии Виктория, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах,

где антигены состоят из разрушенных вирусных частиц и представляют собой смесь поверхностных и внутренних белков указанных вирусов гриппа,

для производства антигенов вируса гриппа проводят ряд следующих последовательных технологических стадий:

а) подготовка посевного материала,

б) культивирование вируса гриппа в развивающихся 10-12-дневных куриных эмбрионах до достижения заданной инфекционной активности,

в) сбор вируссодержащей жидкости и её инактивация в присутствии бета-пропилактона в конечной концентрации – не более 0,1 % по объему,

г) очистка вируса методом микро- и ультрафильтрации тангенциальным методом,

д) выделение вируса ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте при 90000-100000 g,

е) расщепление вируса с использованием неионного детергента октоксинола-10,

ж) очистка диафильтрацией для удаления детергента,

з) стерилизующая фильтрация моновалетного вирусного сбора (моновалент) через фильтр 0,22 мкм, промытый стерильным буферным раствором на основе полисорбата-80 (ПС-80),

и) формирование вакцины из четырех полученных моновалентов типов гриппа А: H1N1 и H3N2, и типа В: Ямагатской и Викторианской линий, до концентраций гемагглютинина для каждого типа – не менее 30 мкг/мл.

Предлагаемая нами вакцина зарегистрирована Минздравом России 19.06.2019 г, регистрационный номер ЛП-005594 и имеет название Ультрикс® Квадри Вакцина гриппозная четырехвалентная инактивированная расщепленная (официальная инструкция по применению (https://grls.rosminzdrav.ru/Grls_View_v2.aspx?routingGuid=34ce8c67-3095-4ccb-bc2a-43cfb4ddc73c&t=, дата обращения 21.04.2020 г).

Это усовершенствованная вакцина на базе ранее известной трехвалентной вакцины для профилактики гриппа Ультрикс®, имеющей в составе три набора антигенов вируса гриппа: два вышеупомянутых типа А и один – типа В (либо линии Виктория, либо линии Ямагата).

Получаемая данным способом четырехвалентная вакцина представляет собой раствор для внутримышечного введения и имеет состав для 1 дозы (0,5 мл):

Действующие вещества Антиген вируса гриппа типа A (H1N1) 15 мкг гемагглютинина (ГА) Антиген вируса гриппа типа A (H3N2) 15 мкг ГА Антиген вируса гриппа типа В (линия Yamagata) 15 мкг ГА Антиген вируса гриппа типа В (линия Victoria) 15 мкг ГА Вспомогательные вещества: Полисорбат 80 не более 250 мкг Октоксинол-10 не более 150 мкг Фосфатно-солевой буферный раствор до 0,5 мл.

При этом фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР) состоит из: натрия хлорида, динатрия гидрофосфата дигидрата, натрия дигидрофосфата дигидрата, воды для инъекций. То есть не содержит каких-либо иных компонентов, которые могли бы значимо повлиять на реактогенность и иммуногенность вакцины.

Патентуемая вакцина представляет собой бесцветную или слегка желтоватую прозрачную жидкость. Возможно наличие слабой опалесценции.

В качественном смысле вакцина представляет собой смесь протективных поверхностных и внутренних антигенов вирусов гриппа типа А (подтипы A(H1N1) и A(H3N2)) и типа В (линии Yamagata и линии Victoria) в фосфатно-солевом буферном растворе.

Данные антигены получают из очищенных вирусов гриппа типа А (подтипы A(H1N1) и A(H3N2)) и типа В (линии Yamagata и линии Victoria), выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах.

В плане иммунологических свойств данная вакцина формирует высокий специфический иммунитет против гриппа типов А и В. После вакцинации антитела появляются через 8-12 дней, иммунитет сохраняется до 12 месяцев. Ежегодная активная профилактическая иммунизация против сезонного гриппа показана людям в возрасте от 6 до 60 лет.

Особенно важно иммунизироваться лицам с высоким риском заболевания и возникновения осложнений в случае заболевания гриппом:

-лицам, часто болеющим острыми респираторными вирусными инфекциями;

-лицам, страдающим хроническими соматическими заболеваниями, в том числе болезнями и пороками развития сердечно-сосудистой, дыхательной и центральной нервной систем, хроническими заболеваниями почек, болезнями обмена веществ, сахарным диабетом, хронической анемией, аллергическими заболеваниями (кроме аллергии к куриным белкам), врожденным или приобретенным иммунодефицитом, в том числе инфицированным ВИЧ;

-лицам, по роду учебной или профессиональной деятельности имеющим высокий риск заболевания гриппом или заражения им других лиц: учащимся образовательных учреждений, студентам, работникам медицинских и образовательных учреждений, транспорта, коммунальной и социальной сфер, полиции, военнослужащим и т.д.

Противопоказаниями для иммунизации вакциной являются:

аллергические реакции на предшествующие прививки гриппозными вакцинами;

аллергические реакции на куриный белок и другие компоненты вакцины;

острые инфекционные и неинфекционные заболевания, обострение хронических заболеваний – прививки проводят через 2-4 недели после выздоровления или в период реконвалесценции или ремиссии.

При нетяжелых ОРВИ, острых кишечных заболеваниях вакцинацию проводят после нормализации температуры.

Кроме того, опыт применения гриппозных инактивированных вакцин показывает, что вакцинация женщин в период грудного вскармливания не оказывает токсического воздействия на ребенка.

Однако окончательное решение о вакцинации беременных и кормящих грудью женщин должно приниматься врачом индивидуально с учетом риска заражения гриппом и возможных осложнений, вызванных заболеванием гриппом. Наиболее безопасный период вакцинации беременных женщин – второй и третий триместры беременности.

Вакцинацию предлагаемой к защите вакциной проводят ежегодно в осенне-зимний период. Возможна вакцинация в начале эпидемического подъема заболеваемости гриппом.

Вводят вакцину внутримышечно в дозе 0,5 мл однократно в область дельтовидной мышцы (верхняя треть наружной поверхности плеча).

Не пригоден к применению препарат в шприцах/флаконах с нарушенной целостностью или маркировкой, при изменении физических свойств (цвета, прозрачности), при наличии в растворе посторонних частиц, при истекшем сроке годности, нарушении требований к условиям хранения.

Вскрытие шприцев/флаконов и проведение вакцинации осуществляют при строгом соблюдении правил асептики и антисептики. Препарат во вскрытых шприцах/флаконах хранению не подлежит.

Нежелательные явления с поражением органов и систем органов встречаются нечасто. Возможны головная боль, потливость, артралгия или миалгия, боль, гиперемия в месте инъекции, повышение температуры, озноб, слабость.

Указанные нежелательные реакции могут развиться в день вакцинации; обычно исчезают самостоятельно через 1-3 дня и не требуют лечения.

Несмотря на отсутствие клинических данных, нельзя исключить и возможность развития характерных для гриппозных вакцин неврологических расстройств и аллергических реакций (в том числе реакций немедленного типа на куриный белок и другие компоненты вакцины), о чем пациент должен быть своевременно проинформирован.

Вакцина может применяться одновременно с инактивированными и живыми вакцинами Национального календаря профилактических прививок (за исключением туберкулезных вакцин) и инактивированными вакцинами Календаря профилактических прививок по эпидемиологическим показаниям (за исключением антирабических). При этом должны учитываться противопоказания к каждой из применяемых вакцин; препараты следует вводить в разные участки тела разными шприцами.

Вакцина может вводиться на фоне базисной терапии основного заболевания. Вакцинация пациентов, получивших иммуносупрессивную терапию (глюкокортикостероиды, цитотоксические препараты, радиотерапия), может быть менее эффективной.

Вакцинальный препарат не влияет на способность управлять транспортом или заниматься другими потенциально опасными видами деятельности, требующими повышенной концентрации внимания и быстроты психомоторных реакций.

Выпускается в виде раствора для внутримышечного введения по 0,5 мл (1 доза) в шприцах из стекла с впаянной иглой с защитным колпачком или флаконах стеклянных, герметично укупоренных пробками резиновыми, завальцованных колпачками алюминиевыми или алюмопластиковыми. Упаковывается по 1 шприцу в контурной ячейковой упаковке, покрытой фольгой алюминиевой, бумагой или пленкой полимерной, по 1 или 10 контурных ячейковых упаковок в пачке из картона вместе с инструкцией по применению; по 1 или 10 флаконов в пачке из картона вместе с инструкцией по применению.

Хранить и транспортировать вакцину следует при температуре от 2 до 8°С, в недоступном для детей месте, не замораживать. Срок хранения составляет 1 год. Препарат с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Действующим веществом предлагаемой четырехвалентной инактивированной вакцины для профилактики гриппа являются антигены вируса гриппа типа А (H1N1 и H3N2) и типа В (линии Ямагата и линии Виктория), выращенные раздельно в развивающихся куриных эмбрионах. Антигены состоят преимущественно из разрушенных вирусных частиц и представляют собой смесь поверхностных и внутренних белков вируса гриппа.

Производственный процесс основан на системе посевных вирусов, и включает стадии up-stream (культивирование вируса, сбор вируссодержащей жидкости) и down-stream (очистка и концентрирование, выделение вируса гриппа с использованием ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, расщепление вируса гриппа, очистка и стерилизующая фильтрация).

Субстратом для производства и исходным сырьем являются развивающиеся (10-12-дневные) куриные эмбрионы (КЭ) с подтвержденным биологическим качеством. Куриные эмбрионы получают из птицеводческих хозяйств, благополучных по возбудителям, патогенным для человека. Качество КЭ подтверждается ветеринарными свидетельствами. Проверка возраста развивающегося КЭ проводится овоскопированием и экспертизой внешнего вида эмбриона. Инкубация и заражение куриных эмбрионов могут быть проведены, как описано в прототипе способа получения – в публикации RU 2584594 C1, 20.05.2016. Однако это никоим образом не ограничивает возможность использования и иных приемлемых при получении подобных вакцин методов инкубирования и заражения куриных эмбрионов.

Подготовка посевного материала.

Подготовка посевного материала ведется на основе высокопродуктивных реосортатных штаммов, которые приобретаются в рекомендованных ВОЗ центрах. Посевной вирусный материал готовится в асептических условиях путем культивирования на развивающихся КЭ с подтвержденным биологическим качеством до достижения необходимой инфекционной активности. Выбранные по титру гемагглютинина аликвоты посевного вирусного материала асептически разливаются в стерильные криопробирки и хранятся в жидком виде при температуре минус 70 °С. Посевной вирусный материал тестируется на специфичность, стерильность, токсичность, отсутствие микоплазм, микобактерий туберкулеза, посторонних вирусов.

Культивирование вируса

Культивирование вируса происходит на пред-инкубированных куриных эмбрионах, которые подверглись предварительной дезинфекции и хранились при контролируемой температуре. Перед заражением куриные эмбрионы повергаются сплошному овоскопированию. Рабочее разведение вируса (РРВ), используемое для заражения, готовится путем разведения из рассчитанного количества рабочего посевного вируса в стерильном буфере. Приготовленное РРВ инокулируется в каждый куриный эмбрион на автоматической машине заражения. После заражения куриные эмбрионы инкубируются в термальных комнатах при оптимальной температуре и времени для максимального получения вируса. После инкубации куриные эмбрионы подвергаются сплошному овоскопированию с использованием ручных овоскопов и охлаждаются при температуре от +2 до + 8 °С для последующего сбора ВАЖ.

Сбор ВАЖ и инактивация вируса

После охлаждения на автоматическом харвесторе из каждого куриного эмбриона происходит сбор ВАЖ в подготовленный стерильный реактор с охлаждением. Затем в реактор добавляется бета-пропилактон в конечной концентрации не более 0,1 %, содержимое реактора перемешивается в течение периода инактивации, который выбирается в зависимости от штамма вируса гриппа. Затем ВАЖ очищается от крупных частиц сепарированием и передается на стадию очистки и концентрирования.

Таким образом, на этапе up-stream применяется ранняя технологическая стадия, связанная с инактивацией вируса гриппа. Руководящие документы ВОЗ в отношении гриппозных вакцин (WHO Technical Report Series, No.927, 2005, Annex 3/Recommendation for the production and control of influenza vaccine (inactivated)) рекомендуют во избежание возможной контаминации использовать инактивацию как можно быстрее после получения моновалетного вирусного сбора (monovalent virus pool). В предложенном технологическом процессе инактивация выполняется раньше, на стадии получения вируссодержащей жидкости (single harvest) с использованием бета-пропилактона (синонимы: β-propiolactone; 2-oxetanone) (CAS № 57-57-8) в рекомендованной конечной концентрации – не более 0,1 % по объему.

Бета-пропилактон широко применяется в производстве вирусных инактивированных вакцин (см. 13th Edition Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases, a.k.a. the «Pink Book») и для гриппозных вакцин рекомендова WHO Technical Report Series, No.927, 2005, Annex 3/Recommendation for the production and control of influenza vaccine (inactivated)). БПЛ представляет собой алкилирующий агент, который реагирует со многими нуклеофильными соединениями, включая белки и нуклеиновые кислоты. Было показано, что БПЛ обладает необратимым воздействием для цепей ДНК и РНК, повреждая их и инактивируя вирусы. Точный механизм действия БПЛ до конца неизвестен и изучается в настоящее время.

Выбор бета-пропилактона среди других инактивирующих агентов (например, формальдегид) и способов инактивации (например, УФ-облучение) обусловлен теми обстоятельствами, что он в (1) минимальной степени, в отличие от формальдегида, влияет на матричные и поверхностные белки вируса гриппа, а также на конформационные свойства антигенных эпитопов гемагглютинина и нейраминидазы и позволяет сохранить иммунохимическую структура вируса гриппа при сохранении функциональных свойств гемагглютинина. Кроме того, (2) БПЛ в водных растворах при комнатной температуре в течение 3 часов полностью гидролизуется до безопасных гидроксипропионовых кислот и не требует нейтрализующего агента, в присутствии фосфатных буферов и дебриса гидролиз БПЛ происходит еще быстрее.

С точки зрения анализа рисков технологическая стадия инактивации является критической в отношении следующих критических показателей качества: специфическая безопасность и антигенные свойства гемагглютинина.

Подтверждение инактивации живого вируса гриппа проводится не только на каждой серии соответствующего моновалентного вируса сбора, но и в рамках испытания готовой вакцины путем испытания на специфическую безопасность фармакопейным биологическим методом с использованием куриных эмбрионов. Дополнительно, для изучения динамики инактивации вируса гриппа и получения оперативной информации, была разработана методика определения инфекционного титра вируссодержащей жидкости БПЛ. Установлено уменьшение инфекционного титра в среднем на 9 порядков с 109,0 ЭИД50/0,2 мл до отсутствия инфекционного титра в течение 60-90 минут после однократной обработки вируссодержащей жидкости БПЛ в концентрации 16 ммоль, как при комнатной температуре, так и при температуре от +2 до +8 °С. Зависимости динамики и времени инактивации от типа вирусов гриппа не обнаружено. Использование БПЛ в качестве инактивирующего агента на стадии получения вируссодержащей жидкости, в которой белки и дебрис находятся в нативной концентрации, а не сконцентрированы, как на стадии ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте (примерный коэффициент концентрирования около 1000), позволяет эффективно проводить инактивацию живого вируса гриппа за короткое время (известно, что стандартный протокол инактивации для вируса, сконцентрированного в градиенте сахарозы, составляет не менее 12 – 72 часов в зависимости от температуры). Последующие продолжительные по времени технологические стадии, связанные с микрофильтрацией и диафильтрацией, для которых используются большие количества промывочных буферных растворов (примерно от 1,5 до 3 объемов по отношению к объему первоначальной вируссодержащей жидкости), дают дополнительную гарантию полного гидролиза потенциальных остаточных количеств БПЛ до безопасных гидроксипропионовых кислот.

Подтверждение антигенных свойства гемагглютинина (НА) проводится методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД). В вируссодержащей жидкости концентрация НА составляет около 10 – 15 мкг/мл (в зависимости от штамма вируса гриппа), после инактивации концентрация НА также находится на этом же уровне. Для подтверждения сохранности функциональных агглютинирующих свойств НА определяется гемагглютинирующий титр вируссодержащей жидкости до и после инактвации. Титр НА вируссодержащей жидкости обычно составляет от 215 до 1024 ГАЕ (гемагглютинирующие единицы, в зависимости от штамма вируса гриппа), влияния инактивации на значение титра НА вируссодержащей жидкости не обнаружено.

Очистка и концентрирование

Очистка инактивированной ВАЖ проводится микрофильтрацией в тангенциальном потоке на фильтрующем элементе с мембраной 0,22 мкм с последующим концентрированием на установке ультрафильтрации на модулях 300-500 кДа. Использование метода тангенциальной фильтрации имеет преимущество по сравнению с тупиковой фильтрацией, так как позволяет на микрофильтрационных мембранах эффективно очистить большие объемы вируссодержащей жидкости от балластных и дебрисных веществ, снизить избыточную белковую нагрузку на последующей стадии ультрафильтрации и концентрирования. Концентрирование обычно происходит в 10-12 раз от исходного объема инактивированной вируссодержащей жидкости.

Выделение вируса

Выделение вируса гриппа происходит с использованием ультрацентрифугирования (около 90000 – 100000 g) в сахарозном градиенте, который концентрирует вирус в различных сахарозных фракциях в зависимости от плотности и формы вируса. В дальнейший технологический цикл отбираются градиентные целевые фракции, содержащие вирус гриппа (обычно 5 или 6 фракций по 100 мл). Целевые фракции выбираются и хранятся в жидком виде при температуре минус 20 °С.

Расщепление вируса

Целевые вирусные фракции размораживаются и обрабатываются детергентом. Для расщепления вируса гриппа был выбран мягкий неионный детергент октоксинол–10, который обеспечивает контролируемую солюбилизацию, максимально сохраняя нативность вирусных белков. Октоксинол–10 включен в ведущие мировые фармакопеи, разрешен для использования в производстве лекарственных средств. Использование октоксинола–10 в качестве детергента для расщепленных антигенов наиболее оптимально, так как этот детергент обладает не только хорошей солюбилизируюшей способностью в отношении гликопротеинов вируса гриппа, исключающей возможность наличия нерасщепленных вирионов, но и препятствует микроагрегации разрушенных вирусных частиц. Концентрация детергента выбирается в зависимости от штамма вируса гриппа. Для каждого нового штамма вируса гриппа и партии детергента проводятся испытания с использование электрофореза SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях, подтверждающие факт расщепления вируса после обработки детергентом.

Очистка и удаление детергента

Удаление детергента до регламентированных значений происходит диафильтрацией на модулях 300 кДа. Регламентированная концентрация октоксинола–10 в моновалентных вирусных сборах зависит от времени дифильтрации и используемого объема буфера.

Стерилизующая фильтрация

Стерилизующая фильтрация полученного продукта выполнятся в асептических условиях через фильтр 0,22 мкм, фильтр промывается стерильным буферным раствором, содержащим полисорбат 80 (далее – ПС 80). Выбор ПС 80 в качестве вспомогательного вещества в вакцинах обусловлен тем обстоятельством, что он является «золотым стандартом» в производстве не только гриппозных вакцин, но и вакцин для профилактики других заболеваний. ПС 80 входит в состав многих вакцина, таких как вакцины для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша, гриппа, вируса папилломы человека, гепатита В, японского энцефалита, полиомиелита, гемофильной инфекции типа b, пневмококковой инфекции, ротавирусной инфекции, ветряной оспы и опоясывающего лишая, менингококковой инфекции серогруппы В.

Использование ПС 80 в качестве вспомогательного вещества в формулировании белковых продуктов объясняется  его свойствами в отношении предупреждения агрегации протеинов на поверхностях воздух/вода/твердое тело. Он ингибирует межфазовые повреждения белковых молекул, вызванных механическим взаимодействием. Стабилизирующие свойства полисорбата вызваны оптимальным гидрофильно-липофильным балансом, сохраняющим в максимальной степени нативность выделяемых белковых компонентов. Широкая распространённость ПС 80, в том числе, в биологических препаратах, объясняется длительной историей его использования, большой степенью признания регулирующими органами из-за подтвержденной безопасности и включением в ведущие мировые фармакопеи. Для уменьшения риска потенциальных пирогенных реакций и снижения уровня бактериальных эндотоксинов, используемый в техпроцессе ПС 80 имеет дополнительный показатель качества по содержанию уровню эндотоксинов (менее 10 ЕД/мл).

Получение нерасфасованной вакцины

Процесс производства нерасфасованной вакцины представляет собой сведение моновалентов, соответствующих четырем вирусам гриппа типов А(H1N1), А (H3N3), В линии Yamagata и В линии Victoria. Для получения нерасфасованной вакцины рассчитанные количества моновалентов и стерильного фосфатного буфера загружают в реактор с охлаждением от 2-8 °С, перемешивают и отбирают пробы на содержание гемагглютинина и после получения удовлетворительных результатов содержимое реактора разливают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры типа Flexboy и отправляют на холодный склад при температуре от 2-8 °С.

Получение готового продукта

Готовую нерасфасованную вацкину в асептических условиях разливают в стерильные стеклянный преднаполненные шприцы или стеклянный флаконы и герметично укупоривают резиновыми бромбутиловыми пробками. Далее шприцы/флаконы направляются на автоматическую инспекционную машину, затем на этикетировку и упаковку. Упакованную вакцину отправляют на холодный склад при температуре от 2-8 °С.

Примеры осуществления описанного изобретения.

Пример 1. Получение моновалентного вирусного сбора вируса гриппа типа А(H1N1).

Для производства были использованы 150 000 пред-инкубированных куриных эмбрионов, которые подверглись предварительной дезинфекции и овоскопированию. На автоматической машине заражения каждый эмбрион был инокулирован рабочей дозой заражения штамма А(H1N1) - А/Brisbane/02/2018 (IVR-190) с инфекционным титром не менее чем 104,0 ЭИД50/0,2 мл. После заражения куриные эмбрионы были проинкубированы при температуре +35 °С (+/-1 °С) в течение 48 часов для максимального получения вируса. После инкубации куриные эмбрионы подверглись сплошному овоскопированию для выбраковки нежизнеспособных эмбрионов и помещены в холодильник при температуре от 2-8 °С на 12 часов.

После охлаждения на автоматическом харвесторе из каждого куриного эмбриона происходит сбор ВАЖ в объеме 1100 л в стерильный захоложенный реактор с последующим добавлением в вируссодержащую жидкость бета-пропилактона (CAS № 57-57-8) в конечной концентрации не более 0,1 % по объему. Содержимое реактора перемешивается в течение периода инактивации, который устанавливается предварительно в ходе валидационных испытаний. Затем ВАЖ очищается от крупных частиц сепарированием и передается на стадию очистки и концентрирования.

Очистка инактивированной ВАЖ проводится микрофильтрацией в тангенциальном потоке с последующим концентрированием на установке ультрафильтрации в 10-12 раз. Выделение вируса гриппа происходит с использованием ультрацентрифугирования в сахарозном градиенте, который концентрирует вирус в различных сахарозных фракциях. На высокоскоростную центрифугу (34000 об/мин) загружается 30 – 40 литров концентрированной инактивированной ВАЖ, после завершения процесса отбираются фракции в диапазоне 32 – 48 % сахарозы в количестве 500 мл, содержащие очищенный вирус гриппа. Выбранные фракции разводятся фосфатным буферным раствором до концентрации общего белка 1 мг/мл и обрабатываются октоксинолом-10 для получения максимального выхода гемагглютинина. Очистка и удаление детергента проводится методом диафильтрации с последующим концентрированием до получения 15 л очищенного моновалетного вирусного сбора. Полученный моновалетный вирусный сбор фильтруется в асептических условиях через фильтр 0,22 мкм, предварительно промытый стерильным буферным раствором, содержащим полисорбат 80, в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры типа Flexboy и помещается на хранение на склад при температуре от 2-8 °С. Готовый моновалетный вирусный сбор контролируется по показателям подлинность, содержание гемагглютинина, наличие нейраминидазы, факт расщепления вируса гриппа (фракционный состав), специфическую безопасность, стерильность, отсутствие микоплазм, отсутствие посторонних вирусов, бактериальные эндотоксины, овальбумин, общий белок, содержание октоксинола–10 и полисорбата 80.

Пример 2. Получение моновалентного вирусного сбора вируса гриппа типа А(H3N2).

Способом, описанным в примере 1, осуществляется получение моновалетного вирусного сбора штамма А(H3N2) за тем исключением, что в качестве агента заражения используется штамм А/Kansas/14/2017 NYMC X-327

Пример 3. Получение моновалентного вирусного сбора вируса гриппа типа B/Victoria/2/87 lineage.

Способом, описанным в примере 1, осуществляется получение моновалетного вирусного сбора штамма B/Victoria/2/87 lineage за тем исключением, что в качестве агента заражения используется штамм B/Maryland/15/2016 NYMC-BX-69а, после заражения куриные эмбрионы были проинкубированы температуре +32 °С (+/-1 °С) в течение 72 часов для максимального получения вируса.

Пример 4. Получение моновалентного вирусного сбора вируса гриппа типа В/Yamagata/16/88 lineage.

Способом, описанным в примере 3, осуществляется получение моновалетного вирусного сбора штамма В/Yamagata/16/88 lineage за тем исключением, что в качестве агента заражения используется штамм B/Phuket/3073/2013/wild type virus.

Пример 5. Получение готовой вакцины

Моновалентные вирусные сборы, полученные в примерах 1, 2, 3, 4 в рассчитанных количествах для получения 160 литров сведенной вакцины загружают в стерильный реактор с охлаждением, добавляют стерильный фосфатный буферный раствор, перемешивают и отбирают пробы на содержание гемагглютинина не менее 30 мкг/мл для каждого штамма вируса гриппа. После получения удовлетворительных результатов содержимое реактора разливают в стерильные пластиковые контейнеры типа Flexboy, и отправляют на автоматическую машину розлива в преднаполненные стерильные шприцы.

В асептических условиях, соответствующих GMP классу (А/В), вакцину дозируют в преднаполненные шприцы и герметично укупоривают резиновыми бромбутиловыми пробками. Наполненные и укупоренные пробками шприцы направляются на автоматическую инспекционную машину и далее на этикетировку и упаковку в блистеры и картонную пачку. Далее вакцина перемещается на холодный склад для хранения при температуре от +2 °С до +8 °С. Готовая вакцина контролируется по всем показателям качества нормативной документации.

Пример 6. Клиническое применение вакцины.

Для изучения переносимости, безопасности и иммуногенности четырехвалентной инактивированной расщепленой вакцины для профилактики гриппа в 2018 г были проведены клинические исследования с участием лиц в возрасте от 18 до 60 лет, одобренные Минздравом России в установленном порядке. В клиническом исследовании участвовало 240 человек, рандомизированных в две равноценные группы. Исследования проводились в: г. Самара, г. Пермь и Новосибирской области. Одна группа добровольцев была вакцинирована трехвалентной инактивированной расщепленной вакциной для профилактики гриппа Ультрикс®, содержащей по 15 мкг ГА/доза антигена вируса гриппа подтипа A(H1N1), подтипа A(H3N2) и типа В (всего 45 мкг/доза), вторая – четырехвалентной инактивированной расщепленной вакциной для профилактики гриппа, содержащей по 15 мкг ГА/доза антигена вируса гриппа подтипа A(H1N1), подтипа A(H3N2) и типа В (линий Victoria и Yamagata) (всего 60 мкг/доза). Вакцины не содержат консервантов и адъювантов. Наблюдение за вакцинируемыми проводилась в течение 28 дней.

Сравнительная оценка иммуногенности вакцин проводилась в соответствие с МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» по следующим показателям:

- фактор сероконверсии - повышение средних геометрических титров антител на 28-31 сутки по сравнению с исходным уровнем, выражается в кратности увеличения (целевое значение ≥ 2,5);

- уровень сероконверсии - процент добровольцев, у которых титр антител повысился более, чем в 4 раза по сравнению с исходным уровнем (целевое значение ≥ 40 %);

- уровень серопротекции - процент добровольцев, у которых образовался защитный титр (не менее 1:40) антител по сравнению с исходным уровнем;

- средний геометрический титра антител (СГТ) в сыворотках крови привитых в РТГА (целевое значение ≥ 70 %).

Использовали реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) для исследования парных сывороток привитых людей, взятых в день иммунизации и спустя 28 дней.

На 28 сутки после однократной иммунизации добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет четырехвалентной инактивированной расщепленной вакциной наблюдалась следующая картина:

- уровень сероконверсии к штаммам вируса гриппа А/(H1N1) – более 76 %, А/(H3N2) – более 76 %, В (линия Victoria) – более 78 %, В (линия Yamagata) – более 78 %; процент лиц, имевших защитный уровень антител (серопротекция) к А/(H1N1) составил более 99 %, к А/(H3N2) – более 87 %, к В (линия Victoria) – более 72 % и В (линия Yamagata) – более 90 %; фактор сероконверсии на 28 сутки после однократной вакцинации к А/(H1N1) составил 13,9, к А/(H3N2) – 15,9, к B (линия Victoria) – 17,6 и к В (линия Yamagata) – 16,4.

Исследования сывороток крови добровольцев, полученных на 28 сутки после вакцинации, в РТГА показали увеличение титра антител у всех привитых добровольцев, независимо от исходного титра до вакцинации. Прирост антител к вирусам гриппа всех типов после вакцинации изучаемой вакциной и препаратом сравнения происходил сходным образом, что свидетельствовало о сопоставимости интенсивности иммунного ответа у сравниваемых препаратов. В целом результаты, полученные при изучении уровня антител на 28 сутки после вакцинации, свидетельствуют о выраженной активации иммунной системы в обеих группах вакцинированных.

Оценка переносимости вакцины проводилась в первые 2 часа и далее на протяжении всего исследования после вакцинации для выявления нежелательных явлений или серьезных нежелательных явлений у всего привитого контингента. Общая реакция на введение вакцины оценивалась по температурной реакции, нарушению общего состояния (ухудшение самочувствия, головная боль, тошнота и пр.), а также на основе симптомов, характерных для течения гриппа (гиперемия слизистых ЛОР-органов, насморк, кашель и пр.). За весь период наблюдения у вакцинируемых, привитых четырехвалентной инактивированной вакциной было выявлено 8 нежелательных явлений (боль, гиперемия, отечность в месте введения и головная боль). Серьезные нежелательные явления отсутствовали у всего контингента прививаемых лиц.

Данные, полученные в исследовании, подтверждают хорошую переносимость, высокий профиль безопасности и выраженные иммуногенные свойства предлагаемой вакцины в сравнении с зарегистрированной в РФ вакциной Ультрикс®.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии и фармакологии, и предназначено для производства инактивированной четырехвалентной гриппозной вакцины. Инактивированная четырехвалентная вакцина против гриппа содержит антигены вируса гриппа типа А: H1N1 и H3N2, и типа В: Ямагатской и Викторианской линий. Способ ее производства включает получение антигенов вируса гриппа типа А: H1N1 и H3N2, и типа В: Ямагатской и Викторианской линий, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах. Антигены состоят из разрушенных вирусных частиц и представляют собой смесь поверхностных и внутренних белков указанных вирусов гриппа. Для производства антигенов проводят ряд заявленных последовательных технологических стадий. Использование изобретения позволяет повысить иммуногенность вакцины при сниженной реактогенности, получая таким образом препарат с высокой степенью очистки антигенов вакцины, а также увеличить стойкость сохранности иммуногенных свойств при надлежащих условиях хранения. 1 табл., 6 пр.

Способ получения четырехвалентной инактивированной расщепленной вакцины, включающий получение антигенов вируса гриппа типа А: H1N1 и H3N2, и типа В: Ямагатской и Викторианской линий, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах,

где антигены состоят из разрушенных вирусных частиц и представляют собой смесь поверхностных и внутренних белков указанных вирусов гриппа,

для производства антигенов вируса гриппа проводят ряд следующих последовательных технологических стадий:

а) подготовка посевного материала,

б) культивирование вируса гриппа в развивающихся 10-12-дневных куриных эмбрионах до достижения заданной инфекционной активности,

в) сбор вируссодержащей жидкости и её инактивация в присутствии бета-пропилактона в конечной концентрации – не более 0,1 % по объему,

г) очистка вируса методом микро- и ультрафильтрации тангенциальным методом,

д) выделение вируса ультрацентрифугированием в сахарозном градиенте при 90000-100000 g,

е) расщепление вируса с использованием неионного детергента октоксинола-10,

ж) очистка диафильтрацией для удаления детергента,

з) стерилизующая фильтрация моновалетного вирусного сбора (моновалент) через фильтр 0,22 мкм, промытый стерильным буферным раствором на основе полисорбата-80 (ПС-80),

и) формирование вакцины из четырех полученных моновалентов типов гриппа А: H1N1 и H3N2, и типа В: Ямагатской и Викторианской линий, до концентраций гемагглютинина для каждого типа – не менее 30 мкг/мл.