Изобретение относится к вирусологии, в частности к производству вакцинных препаратов, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промышленности.
Согласно требованию ВОЗ содержание клеточной ДНК в вакцинах, приготовленных на основе вирусных сборов, в частности, с перевиваемых клеточных линий жестко лимитировано величиной 100 пг на дозу для исключения потенциальной возможности ее онкогенного и трансформирующего действия.
Известен способ получения инактивированной вакцины к вирусу гепатита А на перевиваемой линии почек зеленой мартышки 4647. Вирус гепатита А (штамм HAS-15) адаптируют в течение 3-х пассажей к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647. Вируссодержащую жидкость используют в качестве инокулята для массового заражения монослоя тех же клеток в матрасах и роллерных флаконах. Вирус культивируют при 37°С в течение 20 дней с ежедневной сменой среды. Вируссодержащую надклеточную жидкость, полученную при сменах среды, замораживают. Суспензию клеток по окончании инкубации обрабатывают ультразвуком и ВГА дважды экстрагируют хлороформом. Водные фазы объединяют с вируссодержащей надклеточной жидкостью и концентрируют в 100 раз в системе тангенциального потока. Клеточную ДНК вирусного концентрата удаляют обработкой ДНКазой II. Очистку проводят на колонках с ДЕАЕ-серофазой 6В макропористым стеклом и биогелем Р-2. Вируссодержащие фракции объединяют, вирус инактивируют формалином (1:4000) и сорбируют на гидроокиси алюминия (Авторское свидетельство СССР №1389059, МПК А61К 39/29, заявлено 04.09.1986).
Недостатком данного способа является его сложность и длительность цикла получения вакцины, а также большие потери вирусного антигена в процессе его очистки (до 70,0-90,0%). Для удаления ДНК используют фермент дезоксирибонуклеазу. Препараты ДНКазы отечественного производства содержат примеси протеаз и неспецифических нуклеаз, а очищенные препараты зарубежного производства малодоступны и догоростоящи. Кроме того, обработка ДНКазой не дает 100% гарантии разрушения клеточной ДНК, необходимы контроль активности, специфичности и чистоты ДНКазы и количества остаточной клеточной ДНК в препаратах. Последний осуществляют методом гибридизации - сложным, трудоемким, дорогостоящим и требующим аттестованных помещений для работы с радиоактивными изотопами.
Известен способ получения вакцины против вируса гепатита А на диплоидной культуре клеток фибробластов человека. Изолят ВГА адаптируют в течение первых пассажей к первичной культуре клеток почки эмбриона человека, а затем этот штамм переадаптируют к диплоидной культуре клеток фибробластов человека. При переадаптации ВГА к культуре клеток фибробластов человека на первых пассажах вирус размножается очень медленно. Увеличение скорости роста достигается многократными пассажами. Полученный вирусный антиген после соответствующей очистки и инактивации инфекционной активности используют в качестве вакцины для человека и животных (патент США №4506016, МПК С12 7/08, опубл.1985).
Однако известный способ не может быть использован для производства вакцины в промышленных масштабах, предусматривает проведение не менее 10 пассажей вируса на клетках почки эмбриона человека и переадаптацию к клеткам фибробластов в течение 50-75 пассажей. Кроме того, использование известного способа связано с риском заражения персонала, так как приготовление вакцины осуществляют от начала и до конца с живым вирусом.
Известен способ получения инактивированной вакцины против гепатита А, включающий размножение вируса штамма HAS-15 в диплоидной культуре клеток фибробластов человека Л-68 с последующим разрушением клеток, очисткой антигена молекулярно-ситовой хроматографией или ультрацентрифугированием в градиенте CsCl, концентрированием, инактивацией и сорбцией на носителе (патент РФ №1672635, МПК А61К 39/29, опубликован 30.01.1994). При этом способ значительно упрощается, сокращается технологический процесс получения вакцины, которая безопасна в онкогенном отношении и не требует специальной очистки от клеточной ДНК.
Однако указанный способ имеет низкую производительность и не пригоден для производства вакцины в промышленных масштабах, т.к. диплоидная культура клеток фибробластов человека Л-68 имеет ограниченный ресурс размножения (не более 25 пассажей) и низкую продуктивность по вирусному антигену гепатита А.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ приготовления инактивированной вакцины против вируса гепатита А, включающий выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии, лизис клеток обработкой ультразвуком, осветление вируссодержащей жидкости центрифугированием, концентрирование ее ультрацентрифугированием в слое сахарозы и доочистку вирусного продукта от клеточной ДНК и других примесей раствором макромолекулярного поликатиона (протаминсульфат) с последующим повторным осветлением вирусной фракции центрифугированием или хроматографией, инактивирование ее раствором формальдегида и сорбцию на гидроокиси алюминия (авторское свидетельство СССР №1532050, МПК А61К 39/00, опубл. 1989).
Однако в способе-прототипе наблюдаются высокие потери вирусного антигена (до 60,0-80,0%) вследствие неполного лизиса клеток ультразвуком и использования для удаления клеточной ДНК и других примесей протаминсульфата. Протаминсульфат осаждает не только ДНК, рибосомные нуклеиновые кислоты, мРНК, тРНК, но и частично на образовавшемся осадке адсорбируются вирусные белки. Кроме того, использование известного способа связано с риском заражения персонала, так как приготовление вакцины осуществляется от начала и до конца с живым вирусом.
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в увеличении выхода вирусного антигена в несколько раз и повышение иммуногенной активности вакцины, а также в том, что в одном из вариантов реализации способа уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала.
Технический результат достигается тем, что в способе получения инактивированной вакцины против гепатита А, включающем выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии, лизис клеток, осветление вируссодержащей жидкости центрифугированием, концентрирование ее ультрацентрифугированием в слое сахарозы и доочистку вирусного продукта раствором макромолекулярного поликатиона с последующим повторным осветлением вирусной фракции центрифугированием и сорбцию на гидроокиси алюминия, причем инактивирование вирусного антигена проводят на одном из этапов его получения, согласно изобретению лизис клеток осуществляют раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере, а в качестве макромолекулярного поликатиона для доочистки вирусного продукта используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%.
Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа.
Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%, причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С.
Инактивирование вирусного антигена раствором формальдегида проводят сразу после лизиса клеток неионным детергентом или перед сорбцией вирусного антигена на гидроокись алюминия. При инактивировании вирусного антигена после лизиса клеток уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала.
Инактивирование вирусной фракции раствором формальдегида осуществляют при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С.
Экспериментально установлено, что при лизисе клеток неионным детергентом Твин 80 и осаждении клеточной ДНК из вируссодержащей суспензии сульфатом стрептомицина (вместо протаминсульфата) потери вирусного антигена сокращаются в несколько раз.
Лучшие варианты выполнения способа
Вариант 1. Описание способа получения вакцины при инактивировании антигена в конце технологического цикла. Способ получения инактивированной вакцины против гепатита А включает выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии и лизис клеток раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере. Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа. Вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием, а концентрирование осветленного продукта ультрацентрифугированием в слое сахарозы. Доочистку продукта производят раствором макромолекулярного поликатиона, в качестве которого для удаления клеточной ДНК используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%. Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%. Причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С. Далее повторно осветляют вируссодержащую фракцию центрифугированием с последующим инактивированием надосадочной жидкости раствором формальдегида. Инактивирование вирусной фракции раствором формальдегида осуществляют при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С. Полученную вирусную субстанцию сорбируют на гидроокиси алюминия.
Вариант 2. Описание способа получения вакцины при инактивировании антигена в начале технологического цикла. Способ получения инактивированной вакцины против гепатита А включает выращивание вируса на клетках перевиваемой клеточной линии и лизис клеток раствором неионного детергента Твин 80 в фосфатно-солевом буфере. Неионный детергент Твин 80 используют в виде 1%-ного раствора в 0,01М фосфатно-солевом буфере при рН 7,6, а лизис клеток осуществляют в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 1 часа. Далее вируссодержащую жидкость инактивируют раствором формальдегида при его концентрации 0,1 мас.% в течение 14 суток при 37°С. Инактивированную вируссодержащую жидкость осветляют центрифугированием, а концентрирование осветленного продукта осуществляют ультрацентрифугированием в слое сахарозы. Доочистку продукта производят раствором макромолекулярного поликатиона, в качестве которого для удаления клеточной ДНК используют раствор сульфата стрептомицина в конечной концентрации в обрабатываемом продукте не более 1,0 мас.%. Сульфат стрептомицина используют в виде 25,0%-ного раствора в конечной концентрации в обрабатываемом вируссодержащем продукте 0,5 мас.%. Причем указанную смесь выдерживают в течение 15 минут при 4°С. Далее повторно осветляют вируссодержащую фракцию центрифугированием. Полученную вирусную субстанцию сорбируют на гидроокиси алюминия.
Пример 1. Реализация способа получения вакцины против гепатита А, инактивацию вируса в котором осуществляют в конце технологического цикла. Для получения вакцины вируса гепатита А (ВГА) имеется банк с производственным штаммом ЛБА-86 - HAS 15/4647 (ПШ), полученным из ИПВЭ РАМН, из которого в дальнейшем создается банк с посевным вирусом (ПВ) первого и второго пассажа.
Производственный штамм хранят при температуре от минус 18 до 20°С.
Посевной вирус 1-го пассажа получают путем заряжения культуры продуцента перевиваемых клеток 4647 посевным штаммом ВГА. Для культивирования используют среду MEM Игла с добавлением 2% сыворотки плода коров и 1% сыворотки новорожденных телят. Инкубацию осуществляют при 37°С. Срок культивирования составляет 14 суток со сменой среды через 7 суток. Посевной вирус 1-го пассажа представляет собой обломки клеток, содержащие ВГА, образовавшиеся в результате пятикратного оттаивания-замораживания вируссодержащих клеток. В полученном вируссодержащем материале методом ИФА определяют содержание вирусного антигена и инфекционный титр.
Для получения вируссодержащей жидкости для вакцины используют посевной вирус второго пассажа. Посевной вирус второго пассажа представляет собой разрушенные замораживанием-оттаиванием клетки с вирусом в культуральной жидкости. Посевной вирус 2-го пассажа получают путем заражения культуры продуцента посевным вирусом 1-го пассажа. Для культивирования используют среду MEM Игла с добавлением 2% сыворотки плода коров и 1% сыворотки новорожденных телят. Срок культивирования составляет 7 суток. Посевной вирус второго пассажа хранят при температуре от минус 18 до минус 20°С.
Для получения вируссодержащей суспензии используют посевной вирус 2-го пассажа, инфекционный титр которого должен быть не ниже 105,5 ТкИД50/см3. Посевной вирус разводят средой Игла MEM до концентрации, обеспечивающей множественность заражения 0,01-0,1 ТкИД50/кл. Инкубацию осуществляют в течение 14 сут со сменой среды через 7 сут. По окончании инкубации культуральную жидкость удаляют, клетки, содержащие вирус, диспергируют 0,02% раствором Версена с добавлением 0,01% химопсина.
Клетки собирают в минимальном объеме раствора Версена с добавлением 5% сыворотки крови плода коров и передают для очистки и концентрирования ВГА.
Далее суспензию клеток центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С и к осадку клеток добавляют пять объемов (по отношения к объему осадка) лизирующего раствора (1%-й раствор неионного детергента Твин-80 в 0,01М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,6), подогретого до 37°С. Лизис клеток проводят при 37°С в термостатированном шейкере в течение 1 часа. Клеточный лизат освобождают от ядер центрифугированием при 1700×g, в течение 10 мин при температуре 4°С. Надосадочную жидкость осветляют центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрацентрифугирования, пропуская его через трехслойную сахарозную подушку, состоящую из 10, 20 и 30% пятимиллилитровых слоев сахарозы, используя ротор SW-28 на ультрацентрифуге "Beckman" в течение 12 часов при 80000×g. К полученному первичному концентрату вируссодержащей жидкости приливают раствор 25%-го сульфата стрептомицина до конечной концентрации 0,5% при перемешивании и выдерживают 15 мин при температуре 4°С. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С на роторе SA-20. Осадок отбрасывают.
Для сбора очищенного ВГА из буферного раствора, содержащего 1% Твин 80, супернатант наслаивают на 8 мл 20%-й сахарозы и центрифугируют при 80000×g в течение 12 часов и 4°С. Осадок перерастворяют в 0,01М ФСБ. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С, затем концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный вирусный концентрат инактивируют в присутствии 0,1%-го формальдегида в течение 14 суток при 37°С. После проверки препарата на полноту инактивации (специфическую безвредность) полуфабрикат вакцины сорбируют на геле алюминия гидроксида, доводят до конечного объема и разливают по ампулам или флаконам.
Пример 2. Реализация способа получения вакцины против гепатита А, инактивацию вируса в котором осуществляют в начале технологического цикла. Вируссодержащие клетки после культивирования, проводимого так же, как в примере 1, собирают в минимальном объеме раствора Версена с добавлением 5% сыворотки крови плода коров и передают для очистки и концентрирования ВГА.
Далее суспензию клеток центрифугируют при 3000 об/мин при 4°С и к осадку клеток добавляют пять объемов (по отношения к объему осадка) лизирующего раствора (1%-й раствор неионного детергента Твин 80 в 0,01М фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,6), подогретого до 37°С. Лизис клеток проводят при 37°С в термостатированном шейкере в течение 1 часа.
Полученный клеточный лизат инактивируют в присутствии 0,1%-го формальдегида в течение 14 суток при 37°С. После проверки клеточного лизата на полноту инактивации (специфическую безвредность) его освобождают от ядер центрифугированием при 1700×g в течение 10 мин при температуре 4°С. Надосадочную жидкость осветляют центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин при температуре 4°С. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме ультрацентрифугирования, пропуская его через трехслойную сахарозную подушку, состоящую из 10, 20 и 30% пятимиллилитровых слоев сахарозы, используя ротор SW-28 на ультрацентрифуге "Beckman" в течение 12 часов при 80000×g. К полученному первичному концентрату вируссодержащей жидкости приливают раствор 25%-го сульфата стрептомицина до конечной концентрации 0,5% при перемешивании и выдерживают 15 мин при температуре 4°С. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g в течение 15 мин и 4°С на роторе SA-20. Осадок отбрасывают. Для сбора очищенного ВГА из буферного раствора, содержащего 1% Твин 80, супернатант наслаивают на 8 мл 20%-й сахарозы и центрифугируют при 80000×g в течение 12 часов и 4°С. Осадок перерастворяют в 0,01М ФСБ. Осветляют концентрат центрифугированием при 13000×g, в течение 15 мин и 4°С, затем концентрат фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Полученный полуфабрикат вакцины сорбируют на геле алюминия гидроксида, доводят до конечного объема и разливают по ампулам или флаконам.
Пример 3. Исследование иммуногенной активности вакцины. Проверку иммуногенной активности проводят на белых нелинейных мышах-самцах весом 15-20 г. Методом случайной выборки формируют опытные и одну контрольную группы по 10 мышей в каждой. Количество опытных групп должно соответствовать количеству используемых разведений.
Мышам опытных групп вводят разведения вакцины в объеме 1,0 мл подкожно в две точки, используя одно разведение препарата на одну опытную группу. Мышам контрольной группы по той же схеме и тем же способом вводят сорбент - гидроокись алюминия (0,35-0,65 мг/мл) в таком же объеме.
Через 28-30 дней от животных опытной и контрольной групп получают кровь и готовят из нее сыворотку в объеме не менее 0,1 мл. Каждый полученный образец сыворотки тестируют на наличие антител к вирусу гепатита А, используя для этого коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления антител к вирусу гепатита А с чувствительностью не менее 20 мМЕ/мл. Постановку и учет результатов осуществляют в соответствии с Инструкцией по применению тест-системы.
Расчет ИД50 осуществляют по результатам, полученным в опытных группах по методу Кербера. Величина ИД50 испытуемой вакцины должна составлять не менее 8 или не менее 20 ИФА ЕД. Отношение значений ИД50 испытуемой вакцины и ОСО-вакцины должно находиться в пределах от 0,68 до 1,66 при р=0,95.
Остаточную клеточную ДНК определяют методом, рекомендованным Европейской Фармакопеей, 1997 г. Метод основан на молекулярной ДНК-ДНК гибридизации меченного биотином зонда, полученного путем ник-трансляции чистого препарата тотальной клеточной ДНК с остаточной клеточной ДНК, присутствующей в анализируемом препарате и иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре. Описанный способ получения вакцины позволяет:
1. Производить вакцину в промышленном масштабе, по качеству соответствующую Европейской Фармакопее.
2. Уменьшить минимум в два раза содержание клеточной ДНК и в несколько раз содержание общего белка.
3. Освободиться от клеточных компонентов и довести содержание остаточной клеточной ДНК до уровня 100 пг/мл.
4. Получить препарат с высокой иммуногенной активностью, нетоксичный для морских свинок и кроликов.
5. Выпускать препарат, сохраняющий свою стабильность в течение 2-х лет.
Получить длительный иммунитет после двукратной иммунизации.
В таблице 1 приведены сравнительные данные инактивированной вакцины против гепатита А.
В следующих таблицах (2-8) приведены данные по основным показателям по результатам проведенных исследований ряда производственных серий вакцины после хранения препарата в течение 24 месяцев.
Примечание к таблице 9:
1. Образцы (с 1 по 4) вакцины получены по способу-прототипу (авторское свидетельство СССР №1532050).
2. Образцы (с 5 по 7) вакцины получены заявляемым способом. Причем образцы 5 и 6 вакцины получены при инактивации вирусного антигена формальдегидом в конце технологического процесса (перед сорбцией вирусного антигена на гидроокись алюминия), а образец 7 вакцины получен при инактивации вирусного антигена формальдегидом в начале технологического процесса (после лизиса клеток детергентом).
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в увеличении выхода вирусного антигена в 7-8 раз (таблица 9), а также в том, что в одном из вариантов реализации способа уже на начальном этапе приготовления вакцины активность вируса гепатита А подавляется, что приводит к минимизации риска заражения персонала. Более высокая иммуногенность вакцины, полученной заявляемым способом (таблица 2), позволяет получить устойчивый иммунитет уже после 2-кратной иммунизации (таблица 10). Вакцину, изготовленную по способу-прототипу, рекомендуется к использованию путем трехкратной иммунизации, что повышает нагрузку на иммунитет организма, которая может отрицательно сказаться на здоровье человека.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА А | 2009 |
|
RU2404804C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А | 1989 |
|
SU1672635A1 |
| ШТАММ ВИРУСА ГЕПАТИТА А ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ | 2008 |
|
RU2405037C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОЙ БИВАЛЕНТНОЙ, КУЛЬТУРАЛЬНОЙ, ИНАКТИВИРОВАННОЙ, КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ, ОЧИЩЕННОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ | 2009 |
|
RU2445117C2 |
| Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS для приготовления вакцинных и диагностических препаратов | 1991 |
|
SU1806190A3 |
| ШТАММ virus hepatitis A hominis ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ | 2005 |
|
RU2306336C2 |
| Штамм вируса гепатита А для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов | 1987 |
|
SU1474171A1 |
| Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа | 2020 |
|
RU2754398C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО ВИРУСНЫЕ АНТИГЕНЫ, И ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА | 2008 |
|
RU2496519C2 |
| ТАБЛЕТИРОВАННАЯ ЖИВАЯ РЕКОМБИНАНТНАЯ БИВАКЦИНА "РЕВАКС ВКТ" ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ГЕПАТИТА В И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 2002 |
|
RU2242246C2 |
Изобретение относится к области вирусологии. Способ включает выращивание вируса на клетках, лизис клеток, осветление вируссодержащей жидкости, ее концентрирование и доочистку, с последующим повторным осветлением вирусной фракции и сорбцией вирусного антигена. При этом лизис клеток осуществляют раствором неионного детергента Твин 80, а на стадии доочистки используют раствор сульфата стрептомицина. Способ позволяет повысить выход вирусного антигена. Изобретение может быть использовано в медицине. 4 з.п. ф-лы, 10 табл.
| Способ очистки суспензии вируса от клеточной ДНК | 1988 |
|
SU1532050A1 |
| RU 94042386 A1, 20.08.1996 | |||
| СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B, СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕ S2 ПЕПТИД, ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ, ВАКЦИНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА B | 1995 |
|
RU2122430C1 |
