СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОСУДОРОЖНОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИТИКОЛИНА НА МОДЕЛИ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОВОГО КИНДЛИНГА У МЫШЕЙ САМЦОВ ЛИНИИ C57B1/6 Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 A61K31/495 A61P25/08 A61P25/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохимии, патофизиологии, неврологии и психиатрии. Оно связано с повышением эффективности лечения эпилепсии. Эпилепсия - сложное по этиологии и патогенезу нервно-психическое заболевание, имеющее хронически-прогредиентное течение, полиморфность как пароксизмальных проявлений, так и нарушений психической деятельности. С одной стороны, классические и новые противоэпилептические лекарственные средства могут купировать повышенную судорожную активность мозга, но, как правило, не обладают защитными свойствами в отношении нейродегенерации. Таким образом, проблема предотвращения повреждения головного мозга в результате судорог остается нерешенной. С другой стороны, действие большинства противоэпилептических препаратов сопровождается рядом побочных эффектов, к числу которых можно отнести нарушение основных когнитивных функций - внимания, памяти, восприятия и др. В связи с изложенным представлялось целесообразным исследовать влияние цитиколина - аналога эндогенного цитиколина, который в настоящее время широко применяется в лечении когнитивных, чувствительных, двигательных неврологических нарушений дегенеративной и сосудистой этиологии, и обладает нейрорегенеративными и нейропротективными свойствами.

Известен способ активации каспазы-3 в головном мозге крыс на модели пентилентетразолового (ПТЗ) киндлинга [1]. При этом крысам самцам линии Вистер с массой 200-500 г вводили внутрибрюшинно пентилентетразол в дозе 37,5 мг/кг каждые 8 часов (с перерывом на выходные дни) в течении 5 недель (15 инъекций). Известно, что активация каспазы-3 является ключевым событием в апоптозе клеток головного мозга [2]. Показано, что ПТЗ киндлинг вызывает активацию каспазы-3 в мозга [2]. Показано, что ПТЗ киндлинг вызывает активацию каспазы-3 в коре больших полушарий, в гиппокампе и мозжечке крыс. Это является свидетельством как апоптотической, так и «неапоптотической» нейродегенерации в условиях ПТЗ киндлинга.

Недостатком данного способа является отсутствие сопоставительных данных с применением лекарственных веществ, предотвращающих гибель нейронов при активации каспазы-3 на модели ПТЗ киндлинга.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбран способ диагностики предупреждения нейродегенерации нейронов у животных с помощью пирацетама в условиях ПТЗ киндлинга [3]. Известно, что пирацетам - это ноотропное средство, которое повышает устойчивость мозга к гипоксии, интегративной работе, положительно влияет на процессы памяти и обучения, улучшает кровообращение головного мозга и не оказывает седативного действия [4]. В условиях ПТЗ киндлинга у мышей показано, что применение пирацетама ведет к превенции нейрональных повреждений и снижению дефицита ранее полученных навыков при обучении у животных.

Недостатком данного способа является отсутствие оценки противосудорожного действия пирацетама в условиях, когда ПТЗ киндлинг вызывает нейродегенерацию мозговой ткани у мышей.

Задачей изобретения является разработка способа, который позволяет выявить противосудорожную активность цитиколина в условиях ПТЗ киндлинга у мышей самцов линии С57В 1/6.

Поставленная задача решается благодаря тому, что способ выявления противосудорожного действия цитиколина на модели пентилентетразолового киндлинга у мышей самцов линии С57В 1/6 предусматривает следующие отличия: было проведено 5 серий опытов с целью достоверной оценки спектра и степени противосудорожного действия цитиколина.

Сущность предложенного способа заключается в том, что мышам самцам линии С57В 1/6 ежедневно вводили цитиколин в течение 24 дней и за час до титрирования ПТЗ. При тяжести судорог 3-5 баллов и длительное введение цитиколина достоверно приводило к повышению судорожного порога, тем самым предотвращая появление как клонических, так и тонической фазы судорог с летальным исходом на 15,80% и 24,34% соответственно. У данных мышей с длительной терапией цитиколина в условиях ПТЗ киндлинга противосудорожный эффект более выражен.

Между совокупностью существенных признаков заявленного объекта и достигнутыми техническими результатами существует причинно-следственная связь: увеличение длительности введения цитиколина мышам расширяет его спектр и увеличивает степень его противосудорожного действия.

Новыми признаками заявленного способа выявления противосудорожного действия цитиколина на модели пентилентетразолового киндлинга у мышей самцов линии С57В 1/6 является:

1. Наличие противосудорожного действия после однократного введения цитиколина на 14 день ПТЗ киндлинга, повышение судорожных порогов (тяжесть судорог 2-3 балла).

2. Проявление противосудорожного действия цитиколина при ежедневном введении в течение 14 дней животным, что приводило к повышению на 16,83% порогов клонической фазы судорог, по сравнению с группой контроля животных, но не оказывало влияние на тоническую фазу судорог.

3. Выявление противосудорожного действия цитиколина при ежедневном введении в течение 24 дней животным, что повышает порог судорожной активности, о котором свидетельствует предотвращение появления как клонической, так и тонической фаз судорог с летальным исходом на 15,80% и 24,34% соответственно.

Способ разработан на основе следующих экспериментов:

1. Методика экспериментов.

Мышей самцов линии С57В 1/6 содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ №267 от 19.06.2003 г.

Проведено 5 серий опытов. Во всех сериях цитиколин вводили внутрибрюшинно мышам самцам линии С57В 1/6 в дозе 500 мг/кг за час до введения (киндлинг) и титрования (острые судороги) конвульсанта пентилентетразола (ПТЗ).

В 1-й серии опытов (n=30) изучали возможное влияние цитиколина на развитие хронической эпилептизации мозга - киндлинга, который осуществляли путем ежедневного внутрибрюшинного введения ПТЗ в субконвульсивной дозе 30 мг/кг данным мышам в течение 24 дней. Как известно, феномен киндлинга заключается в том, что повторные введения субсудорожных доз конвульсанта вызывают постепенное повышение судорожной активности мозга, которое проявляется в возникновении судорог и увеличении их тяжести при последующих введениях конвульсанта. Феноменологически он проявляется в снижении судорожного порога в ответ на тестирующую дозу конвульсанта. Ежедневно у каждого животного оценивали тяжесть судорожной реакции в ответ на введение ПТЗ и выражали ее в баллах по 5-балльной шкале. Судорожную реакцию в ответ на введение конвульсанта оценивали по усредненному баллу у данных мышей каждой группы. Опытным животным этой серии цитиколин вводили внутрибрюшинно перед каждой инъекцией ПТЗ в течение 24 дней. Контрольным мышам самцам линии С57В 1/6 в аналогичных условиях опыта в том же объеме вводили физиологический раствор.

Во 2-5-й сериях опытов на модели острой генерализованной эпилептической активности определяли величину порогов судорожной реакции мышей самцов линии С57В 1/6, подвергшихся ПТЗ киндлингу. С этой целью животным внутривенно вводили 1% раствор ПТЗ со скоростью 0,01 мл/с и регистрировали пороги клонических судорог и тонической фазы судорог с летальным исходом. Пороговую дозу ПТЗ, необходимую для наступления указанных судорог, вычисляли для каждого животного в мг/кг. Величину порогов судорожной реакции мышей определяли через сутки после 14-й и 24-й инъекции ПТЗ.

Через сутки после 14-й и 24-й инъекции ПТЗ опытным животным 2-й и 3-й серий цитиколин вводили однократно за час до титрования ПТЗ, а опытным мышам 4-й и 5-й серий цитиколин вводили ежедневно в течение 14-и и 24-х дней и за час до титрования ПТЗ. Контрольным животным этих серий в тех же условиях опыта и в том же объеме вводили физиологический раствор.

Таким образом, изобретение позволяет выявить как спектр противосудорожного действия цитиколина, так и степень его выраженного противосудорожного действия на модели ПТЗ киндлинга у мышей, что связано с нейропротективным действием цитиколина, который предотвращает повреждение мозга животных в результате судорог.

Список используемой литературы

1. Павлова Т.Б., Яковлев А.А., Степаничев М.Ю., Менджерицкий A.M., Гуляева Н.В. «Пентилентетразоловый киндлинг вызывает активацию каспазы - 3 в мозге крыс». Журнал высшей нервной деятельности, 2003, том 53, №1, с. 110-112.

2. Nicotera P. Caspase requirement for neuronal apoptosis and neurodegeneration // International Union of Biochemistry and Molecular Biology Life. 2000. V. 49. №5. P. 421-425.

3. Pohle W., Becker A., Grecksch G. et al. «Piracetam prevents pentylenetetrazol kindling-unduced neuronal loss and learning defcits//Seizure. 1997. V. 6. P. 467-474.

4. А.А. Михайленко, В.И. Коненков, Г.А. Базанов, В.И. Покровский. Руководство по клинической иммунологии, аллергологии, иммуногенетике и иммунофармакологии (для врачей общеклинической практики) // Под ред. В.И. Покровского, Т. 2, Тверь: ООО «Издательство Триада», 2005, С. 450-451.

Изобретение относится к медицине, в частности к нейрохимии, патофизиологии, неврологии и психиатрии, и касается выявления противосудорожного действия цитиколина. Выявление проводят на модели пентилентетразолового киндлинга у мышей самцов линии C57B1/6. Действие цитиколина оценивают после его введения в дозе 500 мг/кг за час до введения пентилентетразола. Введение проводят в разном режиме в разных группах животных, а именно: ежедневно в течение 24 дней, однократно на 14 день кидлинга или в течение 14 дней кидлинга. Способ обеспечивает возможность выявления спектра и степени выраженности противосудорожного действия препарата. 2 табл.

Способ выявления противосудорожного действия цитиколина на модели пентилентетразолового киндлинга у мышей самцов линии C57B1/6, заключающийся в том, что действие цитиколина оценивают после его введения в дозе 500 мг/кг за час до введения пентилентетразола в разном режиме в разных группах животных: при ежедневном введении в течение 24 дней, после однократного введения на 14 день кидлинга и при ежедневном введении в течение 14 дней кидлинга.