СКАНИРУЮЩИЙ ЦИТОМЕТР Российский патент 2015 года по МПК G01N21/64 G01N33/48 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области сканирующих цитометров, использующих обнаружение флуоресценции от объектов, которые облучают интенсивным и модулированным светом. Устройство может быть использовано в медицине, контроле окружающей среды и объектов жизнеобеспечения, в космических исследованиях.

Уровень техники

Одним из наиболее распространенных в настоящее время методов подсчета клеток является проточная цитометрия (ПЦ). К достоинствам ПЦ можно отнести возможность исследования в ходе одного анализа большого числа клеток (более 100000), высокую чувствительность, что позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл жидкости и обеспечивать высокую скорость подсчета.

Известны проточные цитометры для использования в медицинских и биологических применениях. Наиболее широко представлены цитометры, которые основаны на обнаружении флуоресценции от флуорохромов, связанных с объектами измерения.

Одним из основных недостатков метода ПЦ является сложность и дороговизна его технической реализации. Аппарат для ПЦ включает в себя измерительную ячейку в виде капилляра сечением 100-300 мкм, специальной конструкции для обеспечения ламинарного потока жидкости, протекающей через ячейку, систему подачи пробы в аппарат, систему дозирования флуоресцентного красителя, насос для обеспечения постоянной скорости движения жидкости, систему промывки измерительного тракта, предотвращающую кросс-контаминацию - заражение измеряемых образцов предыдущими образцами, оптическую систему с лазером, приемником, фотоумножителем, оптическими фильтрами.

В патенте США № US 5270548 описан проточный цитометр, использующий фазовый детектор для подсчета в потоке клеток, помеченных флуоресцентными красками с перекрывающимися спектрами излучения, но с различным временем жизни флуоресценции. Однако в силу конструкционных особенностей проточных цитометров в каждый момент времени источник света освещает область, в которой может находиться не более одной клетки, и фазовый детектор фиксирует сигнал от одной клетки [1].

В заявке на патент США № US 20130327957 описан проточный цитометр микроструйного типа. Прямоугольный канал внутри съемного полимерного прозрачного чипа освещается лазерным лучом. Относительное положение чипа и лазерного луча механически подстраивается для достижения лучшего соотношения сигнала к шуму. Цитометр имеет два приемника излучения, один из которых принимает шум, а другой принимает полезный сигнал флуоресценции [2].

Известен патент США US 5009503, в котором для подсчета микроорганизмов используется микроскоп с моторизованным двухкоординатным столиком, на котором расположены цилиндрические стеклянные капилляры с агаризованной питательной средой с микробными клетками или колониями. Капилляры освещаются лазерным лучом, который точно направляется системой подвижных зеркал вдоль оси капилляра. При движении столика происходит автоматическая фокусировка объектива. Датчик или фотоумножитель последовательно регистрирует свет, отраженный от каждой клетки. Данная система отличается сложностью, дороговизной, невысокой скоростью сканирования, длительной и трудоемкой пробоподготовкой. Применение цилиндрического капилляра усложняет оптическую схему [3].

В международной заявке № WO 9702482 для подсчета клеток лейкоцитов, окрашенных флуоресцентным красителем, интерколярно присоединенным к ДНК или РНК, помещают подготовленную пробу в стеклянный или акриловый капилляр прямоугольного сечения с внутренним сечением 200-400 мкм на 1-3 мм и длиной, точно обеспечивающей необходимый объем пробы. Пробу освещают сфокусированным лазерным лучом, капилляр сканируют в двух направлениях и последовательно регистрируют с помощью фотоумножителя флуоресценцию от отдельных клеток [4].

Недостатком описанного способа и устройства является сканирование капилляра в двух направлениях, а также необходимость его точного позиционирования по отношению к объективу. Эта конструктивная особенность, а также применение лазера удорожает устройство.

Известны разнообразные электронные схемы для регистрации флуоресцентного излучения, использующие амплитудный метод. Например, в проточном цитометре, описанном в патенте Японии № JPH 046440, свет от движущейся окрашенной частицы, попадающей в освещенную лазером область, регистрируется последовательно несколько раз, каждый раз в новой ячейке фотоприемника, выполненного в виде линейки ПЗС. Запись в ячейки тактируется с генератора. Суммарный заряд, накопленный в фотоприемнике, фиксируется как сигнал от одной клетки, причем специальная схема следит за тем, чтобы сигнал от разных клеток не смешивался [5].

Известен проточный цитометр, описанный в патенте США №8415627, который предназначен для анализа широкого круга объектов, таких как белки, клетки, ДНК, РНК или ферменты [6]. Устройство может одновременно работать на нескольких частотах возбуждающего сигнала и различать одновременно два или более различных биологических веществ. Схема возбуждения источника света, в качестве которого используется лазер, может иметь несколько источников излучения с разными частотами. Кроме того, схема управления лазером имеет три генератора, один из которых является тактовым, другой генератор определяет частоту модуляции, третий генератор генерирует опорный сигнал для определения времени релаксации флуоресценции. При этом сигнал модуляции и опорный сигнал синхронизированы друг с другом. Блок обработки сигналов извлекает информацию о фазовой задержке флуоресценции и принимает сигнал, который получают из бокового рассеянного света. При этом такую обработку ведут в разных каналах обработки сигналов на разных диапазонах волн. Для увеличения точности определения времени релаксации флуоресценции частота сигнала модуляции отличается от частоты опорного сигнала, и анализирующее устройство дополнительно содержит устройства преобразования вещественной и мнимой части сигнала, а анализ требует оцифровки этих данных и их хранения в анализирующем устройстве. Сложная схема преобразования сигналов вызвана задачей одновременной идентификации нескольких типов биологических объектов.

Существует потребность разработки более простых переносных компактных цитометров для задач быстрого обнаружения одного из разных типов биологических объектов в окружающей среде или в местах нахождения людей, например местах общего пользования (больницы, метро, спортивные сооружения, магазины и т.д.). Для этой цели более эффективно могут быть использованы портативные цитометры с малым токопотреблением, простотой подготовки пробы, малыми габаритами и весом и с возможностью передачи данных через сеть интернета или мобильную связь с базами данных, в которые включают результаты сканирования множества удаленных друг от друга объектов, с тем, чтобы определить степень заражения водоемов, или воздуха, или жилых и других помещений. Малые габариты и вес, простота и прочность конструкции и применение капилляра в приборе позволяют использовать его в биологических исследованиях в условиях космоса. Для создания малогабаритных сканирующих цитометров крайне необходимо использовать новые технические решения, позволяющие повысить точность и воспроизводимость измерений.

Технической задачей данного изобретения является расширение арсенала цитометров с высокой точностью, малыми габаритами, высокой мобильностью и простотой получения результатов для получения большого массива данных в исследуемом регионе.

Другой технической задачей является увеличение соотношения сигнал/шум, что приводит к увеличению динамического диапазона и разрешающей способности устройства.

Сущность изобретения

Одним из аспектов изобретения является способ подсчета биологических объектов в пробе, который содержит: предварительный отбор образцов с биологическими объектами, смешение с флуоресцентным красителем и инкубацию, освещение рабочей зоны с исследуемым объектом для формирования флуоресцентного свечения исследуемых объектов, разделение световых потоков, их детектирование, обработку и анализ количества обнаруженных биологических частиц. При этом раствор с биологическими объектами помещают в прямоугольный капилляр, выполненный с возможностью отражения сигнала флуоресценции от верхней поверхности прямоугольного капилляра. Дополнительный сбор сигнала флуоресценции обеспечивают с помощью параболического отражателя, в фокусе которого устанавливают исследуемую зону капилляра. Смену исследуемых зон с биологическими объектами осуществляют за счет перемещения капилляра вдоль его оси. Детектируемый световой поток разделяют по длине волны и направляют на первый и второй фотоумножители, выходные сигналы которых пропорциональны падающему световому потоку и сигналу флуоресценции. Сигналы поступают на амплитудный и фазовый преобразователи для одновременной обработки и последующего перемножения массивов данных, полученных с амплитудного и фазового преобразователей сигналов. Данные предварительно собирают, оцифровывают и помещают в память микропроцессора, при этом перед запуском основного алгоритма обработки проводят калибровку, при которой распознают сигнал от единичных биологических объектов и фиксируют интервал, на котором происходит регистрация единичных объектов, а число объектов определяют как сумму сигналов на интервале.

К другому аспекту изобретения относится устройство для измерения количества биологических объектов в пробе. Устройство содержит: узел формирования светового потока, в который входит источник света и оптические элементы для формирования узкого светового потока, узел крепления капилляра с исследуемым объектом, узел детектирования, электронный узел преобразования сигналов, микропроцессор, дисплей, модулятор. При этом узел крепления капилляра содержит параболический отражатель, снабженный прямоугольным вырезом, в который устанавливают прямоугольный капилляр с исследуемым образцом, с возможностью перемещения рабочих зон капилляра относительно светового потока с помощью шагового двигателя. Верхняя поверхность капилляра имеет зеркальное покрытие, отражающее сигнал флуоресценции на вход узла детектирования. Узел детектирования содержит оптическую часть, в которую входят первый и второй светоделители, полосовые оптические фильтры, первый и второй фотоумножители, выходы которых подключены ко входам электронного узла. Электронный узел содержит амплитудный и фазовый преобразователи и первый и второй АЦП, при этом входы амплитудного и фазового преобразователей подключены к выходам первого и второго фотоумножителей, выходы преобразователей подключены ко входам первого и второго АЦП, выходы которых подключены к микропроцессору. Микропроцессор обеспечивает возможность обработки массива данных, управление модулятором и вывод данных на дисплей.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Структурная схема формирования светового потока и его передачи на узел крепления капилляра.

Фиг.2. Вид сечения параболического отражателя и капилляра.

Фиг.3. Структурная схема, поясняющая разделение светового потока.

Фиг.4. Структурная схема электронного узла и его связь с микропроцессором, дисплеем, модулятором и узлом перемещения капилляра.

Описание изобретения

В рассматриваемом способе обнаружения биологических объектов, таких как микроорганизмы, клетки, вирусы, белки, ферменты, РНК, ДНК, точность измерения количества объектов повышают за счет синергетического воздействия аппаратных и программных решений. При этом на аппаратном уровне используют капилляры с возможностью усиления сигнала флуоресценции не менее чем в 1,5-2 раза. На программном уровне осуществляют обработку сигналов от амплитудного и фазового преобразователей и увеличивают отношение сигнал/шум за счет перемножения массивов данных, полученных с амплитудного и фазового преобразователей, предварительно собранных, оцифрованных и помещенных в память микропроцессора.

Этапы способа включают в себя следующие стадии. Предварительно отбирают биологический образец, например, содержащий микробные клетки, в пробирку и после добавления флуоресцентного красителя перемешивают и инкубируют раствор. Отбирают часть инкубационного раствора в капилляр, который выполнен с возможностью отражения флуоресцентного сигнала, и устанавливают его на узел перемещения с возможностью последовательного освещения рабочих зон капилляра. Для освещения капилляра формируют узкий световой луч, для чего световой поток от источника света фокусируют коллиматорной линзой в параллельный пучок и пропускают через многослойный полосовой оптический фильтр. Далее с помощью щелевой диафрагмы формируют узкий луч, падающий на капилляр с образцом, вызывая флуоресцентное свечение окрашенных красителем клеток. При этом флуоресцентное излучение собирают на входном окне второго фотоумножителя, при этом флуоресцентный сигнал формируется за счет синергетического действия отражающей поверхности размещенной на верхней стороне поверхности прямоугольного капилляра и отражающей поверхности параболического зеркала.

Параллельный пучок света на выходе параболического зеркала фокусируют коллиматорными линзами в параллельный пучок света и подают через светоделители на два фотоумножителя. При этом свет, попадающий на первый фотоумножитель, предварительно пропускают через селективный светоделитель, выполненный в виде плоского зеркала, и далее свет проходит через полосовой оптический фильтр, пропускающий только световой поток от источника света и не пропускающий флуоресцентное свечение, что вызывает появление на выходе первого фотоумножителя сигнала амплитуды, пропорционального световому потоку (далее опорный сигнал). Дополнительно используют второй светоделитель и второй оптический фильтр, пропускающий только флуоресцентное свечение на вход второго фотоумножителя, с выхода которого снимают полезный сигнал о флуоресценции биологических объектов.

Полезный сигнал и опорный сигнал с выходов фотоумножителей подают на входы амплитудного и фазового преобразователей сигналов и через аналого-цифровые преобразователи данные поступают в память микропроцессора, в котором на программном уровне осуществляют обработку сигналов от амплитудного и фазового преобразователей. При этом увеличивают отношение сигнал/шум за счет перемножения массивов данных, полученных с амплитудного и фазового преобразователей.

Устройство для измерения количества биологических объектов в пробе, выполненное для реализации способа, содержит:

узел формирования светового потока, в который входит: источник света 1, коллиматорная линза 2, первый полосовой оптический фильтр 3, щелевая диафрагма 4, цилиндрическая линза 5;

узел крепления капилляра 26, который содержит: параболический отражатель 7, снабженный прямоугольным вырезом 8, в который устанавливают капилляр 6 с образцом, предметный столик 21 для перемещения капилляра 6 с помощью шагового двигателя 22;

узел детектирования, который содержит: оптическую часть, в которую входят первый и второй светоделители, выполненные в виде плоских зеркал 10 и 13, полосовые оптические фильтры 11 и 14, первый и второй фотоумножители 9 и 12;

электронный узел, который содержит: амплитудный 15 и фазовый 16 каналы, первый и второй АЦП 17 и 18, микропроцессор 19, дисплей 20, модулятор 23.

Устройство работает следующим образом.

В пробирку с объемом не менее 100 мкл, содержащую микробные клетки в количестве от 10¹ до 10⁸ в мл, добавляют флуоресцентный краситель, например SYTO 9 фирмы Invitrogen, присоединяемый к нуклеиновым кислотам. Смесь перемешивают вручную или в мешалке и инкубируют в течение 1-30 мин при температуре от 15 до 25°C, затем отбирают часть образца жидкости с красителем в капилляр в количестве 20-200 мкл для последующего сканирования капилляра с отобранным образцом. Для сканирования формируют узкий световой поток и регистрируют интенсивность флуоресцентного свечения и подсчитывают по формуле количество микробных клеток.

Для формирования светового потока используют свет источника от лампы, светодиода или лазера с длиной волны от 200 до 780 нм. Световой поток фокусируют коллиматорной линзой 2 в параллельный пучок диаметром 1-3 мм, и далее световой поток пропускают через оптический фильтр 3, затем с помощью щелевой диафрагмы 4 шириной 5-20 мкм формируют узкий луч, который затем дополнительно фокусируется для компенсации дифракционного расширения луча цилиндрической линзой 5 с фокусным расстоянием от 1 до 3 мм.

Узкий луч света падает на прямоугольный капилляр с образцом 6, выполненный из кварцевого или силикатного стекла с высотой отверстия от 1 мм до 1,5 мм и шириной от 0,5 мм до 1 мм, длиной 30-150 мм и толщиной стенки от 0,1 мм до 1 мм. Световой поток источника вызывает свечение окрашенных флуоресцентным красителем биологических частиц или клеток, находящихся в образце. Капилляр находится в фокусе параболического отражателя 7 с прямоугольным вырезом 8, предназначенным для установки капилляра внутри отражателя.

Для увеличения количества собираемого света флуоресценции верхняя стенка капилляра имеет зеркальное покрытие 25, например, в виде пленки алюминия, нанесенного методом вакуумного напыления.

Параллельный пучок света на выходе параболического отражателя диаметром 7-20 мм фокусируется коллиматорными линзами 27 в параллельный пучок света диаметром 1-5 мм на входных окнах двух фотоумножителей.

Свет, попадающий на первый фотоумножитель 9, предварительно пропускается через селективный светоделитель в виде плоского зеркала 10, расположенного под углом 45 градусов к направлению луча, и полосовой оптический фильтр 11, пропускающий только свечение источника в диапазоне от 200 до 780 нм и не пропускающий флуоресцентное свечение, и вызывает появление на выходе первого фотоумножителя опорного сигнала.

Свет, попадающий на второй фотоумножитель 12, предварительно пропускается через два светоделителя, выполненных в виде плоских зеркал 10 и 13, и полосовой оптический фильтр 14, пропускающий только флуоресцентное свечение в диапазоне от 390 до 810 нм и не пропускающий свет источника, вызывает появление на выходе второго фотоумножителя полезного сигнала флуоресценции.

Опорный и полезный сигналы с выходов первого и второго фотоумножителей 9 и 12 подаются на входы электронного узла.

Повышение разрешающей способности позволяет уменьшить вероятность ошибки при подсчете клеток, например, при одновременной регистрации в диапазоне от 1 до 10 клеток. Для реализации технической задачи электронная схема устройства имеет амплитудный 15 и фазовый 16 преобразователи сигналов.

На входы амплитудного преобразователя поступают сигналы с выходов первого и второго фотоумножителей 9 и 12. Амплитудный преобразователь формирует сигнал, пропорциональный отношению полезного сигнала флуоресценции и опорного сигнала.

Фазовый преобразователь формирует сигнал, пропорциональный разности фаз модулированных сигналов флуоресценции и опорного сигнала.

Работа фазового преобразователя происходит следующим образом [7]. На вход подаются опорный и полезный сигналы с выходов первого и второго фотоумножителей 9 и 12, которые перемножаются, и затем результирующий сигнал пропускается через низкочастотный фильтр. На выходе детектора остается постоянная составляющая, пропорциональная фазовому сдвигу входных сигналов. При синусоидальной форме опорного и полезного сигналов работу фазового детектора можно проиллюстрировать следующим образом:

Видно, что выходной сигнал фазового детектора не зависит от частоты модуляции опорного сигнала. При отсутствии сдвига фазы между опорным и полезным сигналом выходной сигнал равен 0. При наличии сдвига фаз между сигналами на входе детектора выходной сигнал имеет постоянное значение, пропорциональное этому сдвигу.

Однако выходной сигнал зависит еще и от амплитуды опорного сигнала, что приводит к усилению шума на выходе фазового детектора. Например, случайное увеличение напряжения на источнике света приведет к увеличению опорного и полезного сигналов, так как при этом увеличивается яркость источника света и освещенность окрашенных клеток, что в свою очередь вызывает увеличение флуоресцентного свечения клеток. Амплитуды опорного и полезного сигналов увеличатся и мультипликативно увеличат выходной сигнал фазового детектора.

Наличие амплитудного преобразователя, на выходе которого формируется сигнал, пропорциональный отношению опорного и полезного сигналов, позволяет скомпенсировать шум в опорном канале. Для этого в алгоритме работы прибора предусмотрена операция перемножения массивов данных с амплитудного и фазового каналов, предварительно собранных, оцифрованных и помещенных в память микропроцессора. Из формул видно, что при этом не только исчезает зависимость выходного сигнала от опорного сигнала, но и квадратично увеличивается его зависимость от амплитуды полезного сигнала. Все это приводит к увеличению соотношения сигнал/шум и разрешению детектора, что позволяет более точно подсчитывать количество одновременно детектируемых клеток:

Свет от источника 1 имеет амплитудную модуляцию, которую обеспечивает модулятор 23, под управлением микропроцессора 19. Частота модуляции составляет от 3 до 30 МГц. Коэффициент модуляции от 0,1 до 0,7. Флуоресцентное свечение при этом также приобретает амплитудную модуляцию. Флуоресцентное свечение возникает не сразу после попадания на флуорохром света, а с некоторым запаздыванием (для SYTO 9 запаздывание составляет около 6 нс), поэтому фаза сигнала регистрации отстает от фазы сигнала засветки. Таким образом, появление флуоресценции приводит к изменению сигналов на выходах амплитудного и фазового преобразователей.

Сигналы амплитудного и фазового преобразователя цифруются с помощью двух АЦП 17 и 18 и поступают на входы микропроцессора 19. Результаты обработки массива данных отображаются на дисплее 20.

Капилляр с исследуемым образцом закрепляют на однокоординатном столике 21, который приводится в движение шаговым двигателем 22. Таким образом, осуществляется поступательное движение капилляра с шагом 0,5-5 мкм перед щелевой диафрагмой 4, в результате которого луч от источника последовательно сканирует всю рабочую зону капилляра 6.

Определение количества клеток производится по следующему алгоритму.

Координатный стол устанавливается в крайнее положение, затем осуществляется поступательное движение стола с выбранным шагом и количеством шагов (n), причем на каждом шаге (i) происходит измерение флуоресценции, при этом в память микропроцессора записывается и . После полного прохождения капилляра в памяти микропроцессора формируются одномерные массивы сигналов и длиной k. Затем происходит поэлементное перемножение этих массивов и формируется массив U_вых. По данным этого массива осуществляется калибровка, которая заключается в распознавании сигналов от единичных клеток. При этом фиксируется интервал, на котором происходит регистрация единичной клетки (от j до j+m), и определяется сумма сигналов на этом интервале (e).

Калибровка проходит успешно, если образец содержит не более 10⁴-10⁵ КОЕ/мл. Если калибровка выполнена успешно, то определяется количество клеток по следующей формуле:

Если же образец содержит большую концентрацию клеток, прибор определяет необходимую степень разведения образца и выводит соответствующее сообщение об этом, после чего образец необходимо разбавить соответствующее число раз и запустить прибор еще раз с разбавленным образцом.

Промышленная применимость

Сканирующий цитометр прост в обслуживании, имеет малые габариты и вес.

Литература

1. STEINKAMP JOHN A. Phase-sensitive flow cytometer. US patent № US 5270548 (1993-12-14).

2. AYLIFFE HAROLD E. FLUORESCENCE FLOW CYTOMETRY US patent applic. № US 2013327957 (2013-12-12).

3. MURPHY JR MARTIN J, STUBBS JACK B. Automated capillary scanning system. US 5009503 (1991-04-23).

4. WOO SAM L BAER THOMAS M. VOLUMETRIC CELL QUANTIFICATION METHOD AND SYSTEM, PCT appl № WO9702482 (1997-01-23).

6. YAMAZAKIISAO, OKI HIROSHI PARTICLE ANALYZER. JP Patent № JPH 046440 (1992-01-10).

6. DOI KYOUJI, NAKADA SHIGEYUKI FLUORESCENCE DETECTION DEVICE USING INTENSITY-MODULATED LASER LIGHT AND FLUORESCENCE DETECTION METHOD. US Patent №8415627 (2013-04-09).

7. I.N. Sinitsyn, P.V. Gorbunov THE EXPERIENCE IN THE DEVELOPING SUBOPTIMAL ALGORITHM OF ANALYSIS, MODELING AND INTERPRETING SIGNALS IN OUTER SCANNING ANALYZER OF MICROORGANISMS. The 11th International Conference on Pattern Recognition and Image Analysis: New Information Technologies (PRIA-11-2013). Samara, September 23-28, 2013. Conference Proceedings (Vol.I-II), Volume II, Samara: IPSI RAS, 2013. 410 p. (377-786 pp.).

Изобретение относится к области исследования и анализа биологических материалов и касается способа для подсчета биологических объектов в пробе и сканирующего цитометра на его основе. Для осуществления подсчета биологических объектов пробу помещают в прямоугольный капилляр, выполненный с возможностью отражения сигнала флуоресценции от верхней поверхности прямоугольного капилляра. Дополнительный сбор сигнала флуоресценции обеспечивают с помощью параболического отражателя, в фокусе которого устанавливают исследуемую зону капилляра, при этом смену исследуемых зон с биологическими объектами осуществляют за счет перемещения капилляра вдоль его оси. Детектируемый световой поток разделяют по длине волны и направляют на первый и второй фотоумножители, выходные сигналы которых пропорциональны световому потоку и сигналу флуоресценции. С выхода фотоумножителей сигналы поступают на амплитудный и фазовый преобразователи для одновременной обработки и последующего перемножения массивов данных, полученных с выходов амплитудного и фазового преобразователей сигналов в микропроцессоре. Технический результат заключается в повышении точности и упрощении способа измерений, а также в уменьшении габаритов и повышении мобильности устройства. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил.

1. Способ подсчета биологических объектов в пробе, содержащий предварительный отбор образцов с биологическими объектами, смешение с флуоресцентным красителем и инкубацию, освещение рабочей зоны с исследуемым объектом для формирования флуоресцентного свечения исследуемых объектов, разделение световых потоков, их детектирование, обработку и анализ количества обнаруженных биологических частиц, отличающийся тем, что раствор с биологическими объектами помещают в прямоугольный капилляр, выполненный с возможностью отражения сигнала флуоресценции от верхней поверхности прямоугольного капилляра, где дополнительный сбор сигнала флуоресценции обеспечивают с помощью параболического отражателя, в фокусе которого устанавливают исследуемую зону капилляра, при этом смену исследуемых зон с биологическими объектами осуществляют за счет перемещения капилляра вдоль его оси, при этом детектируемый световой поток разделяют по длине волны и направляют на первый и второй фотоумножители, выходные сигналы которых пропорциональны световому потоку и сигналу флуоресценции и поступают на амплитудный и фазовый преобразователи для одновременной обработки и последующего перемножения массивов данных, полученных с амплитудного и фазового преобразователей сигналов, при этом данные предварительно собирают, оцифровывают и помещают в память микропроцессора, при этом перед запуском основного алгоритма обработки проводят калибровку, при которой распознают сигнал от единичных биологических объектов и фиксируют интервал, на котором происходит регистрация единичных объектов, а число объектов определяют как сумму сигналов на интервале.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биологические объекты входят в группу, состоящую из микроорганизмов, клеток, вирусов, белков, ферментов, РНК, ДНК.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию проводят при температуре от 15 до 25°C в течение 1-30 мин.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что объем капилляра выбирают в пределах от 20 до 200 мкл.

5. Устройство для измерения количества биологических объектов в пробе, содержащее узел формирования светового потока, в который входит источник света и оптические элементы для формирования узкого светового потока, узел крепления капилляра с исследуемым объектом, узел детектирования, электронный узел преобразования сигналов, микропроцессор, дисплей, модулятор, отличающееся тем, что узел крепления капилляра содержит параболический отражатель, снабженный прямоугольным вырезом, в который устанавливают прямоугольный капилляр с исследуемым образцом, с возможностью перемещения рабочей зоны капилляра относительно светового потока с помощью шагового двигателя, где верхняя поверхность капилляра имеет зеркальное покрытие, дополнительно отражающее сигнал флуоресценции на вход узла детектирования, узел детектирования содержит оптическую часть, в которую входят первый и второй светоделители, полосовые оптические фильтры, первый и второй фотоумножители, выходы которых подключены ко входам электронного узла, который содержит амплитудный и фазовый преобразователи и первый и второй АЦП, при этом входы амплитудного и фазового преобразователей подключены к выходам первого и второго фотоумножителей, выходы фазового и амплитудного преобразователей подключены ко входам первого и второго АЦП, выходы которых подключены к микропроцессору, который обеспечивает возможность обработки массива данных, управление модулятором и вывод данных на дисплей.

6. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что капилляр выполнен из кварцевого или силикатного стекла с высотой отверстия от 1 мм до 1,5 мм, шириной от 0,5 мм до 1 мм, длиной 30-150 мм.

7. Устройство по п. 6, отличающееся тем, что капилляр выполнен с толщиной стенки от 0,1 мм до 1 мм.

8. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что первый и второй светоделители выполнены в виде плоских зеркал.

9. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что первый полосовой оптический фильтр работает в диапазоне от 200 до 780 нм.

10. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что второй полосовой оптический фильтр пропускает в диапазоне от 390 до 810 нм в зависимости от типа флуоресцентного красителя.

11. Устройство по п. 5, отличающееся тем, что параболический отражатель имеет диаметр от 7 до 20 мм.

12. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что источник светового потока работает с длиной волны от 200 до 780 нм.

13. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что частота модуляции составляет от 3 до 30 МГц, а коэффициент модуляции от 0,1 до 0,7.