Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к штамму Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474, обладающему выраженными фунгицидными и ростостимулирующими свойствами, который может быть использован для получения средств для защиты сельскохозяйственных культур от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами, улучшения фитосанитарного состояния почв и стимуляции роста сельскохозяйственных культур.
Известен штамм Bacillus subtilis В-14 (см. патент РФ №2337955, 2008), используемый для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов. Недостатками данного штамма является невысокая фунгицидная активность в отношении фитопатогенных грибов - зоны подавления роста тест-культур небольшие: Alternaria alternata - 18-22 мм; Fusarium graminearum - 12-14 мм. Штамм Bacillus subtilis В-14 продуцирует умеренное количество индол-уксусной кислоты, поэтому оказывает небольшое ростостимулирующее действие на растения. Данный штамм оказывает ограниченное действие на заболеваемость сельскохозяйственный культур - действие направлено на возбудителей корневых гнилей сельскохозяйственный культур, в частности пшеницы.
Известен штамм Bacillus subtilis 8-а (см. патент РФ №2495119, 2013), обладающий фунгицидной активностью против фитопатогенных грибов, а также ростстимулирующей активностью по отношению к различным сельскохозяйственным культурам. Недостатками использования данного штамма является небольшой спектр фитопатогенных грибов при исследовании фунгицидной активности штамма, а также невысокая фунгицидная активность в отношении фитопатогенных грибов - Fusarium culmorum - 16,5 мм; Fusarium graminearum - 17,3 мм.
Наиболее близким к предлагаемому штамму, взятым за прототип, является штамм Bacillus atrophaeus SKD-1 (см. ст. Коряжкина М.Ф. «Использование культуры Bacillus atrophaeus SKD-1 для разработки биопрепарата с фунгицидными свойствами». Первые Международные Беккеровские чтения. Сборник научных трудов по материалам конференции 27-29 мая, Волгоград, 2009 г., в 2-х частях, Ч. 2. С. 121-123), выделенный из аллювиально-луговой почвы Астраханской области. Штамм Bacillus atrophaeus SKD-1 обладает фунгицидной активностью по отношению к фитопатогенным грибам: Alternaria species, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Phytium ultimum, Cladosporium species. Доказана фитостимулирующая активность штамма Bacillus atrophaeus SKD-1 в биотесте на семенах кресс-салата и в вегетационном опыте на томате сорта «Победитель».
Недостатками данного штамма является недостаточно высокая фунгицидная активность в отношении ряда фитопатогенных грибов {Alternaria species, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Cladosporium species). Вегетационные испытания штамма Bacillus atrophaeus SKD-1 проводились в вегетационных сосудах с грунтом, а не в открытом грунте, что не дает возможности изучить влияние штамма на заболеваемость и урожайность сельскохозяйственных культур в полевых условиях. Недостаточная продолжительность эксперимента (37 дней) не позволяет проследить весь цикл вегетации сельскохозяйственных культур (от посадки до получения урожая).
Технической задачей заявляемого изобретения является выделение штамма с широким спектром свойств: антагонистических, фунгицидных и ростстимулирующих.
Технический результат - стимуляция защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенных грибов и их роста с помощью заявляемого штамма.
Он достигается тем, что заявляемый штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 предлагается в качестве средства для защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенных грибов и стимуляции их роста.
Штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 выделен из городских почв (культуроземов) Астраханской области путем многоступенчатого отбора по следующим признакам: широкий спектр высокой фунгицидной активности к фитопатогенным грибам; высокая ростстимулирующая активность; отсутствие токсического действия на биологические объекты.
Таксономическая принадлежность штамма определена при помощи анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК в базе данных GenBank и RDP-II (Ribosomal Database Project II). Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов при ФГУП ГосНИИгенетика и имеет коллекционный номер ВКПМ В-11474.
Заявляемый штамм характеризуется следующими признаками.
1. Культурально-морфологические признаки
Прямые палочковидные клетки, слегка изогнутые с закругленными концами размером 1-5×0,7 мкм, расположены одиночно; имеют эллипсовидные эндоспоры, расположенные в центре клетки; подвижны. На МПА при температуре 28°C через 48 ч культура растет с формированием слегка складчатых мелкоморщинистых колоний с волнистым краем, слизистой консистенции, серо-бежевого цвета. На бобовом агаре при температуре 28°C через 48 ч культура формирует мелкоморщинистых колонии с волнистым краем, светло-бежевого цвета. Морфотип грамположительный.
2. Физиолого-биохимические признаки
Хемоорганогетеротроф с дыхательным типом метаболизма, оптимальной температурой 28°C и оптимумом pH 7,2. Каталазоположителен. В качестве источника углерода способен использовать глюкозу, пропионат, казеин и крахмал. Восстанавливает нитраты, образует кислоту из глюкозы. Растет при температуре 15-37°C, 7% NaCl и на среде с pH 5,7.
3. Условия культивирования
Для получения препаративной формы в виде суспензии заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 в качестве питательной используют дешевую среду - бобовый отвар следующего состава (г/л): бобы - 50 г; pH 7,0±0,2. Для получения посевного материала используют стандартную методику: культуру рассевают в пробирки со скошенной средой ПА, инкубируют в условиях термостата при температуре 28°C в течение 48 ч, затем вносят в пробирки по 5 мл 0,85% раствора NaCl, бактериологической петлей снимают с поверхности агара бактериальную массу, встряхивают в течение 5 минут, полученный посевной материал с содержанием клеток и спор 1×108 КОЕ/мл вносят в жидкую питательную среду и выращивают при температуре 28°C в течение 48 ч. При культивировании штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 не нуждается в факторах роста.
4. Хранение штамма
Для хранения штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 используют метод периодических пересевов на скошенный МПА (3-4 раза в год). После пересевакультивирование штамма ведут при температуре 28°C в течение 48-72 ч, после чего культуру хранят при температуре 4°C.
Заявляемый штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 хранится в коллекции кафедры «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВПО АГТУ, во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов.
Для исследований использовалась суспензия заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 с титром клеток 108 КОЕ/мл.
Применение заявляемого штамма поясняется нижеприведенными примерами.
Пример 1. Изучение фунгицидной активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474.
Фунгицидную активность в отношении тест-объектов фитопатогенных грибов определяли методом диффузии в агар с использованием лунок. В качестве тест-объектов использовали фитопатогенные грибы, являющиеся возбудителями различных заболеваний сельскохозяйственных культур: Alternaria species, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Cladosporium species. Культуры фитопатогенных грибов поддерживали на агаризованной среде Чапека при 24°C и хранили на кафедре «Прикладная биология и микробиология» ФГБОУ ВПО АГТУ.
Для получения суспензии тест-объектов мицелиальную культуру выращивали газоном на поверхности чашки Петри с агаризованной средой Чапека в течение 14 суток. Выросшую спорово-мицелиальную массу брали с поверхности среды бактериологической петлей и вносили в пробирку с 9 мл стерильной дистиллированной воды. 0,5 мл полученной суспензии вносили в стерильные чашки Петри, после чего добавляли остуженный до 40-45°C бобовый агар. После того как среда застыла, стерильным пробочным сверлом вырезали лунки. Параллельно готовили суспензию штамма. Для чего производили смыв с поверхности скошенного агара 10 мл физраствора. 0,1 мл полученной суспензии аккуратно вносили в лунки (титр клеток 108 КОЕ/мл). В центральную лунку вносили 0,1 мл физраствора. Данная лунка является контролем эксперимента. Чашки Петри инкубировали в термостате при 24°C в течение 7 суток (см. методические указания И.С. Дзержинская «Методы выделения, исследования и определения антибиотической активности микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами». - Астрахань: Изд-во АГТУ, 2005. - 76 с.).
В зоне около контрольной лунки (контроль) наблюдался интенсивный рост мицелия тест-объектов во всех чашках Петри, что говорит о достоверности эксперимента. Возле лунок с внесением суспензии штамма наблюдалось полное отсутствие роста тест-объектов в зоне ингибирования. В условиях непосредственного взаимодействия Bacillus atrophaeus ВКПМ B-11474 формирующийся мицелий плесневых грибов отличался ярко выраженными морфологическими видоизменениями. Под воздействием Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 наблюдалось ограничение развития ростковых трубок с образованием на кончиках растущих гиф плесневых грибов сферопластоподобных структур. Нарушения в развитии гиф приводили к образованию излишне разветвленного, септированного, часто вакуолизированного мицелия, напоминающего нитку бусин. Также было отмечено уменьшение спорообразования.
Оценку уровня фунгицидной активности осуществляли по зонам ингибирования (диаметр стерильных зон в мм) в мицелиальном газоне, образующимся вокруг лунок. Спектр подавляемых фитопатогенных грибов и уровень фунгицидной активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 представлен в таблице 1.
Вышеприведенные данные свидетельствуют о более высокой фунгицидной активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 по сравнению со штаммом Bacillus atrophaeus SKD-1, предложенным в качестве прототипа. Заявляемый штамм оказывает более активное фунгицидное действие на ряд фитопатогенных грибов: Alternaria species (33 мм), Fusarium graminearum (23 мм), Fusarium culmorum (30 мм), Cladosporium species (40 мм) по сравнению со штаммом Bacillus atrophaeus SKD-1, который оказывает менее выраженное фунгицидное действие на фитопатогенные грибы: Alternaria species (24 мм), Fusarium graminearum (19 мм), Fusarium culmorum (22 мм), Cladosporium species (29 мм).
Пример 2. Изучение ростстимулирующей активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474.
Стимулирующий эффект заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 демонстрировали на семенах кресс-салата (сорт «Весенний»). Семена предварительно стерилизовали в 70% этаноле, отмывали их стерильной дистиллированной водой и помещали во влажные камеры стерильным по 50 штук в каждую. После этого семена поливали суспензией Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 (смыв делают 10 мл физраствора) с титром клеток 108 КОЕ/мл. Параллельно ставили контрольные влажные камеры с семенами, политыми физраствором вместо суспензии штамма. Чашки Петри проращивали в люминостате при температуре 25°C. Через 5-7 суток производили подсчеты всхожести семян и учитывали морфометрические показатели проростков (см. учебное пособие Г.М. Зенова «Практикум по биологии почв». - М.: Изд-во МГУ, 2002 - 120 с.).
Наличие ростстимулирующего действия заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 на семена кресс-салата представлено в таблице 2.
Заявляемый штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 оказывает более выраженное ростстимулирующее действие (стимулирует рост на 57%) по сравнению со штаммом Bacillus atrophaeus SKD-1 (стимулирует рост на 17%).
Пример 3. Изучение влияния заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ B11474 на стимуляцию роста томатов и зараженность фитопатогенными грибами в открытом грунте.
Вегетационный опыт проводят на томате сорта «Подарочный» в открытом грунте ООО «Надежда-2» Камызякского района Астраханской области, по общепринятой методике полевых и вегетационных опытов (см. методические указания Б.А. Доспехов «Методика полевого опыта». - М.: Агропромиздат, 1985. - 351 с.).
Семена томата сеяли в пленочную теплицу. Затем выращенные всходы перед высадкой в открытый грунт опрыскивали суспензией штамма. Суспензию заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 получали путем наращивания биомассы штамма на бобовом отваре с титром клеток 108 КОЕ/мл. Первый пролив суспензии под корень растений осуществили в фазу бутонизации томата, второй пролив - во время цветения. Рассаду томата размещали на однорядковых делянках, с междурядьями в 2,5 м. Расстояние между растениями в ряде составляло 1 м. Вегетационный опыт длился 5 месяцев.
Наступление основных фаз развития растений томата проходило во всех случаях одновременно. Данные биометрических измерений, проведенные во время плодообразования, показывают, что использование заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 не оказывает отрицательного влияния на рост и развитие растений томата (таблица 3).
Наиболее эффективным видом обработки суспензии заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 является двойной пролив под корень растений. Данный вид обработки максимально стимулирует рост растений и приводит к приросту биомассы.
Использование суспензии заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 сдерживало развитие альтернариоза, вызываемого фитопатогенными грибами рода Alternaria, на протяжении всего периода эксперимента (таблица 4).
Наиболее высокий показатель биологической эффективности применения суспензии заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 против альтернариоза наблюдался во время цветения 2-й кисти в варианте с обработкой почвы перед посадкой и двукратным проливом под корень растений во время вегетации (на 56,9%). Показатели эффективности этого варианта оставались выше других на протяжении всего периода эксперимента.
Сдерживание развития альтернариоза на растениях томата способствовало увеличению урожайности (таблица 5).
Применение суспензии заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 в варианте с обработкой почвы перед посадкой и двукратным проливом под корень растений во время вегетации дало 17,2% прибавку урожайности и снижение содержания больных плодов в урожае до 0,5%.
Заявляемый штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 оказывает более эффективное действие на стимуляцию роста и на прирост зеленой биомассы томатов по сравнению со штаммом Bacillus atrophaeus SKD-1, предложенным в качестве прототипа. Однако томат является овощной культурой, для которой важен больший выход плодовой массы. Штамм Bacillus atrophaeus SKD-1 в вегетационном опыте показал прирост зеленой биомассы томатов, однако из-за непродолжительности опыта (37 дней) не показано влияние штамма на зараженность растений болезнями, вызываемыми фитопатогенными грибами, на выход плодовой массы и урожайность томата.
Вегетационный опыт заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 длился 5 месяцев - от фазы бутонизации томата до созревания плодов 2 кисти. В результате чего был прослежен весь цикл вегетации томата, который дал возможность изучить влияние заявляемого штамма на зараженность растений альтернариозом и на урожайность томата.
Заявляемый штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 оказывает влияние на развитие альтернариоза на протяжении всего периода эксперимента, снижая количество заболевших растений и плодов. Сдерживание развития альтернариоза, в свою очередь, способствовало увеличению урожайности томатов и снижению содержания больных плодов в урожае.
Положительный эффект заявляемого штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 заключается в широком спектре высокой фунгицидной активности к фитопатогенным грибам, вызывающим заболевания сельскохозяйственных культур; в стимулирующем действии на рост и развитие сельскохозяйственных культур.
Источники информации
1. Патент РФ №2337955.
2. Патент РФ №2495119.
3. Коряжкина М.Ф. «Использование культуры Bacillus atrophaeus SKD-1 для разработки биопрепарата с фунгицидными свойствами». Первые Международные Беккеровские чтения. Сборник научных трудов по материалам конференции 27-29 мая, Волгоград, 2009 г., в 2-х частях, Ч. 2. С. 121-123 (прототип).
Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению бактериальных штаммов, обладающих фунгицидными и ростстимулирующими свойствами. Штамм Bacillus atrophaeus депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ B-11474. Данный штамм обладает фунгицидными свойствами и ростстимулирующей активностью и может быть использован в растениеводстве в качестве средств для защиты сельскохозяйственных растений от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами, улучшения фитосанитарного состояния почв, стимуляции роста сельскохозяйственных растений. Изобретение позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных растений. 5 табл., 3 пр.
Штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 в качестве средства для стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных культур от фитопатогенных грибов.
