ШТАММ БАКТЕРИЙ Serratia ficaria ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ЗАЩИТЫ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ Российский патент 2015 года по МПК A01N63/02 C12N1/20 C12R1/425 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, в частности к штамму Serratia ficaria TP (депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУПГосНИИГенетика, коллекционный номер ВКПМ В-11403), обладающему выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами, который может быть использован для получения биопрепарата для стимуляции роста сельскохозяйственных растений и защиты от фитопатогенных грибов.

Известен штамм Trichoderma harzianum BKM F-2477 Д (см. патент РФ №2094991, 1997 г.), используемый для разработки средств защиты стеблей огурца и томата от фитопатогенов в условиях закрытого грунта.

Недостатками использования данного штамма является низкая степень защиты от заболеваний на стеблях растений в отдельных очагах из-за низкой плотности популяции антагониста на стеблях и не превышающей 20-45 шт./см². Поэтому наблюдается незначительное ингибирование развития патогенов (возбудителей аскохитоза, белой и серой гнилей) на стеблях растений, что вызывает их гибель.

Известен штамм Bacillus subtilis (см. патент РФ №2083109, 1997 г.), используемый для защиты от корневых гнилей зерновых, а также обработке плодов косточковых при хранении.

Недостатками использования данного штамма является недостаточная эффективность в отношении ряда возбудителей, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами.

Известен штамм Agrobacterium radiobacter (см. патент РФ №2051586, 1996 г.), стимулирующий прорастание семян томата, а также их дальнейшее развитие.

Недостатками данного штамма является его способность легко приобретать вирулентные свойства и вызывать раковые заболевания двудолевых растений после переноса в его клетки онкогенной Ti-плазмиды из близкородственных вирулентных штаммов Agrobacterium tumefaciens.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ №Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ №Д24 (Патент РФ №2302114, 2007 г.), используемый в качестве биологического средства борьбы с возбудителями болезней растений и стимуляции их роста, и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Существенными недостатками известного способа культивирования является узкая область его антагонистического действия на патогенные микроорганизмы.

Техническая задача - выделение штамма с антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами.

Технический результат - стимуляция роста и защита сельскохозяйственных растений от фитопатогенов с помощью предлагаемого штамма. Он достигается тем, что в качестве средства для стимуляции и защиты сельскохозяйственных растений предлагается штамм бактерий Serratia ficaria ВКПМ В-11403. Штамм был выделен при высеве на питательные среды (Мясопептонный агар (МПА), картофельный и томатный агары) и в последующем в чистую культуру методом последовательных пересевов по общепринятой методике (Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.; Пономарева Т.С. Микроорганизмы ассоциированные с растениями сем. Пасленовых (на примере томата сорта «Королевский» / Естественные науки АГУ. - 2012).

Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в ФГУПГосНИИГенетика.

Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 07.10.2013, коллекционный номер ВКПМ В-11403. Справка о депонировании штамма прилагается.

Штамм Serratia ficaria ВКПМ В-11403 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

1. Культурально-морфологические признаки

Грамотрицательные палочки. Клетки - прямые или слегка изогнутые. Палочки располагаются одиночно. При росте на МПА штамм образует колонии круглой формы с волнистым краем, выпуклым профилем, блестящие, непрозрачные, слизистые, светло-белого цвета. На средах, богатых органикой (МПА, картофельно-минеральный агар Одоевского), колонии штамма могут окрашиваться в светло-желтый цвет. Палочки имеют длину 5,95 мкм, а ширину 0,85 мкм.

2 Физиолого-биохимические признаки

Штамм каталазоположительный, в качестве единственного источника углерода использует глюкозу, сахарозу, глицерин, незначительно лактозу и маннит. Способен разжижать желатин, гидролизовать казеин. Обладает лецитазной активностью. Способен образовывать нитриты при использовании нитратных форм азота.

Штамм способен к росту на картофельно-минеральном агаре Одоевского, МПА, РПБ, бобовом отваре, Чапека, средах Эшби и Бейеринка с различными источниками углевода и т.д.

Генетические особенности штамма: штамм не нуждается в факторах роста, стабилен и не является генетически модифицированным.

3. Условия культивирования

Для наращивания биомассы его культивируют при температуре 28°C на картофельном отваре.

4. Хранение штамма

Для хранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА. Культивирование после пересева ведут при температуре 28°C в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°C. Штамм хранится в коллекции лаборатории Агроэкологии кафедры «Гидробиология и общая экология», а также во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Для исследования использовалась суспензия Serratia ficaria TP с титром клеток 10⁹, обладающая наибольший фитостимулирующий активностью.

Применение штамма

Пример 1. Изучение фунгицидной активности штамма

Фунгицидная активность штамма изучена методом укола между бактериальным изолятом Serratia ficaria ВКПМ В-11403 и плесневыми грибами, выделенными с поверхности томата и взятыми (Alternaris sp., Penicillium restrictum и Penicillium citrinum) из коллекции НИЛ «Микробиологического мониторига» АГТУ (Fusarium graminiarum, Fusarium chlamydosporum, Gliocladium sp., Verticillium sp.).

В чашку Петри с засеянным газоном плесневых грибов делали уколами посев бактериального штамма. Каждый посев делали в четырех проворностях. Контролем служила дистиллированная вода.

В таблице 1 показан диаметр зоны ингибирования между исследованным изолятом Serratia ficaria ВКПМ В-11403 и плесневыми грибами.

Табл.1 Диаметр зоны ингибирования между исследованным изолятом Serratia ficaria ВКПМ В-11403 и плесневыми грибами Изолят Диаметр зоны ингибирования, мм Alternaris sp 31,5 Penicillium restrictum 24,0 Penicillium citrinum 15,1 Fusarium graminiarum 16,3 Fusarium chlamydosporum 17,4 Verticillium sp 26,5 Gliocladium sp 32,5

Анализ полученных данных показал, что один и тот же изолят обладает разной фунгицидной активностью к фитопатогенам, так спектр зон ингибирования фитопатогенных микроорганизмов колеблется в пределах от 15 до 32 мм. Наименьшие показатели диаметра зоны ингибирования отмечены по отношению к наибольшим показателям диаметра зоны ингибирования Penicillium citrinum и составляют 15,1 мм, по отношению к Fusarium graminiarum составляют 16,3 мм, Fusarium chlamydosporum - 17,4 мм, Penicillium restrictum - 24,0 мм (при микрокопировании отмечен лизис мицелия и усиленное спороношение). Наибольшие показатели диаметра зоны ингибирования отмечены по отношению к ингибированию роста фитопатогенных грибов под влиянием изолята ТР3 к Verticillium sp. и составляют 26,5 мм, Alternaris sp. - 31,5 мм (при микрокопировании был отмечен аутолизис мицелия) и Gliocladium sp. составляет 32,5 мм. (при микрокопировании было отмечено усиленное спороношение гриба).

Пример 2. Исследование фитотоксичности и фитостимуляции суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403

Для исследования фитотоксичности и фитостимуляции суспензию штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 культивировали на картофельном агаре при непрерывном перемешивании на качалке (120 об/мин). Температура культивации составила 28°C. Суспензия имела титр клеток 10⁹ КОЕ/мл.

Для возможного использования суспензии Serratia ficaria ВКПМ В-11403 с фунгицидными свойствами изучали ее токсичность и фитостимулирующую активность для растений. Используемые семена томатов сорта «Новичок», перца «Сладкий подарок», баклажана «Черный принц», кабачка «Черный красавец», семена тыквы «Биг мун» были отобраны в соответствии с ГОСТ РФ 50260-92.

В таблице 2 представлены данные по фитотоксичности суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 в виде процентного прорастания семян по отношению к контролю (дистиллированная вода).

Из таблицы 2 можно заключить, что наибольшие значения прорастания семян отмечены при обработке томата, тыквы и кабачка и составляют соответственно (%) 98,5; 97,3; 97,8.

В лаг-фазу прирост проростков составил по сравнению с контролем 70%. В эксподенциальную фазу роста происходила фитостимуляция семян кабачков по сравнению с контролем и составила 130-146%. В стационарную фазу роста фитостимуляция составила по сравнению с контролем 194%.

В таблице 3 показаны данные фитостимуляции семян при обработке исследуемым изолятом.

Табл.3 Фитостимуляция семян, % Семена По сравнению с контролем Томат 124 Перец 153 Баклажан 111 Тыква 135 Кабачок 194

Таким образом, суспензия изолята Serratia ficaria TP активизировала физиологические процессы семян сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Исследование фитостимулирующий активности Serratia ficaria ВКПМ В-11403 в открытом грунте

Исследование проводили в открытом грунте на территории фермерского хозяйства ГНУ ВНИИОБ г. Камызяк Астраханской области на семенах томата «Новичок». Образцы растений размещали на 1-рядковых делянках с междурядьями 2,6 метра. Расстояние между растениями в ряде 0,8-1 метр. Продолжительность эксперимента 3 месяца.

Бактериальный штамм Serratia ficaria ВКПМ В-11403 использовался в виде биомассы, наращенной на картофельном отваре с титром 10⁹ КОЕ/мл с последующим разведением суспензии 1:100.

Полевые испытания включали растения, выращенные в грунте без внесения удобрений и пестицидов, с бактеризацией семян суспензией изолята. Контролем служили семена томатов, выращивающиеся в открытом грунте без внесения удобрений и пестицидов.

Для каждого варианта опыта использовались 100 растений.

Семена томатов (по 300 штук для каждого варианта опыта) перед посевом предварительно замачивались в суспензии штамма Serratia ficaria ВКПМ В-11403 с титром клеток 10⁹ КОЕ/мл, а контрольные семена - в воде.

Через дне недели после появления всходов (фаза 2-4 настоящего листа) измеряли биомассу и отмечали фазы развития растений, симптомы альтернариоза и титр микроорганизмов рода Alternaria в ризосфере почвы. В таблице 4 и 5 представлены результаты полевых испытаний.

Табл.4 опыт Фазы развития томатов, в % к общему количеству растений Средняя биомасса растений, г 1 настоящего листа 2 настоящего листа 3 настоящего листа 4 настоящего листа Контроль 34,1 27,5 35,6 1,8 4,5±0,87 Обработка 24,3 9,3 58,7 2,6 9,3±0,9

Из таблицы 4 видно, что растения, обработанные суспензией Serratia ficaria ВКПМ В-11403, в развитии опережают контрольные растения.

Табл.5 Численность микроорганизмов рода Alternaria в почве и процент растений с симптомами альтернариоза Опыт % растений с симптомами альтернариоза Титр микроорганизмов Alternaria в почве, КОЕ/г Контроль 11 10⁵ обработка 0 10²

Из таблицы 5 видно, что в контроле количество растений с признаками заболеваний составило 11%, а в опыте 0%, что свидетельствует о высокой антагонистической активности изолята.

Табл.6 Количество урожайных кустов и урожайность томатов Вариант опыта Количество урожайных кустов (%) Урожайность томатов (кг/куст) Контроль 34,1±2,6 0,339±0,106 Обработка 39,1±3,5 0,631±0,212

Из таблицы 6 видно, что количество урожайных кустов в контроле составило 36,1%, в опыте составило 39,1%. Урожайность томатов в контроле составила 0,339 кг/куст, а при обработке суспензией составила 0,631 кг/куст.

Таким образом, заявленный штамм обладает фитостимулирующими свойствами и подавляет развитие фитопатогенных грибов.

Источники информации

1. Патент РФ №2094991, 1997.

2. Патент РФ №2083109, 1997.

3. Патент РФ №2302114, 2007 (прототип).

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для получения биопрепаратов. Штамм Serratia ficaria TP депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11403 и обладает выраженными антагонистическими, фитостимулирующими и фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам. Изобретение позволяет повысить рост и урожайность растений. 6 табл., 3 пр.

Штамм Serratia ficaria ВКПМ В-11403 в качестве средства для стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов.