СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/65 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности производству препарата, используемого в качестве биологического средства борьбы с возбудителями болезней растений и стимуляции их роста.

Известен препарат для стимуляции роста и защиты растений от грибов, содержащий суспензию штамма бактерий Pseudomonas putida с концентрацией клеток 1⋅10⁹ кл/мл (RU 1805849, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 30.03.1993).

Недостатком известного препарата является узкий спектр фунгицидного действия.

Известен препарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, включающий комплекс штаммов бактерий Pseudomonas species 7Г, Pseudomonas species 7Г2К, Pseudomonas species 17-2, взятых в соотношении 1:2:1-2:1:2 с концентрацией (2-5)⋅10¹⁰ кл/мл и дополнительно содержит гуматы с микроэлементами (RU 2130264, МПК A01N 63/00, опубл. 20.05.1999).

Недостатками известного препарата являются длительность получения вследствие использования комплекса штаммов, а также для культивирования микроорганизмов данного препарата используются дорогостоящие компоненты среды (триптон или пептон, дрожжевой экстракт), что повышает стоимость готового продукта.

Известен препарат «Экстрагран» для стимуляции роста и защиты растений от болезней, содержащий штаммы микроорганизмов Bacillus mycoides var. В.А. ВНИИСХМ №Д138 и Azotobacter vinelandii var. НП ВНИИСХМ №Д24 с титром клеток (0,8-1,2)⋅10⁸ кл/мл, взятых в соотношении (1,8-2,2):1, а также гуматы с микроэлементами (RU 2302114, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1/065, C12R 1/07, опубл. 10.07.2007).

Недостатком препарата, включающего штаммы бактерий разной таксономической принадлежности, являются различия в питательных потребностях, условиях культивирования и проявления максимальной эффективности полезных свойств.

Кроме того, указанные биопрепараты недостаточно эффективны для защиты растений против широкого спектра возбудителей заболеваний растений.

Известен препарат для стимуляции роста растений, содержащий суспензию клеток штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens HI6 в концентрации (2-4)⋅10⁹ кл/мл. Препарат позволяет повысить урожай растений за счет стимулирующей активности, но не защищает растения от широкого спектра фитопатогенов (RU 2001950, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 30.10.1993).

Известен штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, проявляющий антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium funiculosum (RU 2203945, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубл. 10.05.2003).

Известный штамм используется только в качестве препарата против заболеваний пшеницы, также отсутствуют сведения о его ростостимулирующем действии. При получении препарата в состав среды входят такие компоненты как пептон и дрожжевой экстракт, что значительно повышает его стоимость.

Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4, полученный методом аналитической селекции природных изолятов по принципу отбора продуцентов, обладающих достаточно высокой антагонистической активностью по отношению к грибам-фитопатогенам, вызывающим корневые гнили пшеницы (RU 2245918, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, C12R 1:065, опубл. 10.02.2005).

Недостатком известного штамма бактерий является его действие только на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, а также длительность культивирования продуцента.

Известен способ получения биологического препарата для стимуляции роста растений, включающий совместное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006 (Pseudomonas aureofaciens ВКПМ B-5787) на «мелассной среде оптимизированного состава» в термостатируемом шейкере-инкубаторе при температуре 28-29°C в течение 2 сут (Захаркина А.С. Изучение развития семян кукурузы при обработке бактериальными суспензиями на основе ризосферных бактерий Pseudomonas aureofaciens и Azotobacter vinelandii / А.С. Захаркина, С.А. Ибрагимова, В.В. Ревин // Матер. IX Междунар. науч.-практич. конф. «Ресурсосберегающие экологически безопасные технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции», Саранск, 18-19 апреля 2013 г., с. 68-71).

В известном способе не раскрыты условия получения маточных культур, а также оптимизированный состав опытной среды. Кроме того время культивирования бактерий составляет 2 сут (в заявленном изобретении оно сокращено до 20-22 ч).

Известно, что при совместном культивировании Pseudomonas aureofaciens 2006 и Azotobacter vinelandii Д-08 на питательной среде на основе послеспиртовой барды и мелассы (оптимальная концентрация мелассы 40 г/л) число живых клеток достигало максимума к 20-25 часам роста, с титром 1,2*10¹¹ КОЕ/мл - на 20 час роста (Захаркина А.С. Оптимизация роста ризосферных бактерий на отходах пищевой промышленности / А.С. Захаркина, Т.М. Бабабкина, В.В. Ревин // Матер. Междунар. науч. конф. «Достижения и перспективы развития биотехнологии», МГУ им. Н.П. Огарева, 3-5 октября 2012 г., с. 60-61).

В известном решении совместное культивирование Pseudomonas aureofaciens 2006 и Azotobacter vinelandii Д-08 проводят «на жидкой фракции барды, варьируя концентрацию мелассы от 0 до 50 г/л с интервалом 10 г/л». При этом также не раскрыты условия получения инокулята. В заявленном изобретении в качестве основы, как для маточной, так и для производственной среды используется только меласса, что значительно снижает себестоимость готового продукта.

Известно, что бактерии рода Azotobacter vinelandii являются эффективным стимуляторами роста растений и обладают широким спектром антагонистической активности по отношению к фитопатогенным микромицетам, что определено продуцированием метаболитов с антибиотической активностью (Пугачева Е.Г. Бактерии Azotobacter vinelandii - основа биопрепарата, обладающего фунгицидной активностью / Е.Г. Пугачева // Автореф. дисс. к.б.н., 17.12.2014, с. 3, 4, 9, 18-21).

В известно решении описываются свойства монокультур на основе Azotobacter vinelandii. «На основе штамма бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 разработан новый биопрепарат «Азолен», предназначенный для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и стимуляции роста» (Научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat. Режим доступа: http://www.dissercat.com/content/bakterii-azotobacter-vinelandii-osnova-biopreparata-obladavushchego-fungitsidnoi-aktivnostvu#ixzz5LnIEk2yk). При этом «для получения препарата штамм выращивают на безазотистой питательной среде в течение 60 ч при 28-30°C с аэрацией до титра 10¹⁰ КОЕ/мл». Данный штамм «оказывает антагонистическое действие на возбудителей корневых гнилей пшеницы». В заявленном изобретении предлагается способ получения биопрепарата комплексного действия на основе консорциума бактерий разного вида, позволяющих расширить спектр подавляемых фитопатогенов и свойства получаемого продукта, а также сократить общую продолжительность технологического процесса.

Наиболее близкими по технической сущности к заявляемому изобретению являются способы культивирования штаммов бактерий Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 и Pseudomonas aureofaciens 2006.

Известен биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 ч, а вторую - на той же среде в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объему воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды (RU 2289620, МПК C12N 1/20, A01N 63/00, C12R 1/065, опубл. 20.12.2006).

Известный биологический препарат обладает низкой эффективностью действия против грибных и бактериальных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, длительной продолжительностью культивирования продуцента и отсутствием способности к фосфатмобилизации.

Известен способ культивирования бактерии Pseudomonas aureofaciens 2006 на мелассе с добавлением источников азотного (NaNO₃ 2 г/л) и фосфорного (КН₂РО₄ 2,5 г/л) питания. Полученная бактериальная суспензия оказывает положительное влияние на развитие семян пшеницы и обладает антифунгальным действием к ряду фитопатогенов (Бурова Ю.А., Ибрагимова С.А., Ревин В.В. Получение бактериальной суспензии Pseudomonas aureofaciens 2006 на мелассе и изучение некоторых ее свойств. Вестник Оренбургского государственного университета. №10. (146). октябрь, 2012. С. 61-65).

Недостатком данного способа является культивирование монокультуры, не проявляющей способности к азотофиксации, и использование для получения инокулята среды Кинга, содержащую пептон, что повышает себестоимость готового препарата.

Задачей изобретения является разработка способа получения нового биологического препарата комплексного действия (фунгицидного, стимулирующего рост и развитие растений, повышающего урожайность растений и уровень почвенного плодородия) с высокими количественными характеристиками на основе биомассы консорциума микроорганизмов, при использовании которого может быть достигнут технический результат, заключающийся в обеспечении снижения затрат на его производство.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения нового биологического препарата в качестве питательной среды для культивирования двух микроорганизмов-продуцентов используется отход сахарного производства (меласса), при этом время ферментации сокращается до 20-22 ч.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения биологического препарата для стимуляции роста и защиты растений от заболеваний включает совместное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787 на питательной среде, основой которой является меласса. Штаммы бактерий раздельно засевают в жидкую мелассную среду и культивируют в условиях аэрации до достижения титра не менее 500 млн кл/мл, получая маточные культуры, которые засевают в производственную питательную среду на основе мелассы в соотношении 2:1 и выращивают до достижения титра клеток не менее 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл. Продолжительность ферментации составляет 20-22 ч.

В табл. 1 показаны ростовые показатели семян при обработке биологическим препаратом; в табл. 2 и на фиг. 1 - степень ингибирования роста грибов при обработке биологическим препаратом.

Штамм бактерии Pseudomonas aureofaciens депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером штамм Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634.

Штамм бактерии Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 выделен с ризосферы ячменя и отселекционирован путем многоступенчатого отбора по признакам: широкий спектр высокой антагонистической активности к различным фитопатогенным микромицетам; высокая продуктивность культуры и технологичность в производственных условиях; высокий уровень ферментативной активности (протеазы, хитназы); способность повысить прорастание семян и способствовать повышению уровня урожайности растений; возможность использования в виде баковой смеси с гербицидами.

Таксономическая принадлежность штамма бактерии Pseudomonas aureofaciens определена при помощи анализа секвенированных нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, в базе данных GenBank и RDP-II (http://www.cmt.msu.edu).

Штамм Azotobacter vinelandii Д-08 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером штамм Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787.

Способ получения биологического препарата осуществляется следующим образом.

Предварительно получают маточные культуры микроорганизмов. При этом хранение штаммов продуцентов осуществляют на скошенном питательном агаре.

Состав среды для культивирования бактерии Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634, г/л: сахароза - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; пептон - 10,0; агар-агар - 18,0; pH среды 6,8-7,0.

Состав среды для культивирования бактерии Azotobacter vinelandii Д-08 ВКПМ В-5787, г/л: сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт - 0,5; K₂HPO₄ -0,8; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2; CaSO₄⋅7H₂O - 0,1; FeCl₃ - следы; Na₂MoO₄ - следы; агар-агар -20,0; рН среды - 6,8-7,0.

Штаммы бактерий раздельно засевают в питательную мелассную среду и культивируют в условиях аэрации до достижения титра не менее 500 млн кл/мл.

Питательный агар стерилизуют при 1 атм в течение 45 мин. Культуры штаммов микроорганизмов засевают на приготовленный агар и затем культивируют в течение 2-3 сут при температуре 28°С. После накопления биомассы на скошенном агаре производят засев маточной колбы с мелассной средой, г/л: меласса - 40; KH₂PO₄ - 0,2; K₂HPO₄ - 0,8; NaNO₃ - 1.

Выращивание инокулята проводят при 150 об/мин и температуре 28°С в течение 24 ч. Маточные культуры вносятся в производственную мелассную среду из расчета 3-5% от засеваемого объема приготовляемого препарата. Соотношение вносимых штаммов Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii Д-08 ВКПМ В-5787 составляет 2:1. Выращивание ведут при 180 об/мин и температуре 28°С в течение 20-22 ч до достижения титра клеток не менее 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл.

В результате получают концентрированный биологический препарат, который далее используется для приготовления рабочего раствора. Рабочий раствор используют для корневой и внекорневой обработки растений, обработки почвы и семян.

Нормы расхода препарата - предпосевная обработка семян 0,1 л/т; обработка по вегетации - 0,2-0,3 л/га. При приготовлении рабочего раствора концентрат необходимо разводить водой в соотношении 1:100.

Допускается к применению на злаковых культурах, томатах, огурцах, кукурузе, свекле.

Готовый препарат содержит живые клетки бактерий, внеклеточные метаболиты (сидерофоры, антибиотики, фитогормоны, ферменты). Заявляемый биологический препарат осуществляет положительное влияние на растения посредством прямой и непосредственной стимуляции роста растений за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений, и за счет вытеснения и подавления развития почвенных фитопатогенов, угнетающих рост растений. Одновременно заявляемый препарат синтезирует регуляторы роста растений типа ауксинов и цитокининов, улучшает фосфорное питание растений, способен к фиксации у растений атмосферного азота и индукции у растений устойчивости к фитопатогенам.

Микробный компонент способствует подавлению роста и развития почвенных фитопатогенов, вызывающих распространенные заболевания сельскохозяйственных культур: фузариоз (F. culmorum, зона ингибирования роста 89,0%), альтернариозы различных типов (A. solani А7 МУКЗ, зона ингибирования роста 76,4%; A. tenuissima, зона ингибирования роста 83,4%; A. solani А7 МУК4, зона ингибирования роста 77,9%; A. infectoria, зона ингибирования роста 89,9%; A. alternata, зона ингибирования роста 87,5%), поражения пыльной головней (U. avenae, зона ингибирования роста 85,5%) и др. за счет синтеза антибиотиков, ферментов, сидерофоров. Биологический препарат также оказывает ростостимуирующее действие за счет синтеза бактериями фитогормонов, а также процессов азотофиксации. Дает увеличение всхожести на 20-23%, сухой массы проростков на 20-23%. При обработке растений биопрепаратом наблюдается повышение степени адгезии микроорганизмов на корнях (титр клеток составляет 3,8⋅10¹² КОЕ/г).

При проведении экспериментальных исследований заявляемого биологического препарата в полевых условиях на территории Республики Мордовия было установлено стимулирующее воздействие препарата на развитие злаковых культур (увеличение фактической урожайности в среднем на 15-30%, эффективное подавление различных заболеваний в них, защита растения от корневой гнили). Способность бактерий из состава микробных штаммов препарата прикрепляться к поверхности корневой системы растений и адаптироваться к специфическим условиям существенно снижает пораженность растений фитопатогенами и увеличивает прорастаемость семян сельскохозяйственных культур (табл. 1, 2, фиг. 1). Использование заявляемого препарата в сельскохозяйственной практике найдет широкое применение в современной агробиотехнологии.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения:

Пример 1.

Штаммы бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii Д-08 ВКПМ В-5787 выращивали в колбах на качалке на питательной среде следующего состава, г/л: меласса - 40; KH₂PO₄ - 0,2; K₂HPO₄ - 0,8; NaNO₃ - 1,0; рН среды 6,8-7,0. Время выращивания 20 ч, температура 28°С.Данный раствор является концентрированным биологическим препаратом (максимальный титр достигает 10¹³ КОЕ/мл).

Рабочий раствор готовили следующим образом: 1 мл концентрированного биологического препарата разводили в 100 мл воды.

Ростстимулирующую активность препарата проверяли на семенах пшеницы сорта «Московская 39» и семенах кукурузы сорта «Краснодарский». Обработка препаратом включала замачивание семян в количестве 100 шт. в рабочем растворе биопрепарата в течение 60 мин. Для определения энергии прорастания, обработанные семена помещали в чашки Петри на смоченную водой фильтровальную бумагу. По истечении 3 сут после обработки посевного материала определяли энергию прорастания семян, а на 7 сут - всхожесть. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Пример 2.

Штаммы бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii Д-08 ВКПМ В-11634 выращивали в колбах на качалке на питательной среде следующего состава, г/л: меласса - 40; KH2PO4 - 0,2; K2HPO4 - 0,8; NaNO3 - 1,0; рН среды 6,8-7,0. Время выращивания 20 ч, температура 28°С. Данный раствор является концентрированным биологическим препаратом (максимальный титр достигает 10¹³ КОЕ/мл).

Рабочий раствор готовили следующим образом: 1 мл концентрированного биологического препарата разводили в 100 мл воды.

1. Антоганистическую активность препарата проверяли в отношении тест-грибов: F. culmorum, В. cinerea, A. alternata, A. solani, A. tenuissima, P. oligandrum, Т. tritici.

Препарат вносили в лунки на твердую агаризованную среду, на которой предварительно была засеяна газоном тест-культура. После инкубирования засеянных чашек Петри в течение 48 ч при температуре 28°C измеряли величину зоны ингибирования роста тест-культуры. Результаты исследований представлены на фиг. 1.

2. Антоганистическую активность препарата проверяли в отношении тест-грибов: F. culmorum, В. cinerea, A. solani, A. tenuissima. Сначала на поверхность агара в чашке Петри засевали исследуемый препарат и термостатировали при 28°C. Через сутки в центр чашки вносили агаровый блок фитопатогена. По диаметру колонии гриба оценивали ингибирование роста фитопатогена (через 3 и 10 сут). Расчет ингибирующей активности препарата проводили по формуле Эббота (1) как процент ингибирования роста колонии гриба:

где Дк - диаметр колонии гриба в контроле, см; До - диаметр колонии гриба в опыте.

Результаты исследований представлены в табл. 2.

Таким образом, препарат обладает повышенной активностью против широкого спектра болезней и ростостимулирующим действием и может быть использован для повышения урожайности сельскохозяйственных культур за счет ускорения прорастаемости семян, стимуляции роста растений и снижения пораженности растений и почв фитопатогенными возбудителями.

По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет получить биологический препарат комплексного действия (фунгицидного, бактерицидного, стимулирующего рост и развитие растений, повышающего урожайность растений и уровень почвенного плодородия) с высокими количественными характеристиками на основе биомассы консорциума микроорганизмов, а также снизить себестоимость готового продукта. Высокий уровень рентабельности технологического процесса получения заявляемого биопрепарата согласно формуле изобретения обеспечивается невысокой продолжительностью процесса, низкой стоимостью исходного сырья, высокой продуктивностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения препарата для стимуляции роста и защиты сельскохозяйственных культур. Способ включает раздельное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787 в мелассной среде до достижения титра не менее 500 млн кл/мл. Затем полученные маточные культуры засевают в питательную мелассную среду в соотношении 2:1 и выращивают совместно до достижения титра клеток не менее 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл в течение 20-22 ч. Способ обеспечивает получение биологического препарата фунгицидного действия и стимулирующего рост и развитие растений. 1 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ получения биологического препарата для стимуляции роста и защиты растений от заболеваний, включающий совместное культивирование штаммов бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-11634 и Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5787, при этом штаммы бактерий раздельно засевают в питательную мелассную среду и культивируют в условиях аэрации до достижения титра не менее 500 млн кл/мл, получая маточные культуры, которые засевают в питательную среду на основе мелассы в соотношении 2:1 и выращивают до достижения титра клеток не менее 10¹⁰-10¹¹ КОЕ/мл, а продолжительность ферментации составляет 20-22 ч.