Питательная среда для получения дрожжевых клеток диморфного гриба Histoplasma capsulatum Российский патент 2019 года по МПК C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к лабораторной микологии и касается получения клеток дифазного микроскопического гриба Histoplasma capsulatum в тканевой (паразитической) фазе роста при его культивировании in vitro.

Возбудитель особо опасной микотической инфекции - гистоплазмоза - Histoplasma capsulatum - микромицет II группы патогенности, характеризующийся дифазным характером роста (мицелиальной - во внешней среде и тканевой - в организме теплокровных). Описано 3 варианта возбудителя - Histoplasma capsulatum var. capsulatum, H capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum

Восприимчивость населения к заражению считается всеобщей. Инфицирование человека происходит элементами мицелия гриба - макро- и микроконидиями, которые при попадании в макроорганизм трансформируются (конверсируют) в тканевую (или паразитическую) форму, которая представляет собой округлые слегка удлиненные клетки (1,5-2,2×3,0-3,5) мкм, оккупирующие систему тканевых макрофагов, где они реализуют свою способность беспрепятственно размножаться в клетках и поражать практически любые органы и ткани макроорганизма.

Верификация диагноза микоза для исхода заболевания имеет особое значение, так как связана с назначением принципиально иного по сравнению с противобактериальным этиотропного противомикотического лечения. Однако культуральная диагностика гистоплазмоза, оставаясь «золотым стандартом микробиологии», прежде всего, основывается на доказательстве диморфизма гриба и, как следствие, как можно в более ранние сроки выявления клеток возбудителя в тканевой фазе роста in vitro.

Таким образом, получение дрожжевой фазы возбудителя из мицелиальной является неоспоримым доказательством его причастности к микромицетам II группы патогенности и позволяет четко выявить специфический процесс, поэтому подбор питательной среды, на которой возможна конверсия возбудителя и его культивирование в тканевой (паразитической) фазе роста, является ключевым в ходе проведения лабораторного анализа. В связи с этим получение питательной среды, обеспечивающей эффективный рост дрожжевых клеток Н. capsulatum, приобретает в лабораторном анализе гистоплазмозной инфекции особое и существенное значение.

Для культивирования клеток Histoplasma capsulatum стандартными являются среды Сабуро и Френсиса. В состав агара Сабуро входят пептон ферментативный 10,0 г/л, D-глюкоза 40,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, агар 10,0 г/л, при необходимости - хлорамфеникол 0,05 г/л. Однако на среде Сабуро возбудитель гистоплазмоза растет в течение длительного (до 1 мес) времени и при этом формирует культуру только в мицелиальной фазе роста, когда его септированный многоклеточный диаметром от 1 до 5 мкм мицелий морфологически практически неотличим от гиф многих других плесневых грибов, в том числе однофазных III и IV групп патогенности.

Наиболее часто используемой средой для роста возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе является среда Френсиса, представляющая собой мясной бульон двойной крепости, куда в качестве требуемых питательных ингредиентов добавлены дефибринированная кроличья или лошадиная кровь (8% по объему, или 80,0 г/л), ферментативный пептон 10,0 г/л, D-глюкоза 10,0 г/л, хлорид натрия 5,0 г/л, L-цистин 1,0 г/л, агар-агар 10,0 г/л. Однако мясные экстракты трудно стандартизуемы, могут содержать в разных концентрациях антимикробные препараты, стабилизаторы вакцин, консерванты и другие компоненты, влияющие на рост микроорганизмов, что нередко приводит к ингибированию не только конверсии грибных клеток, но и непосредственно их роста. Поэтому поиск питательной среды с высокими ростовыми характеристиками, в основе которой будут находиться стандартизованные легко усвояемые возбудителем гистоплазмоза компоненты, представляет собой актуальную задачу лабораторного анализа при этой инфекции.

Ближайшим аналогом предлагаемой среды является «Питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба, сухая (FT-агар)». Как известно, возбудители туляремии являются требовательными медленно растущими микроорганизмами, которые не вырастают на простых питательных средах, в связи с чем для работы с Francisella tularensis применяют различные варианты агаровых сред на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением L-цистеина (L-цистина), D-глюкозы, дрожжевого экстракта (как источника витамина В). FT-агар, выпускаемый ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) в виде комплекта основы с глюкозо-витаминной добавкой (ГВД), при культивировании и выделении F. tularensis не требующего внесения крови или других стимуляторов роста (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство /Под ред акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-ое, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - стр. 175), и в последние годы в лабораторной диагностике туляремии ему отдается предпочтение (там же, стр. 173).

Целью изобретения является получение питательной среды на ферментированной основе, позволяющей стимулировать in vitro быструю конверсию клеток Н. capsulatum в тканевую фазу роста, а также увеличивать выход культуры и тем самым способствовать усовершенствованию лабораторной диагностики гистоплазмоза.

Цель достигается тем, что за основу питательной среды для конверсии и культивирования клеток возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе используют FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) для культивирования туляремийного микроба. В состав FT-агара входят сернокислотный гидролизат рыбной муки (17,0 г/л), который используется в предлагаемой среде вместо мясопептонного бульона двойной крепости, а также ферментированная кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (5,0 г/л), дрожжевой экстракт (2,3 г/л), сульфит натрия (0,7 г/л), сернокислый магний (0,5 г/л), L-цистеин (0,5 г/л), а также - при необходимости - глюкозо-витаминная добавка к FT-среде (6,02 г/л), в целом обеспечивающие высокие питательные потребности микроорганизмов. В предлагаемую среду к FT-агару дополнительно для обеспечения эффективного роста дрожжевых клеток Н. capsulatum вносят ферментативный пептон (10 г/л), хлорид натрия (5 г/л), а также ex tempore дефибринированную кровь лабораторного животного (козы, барана, кролика) (80,0 г/л, или 8 об %), D-глюкозу (14,0 г/л), L-цистин (1,0 г/л), RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х) - концентрат витаминов группы В фирмы Sigma (США) для тканевых культур при концентрации агара микробиологического (15,0±2,0 г/л).

Среду автоклавируют (121°С, 20 мин), остужают до 50-45°С, после чего ex tempore добавляют предварительно подготовленные растворы питательных добавок (1,0 г L-цистина разводят в 10,0 мл дистиллированной воды и стерилизуют раствор через одноразовый фильтр «Millipore» 0,45 мкм), а также используют 40% стерильный аптечный раствор глюкозы для внутривенного введения (35 мл, что составляет в конечной концентрации 14,0 г/л), готовый стерильный концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х - 10,0 мл/л) и взятую асептически дефибринированную кровь лабораторного животного (80,0 мл/л). После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри или пробирки, оставляют на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и затем используют в дальнейшей работе.

Применение полученной среды обеспечивает по сравнению с наиболее часто используемым в практике кровяным агаром Френсиса в среднем десятикратное увеличение выхода клеток Н. capsulatum, что позволяет провести выделение возбудителя при более низкой посевной дозе, при этом рост в дрожжевой (тканевой, паразитической) фазе in vitro подтверждает его принадлежность к возбудителям особо опасного микоза. В целом, такие результаты лабораторного анализа обеспечивают полноценную доказательную базу при диагностике гистоплазмоза у больных.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Пример 1. Сравнительная оценка применяемых и предлагаемой сред для конверсии и культивирования дрожжевых клеток Н. capsulatum

Культуры Н. capsulatum var. capsulatum 6651, 6652, В-630; Н. capsulatum var. duboisii 9/22, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, представленные в Коллекционном центре Волгоград НИПЧИ и пересеваемые в пробирках на агаре Сабуро в мицелиальной фазе роста, суспендировали в 0,15 М растворе хлорида натрия в концентрациях 10⁷, 10⁶ и 10⁵ кл/мл (согласно ОСО мутности ФГБУ НЦЭСМП), что в пересчете применительно к грибным клеткам составляет 2⋅10⁴-2⋅10² кл/мл соответственно (Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171). Питательные среды Сабуро, Френсиса, FT-агар готовили согласно прилагаемым инструкциям. Состав и кислотность сред представлен ниже (табл. 1).

Примечание: *СРГМ - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов

Техника приготовления среды Сабуро сводилась к внесению в 1,000 л дистиллированной воды ферментативного пептона 10,0 г, D-глюкозы 40,0 г, дрожжевого экстракта 2,0 г, агара 10,0 г, доведения до кипения при постоянном перемешивании, кипячения в течение 1-2 мин. После снятия с огня доводили до рН 6,0±0,2 и стерилизовали автоклавированием при температуре 110°С в течение 20 мин.

FT агар, изначально предназначенный для культивирования Francisella tularensis - микроорганизма, отличающегося высокими питательными потребностями, - варили согласно прилагаемой инструкции, в связи с чем 34,0 г основы размешивали в 980 мл дистиллированной воды, автоклавировали при 121°С в течение 15 мин и охлаждали до 50-45°С, после чего вносили 6,02 г глюкозо-витаминной добавки (ГВД), предварительно растворенной в 20 мл дистиллированной воды и автоклавированной при 110°С в течение 30 мин. Содержимое флакона тщательно перемешивали и стерильно разливали в чашки Петри.

При производстве агара Френсиса к мясному бульону двойной крепости (1000,0 мл) добавляли ферментативный пептон (10,0 г/л), хлорид натрия (5,0 г/л) и агар (10,0±2,0 г/л). Среду автоклавировали (121°С, 20 мин), остужали до 50-45°С и затем в нее асептически вносили ex tempore дефибринированную кровь (80,0 г/л), D-глюкозу (10,0 г/л), раствор L-цистеина (до конечной концентрации 1,0 г/л) и в стерильных условиях разливали в соответствующую лабораторную посуду.

С целью контроля стерильности чашки и пробирки, содержащие свежеприготовленный агар Френсиса, оставляли в суховоздушном термостате при 37°С на 24 часа и впоследствии использовали для проведения посевов.

Предлагаемую среду готовили на основе агара для культивирования возбудителя туляремии, для чего к 34,0 г сухой FT-среды добавляли 10,0 г ферментативного пептона, 5,0 г хлористого натрия и дополнительно 5,0 г агара, которые размешивали в 865 мл дистиллированной воды, после чего суспензию ставили на огонь и при постоянном помешивании доводили до кипения. Разливали в стеклянную посуду, затем автоклавировали при 121°С в течение 15 мин и охлаждали до 50-45°С, после чего туда последовательно ex tempore вносили заранее приготовленные стерильные растворы L-цистеина (10% - 10,0 мл), D-глюкозы (40% - 35,0 мл), концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution 100Х (10,0 мл), а также дефибринированную кровь кролика (80,0 мл/л). После тщательного перемешивания среду разливали в чашки Петри или пробирки, оставляли на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и впоследствии использовали в дальнейшей работе.

На чашки с питательными средами (Сабуро, Френсиса, FT-агар и предлагаемый питательный агар) производили посев суспензии клеток возбудителей гистоплазмоза, далее культуру растирали по поверхности агара шпателем, и чашки помещали в термостат при 37°С. Все работы с возбудителями гистоплазмоза осуществляли в соответствии с Санитарными правилами СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". - Рег. N 32325 от 19.05.2014, регламентирующими работу с возбудителями особо опасных инфекций. Спустя 5 сут культивирования осуществляли учет результатов.

Исследования проводили в трех повторностях на различных сериях предлагаемой среды (табл. 2).

Примечания: * Посевная доза для каждого наблюдения составляла 1⋅10² кл/чашку (из концентрации по ОСО мутности 10⁵ м.к./мл - 0,5 мл, что соответствует 1⋅10² клеток микромицетов / Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171).;

**Результаты (M±m) получены по результатам проведения опытов в 3-х повторностях; учет проводили на 5 сут наблюдения;

***Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ MS Office Excel путем вычисления t-критерия Стьюдента.

Как следует из данных таблицы, на 5 сут культивирования при температуре 37°С на средах Сабуро и FT-агаре роста дрожжевых клеток грибов отмечено не было, в отличие от приготовленной по классической рецептуре среды Френсиса и предлагаемой нами среды. При этом ростовые характеристики предлагаемой среды позволяли в среднем десятикратно по сравнению с традиционной средой Френсиса увеличить число конверсированных в тканевую фазу клеток возбудителей как американского, так и африканского гистоплазмоза (рис. 1. Рост дрожжевых клеток Н. capsulatum var. capsulatum 6652 на различных питательных средах (верхний ряд - среда Сабуро и FT-агар; нижний ряд - предлагаемая среда (слева) и среда Френсиса на основе мясного бульона (справа) при одних и тех же условиях посева и культивирования.)

Достоверность полученных результатов (р<0,001 и р<0,01 для возбудителей американского и африканского гистоплазмоза соответственно) была подтверждена статистическим анализом путем использования пакета компьютерных программ MS Office Excel посредством вычисления средней арифметической, ошибки средней арифметической, стандартного отклонения, дисперсии. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с использованием компьютерной программы «MS Office Excel». Различия считали достоверными при р<0,05.

Пример 2. Оптимальный состав питательной среды для конверсии и культивирования дрожжевых клеток Н. capsulatum

Для приготовления питательной среды в нашей модификации за основу питательной среды для конверсии и культивирования клеток возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе использовали FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) для культивирования туляремийного микроба, в состав которого входят сернокислотный гидролизат рыбной муки (17,0 г/л), ферментированная кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (5,0 г/л), дрожжевой экстракт (2,3 г/л), сульфит натрия (0,7 г/л), сернокислый магний (0,5 г/л), L-цистеин (0,5 г/л), агар микробиологический (10,0 г/л), куда дополнительно вносили ферментативный пептон (10,0 г/л), хлористый натрий (5,0 г/л) и 5,0 г/л агара (до конечной концентрации последнего 15±0,2 г/л вместо 10,0 г/л), а после автоклавирования (121°С, 20 мин) и охлаждения до 50-45°С ex tempore добавляли предварительно подготовленные растворы питательных добавок: взятую асептически дефибринированную кровь кролика (80,0 мл/л, или 8 об %), L-цистин - 1,0 г/л (1,0 г L-цистина разводили в 10,0 мл дистиллированной воды и стерилизовали раствор через одноразовый фильтр «Milllipore» 0,45 мкм), D-глюкозу - 14,0 г/л (использовали 40% стерильный фармакопейный раствор D-глюкозы для внутривенного введения - 35,0 мл, что составляет в конечной концентрации 14,0 г/л), а также готовый стерильный концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х - 10 мл/л).

После тщательного перемешивания среду разливали в чашки Петри и пробирки, оставляли на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и затем использовали в дальнейшей работе (табл. 3).

Примечание: *СРГМ - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов

Как следует из данных таблицы, вместо мясного бульона двойной крепости в предлагаемую среду введены в качестве белковой основы сернокислотный гидролизат рыбной муки, а также отдельные питательные ингредиенты (ферментативный пептон, дрожжевой экстракт, D-глюкоза, серосодержащие аминокислоты, соли) и биостимуляторы (дефибринированная и ферментированная кровь, витамины) при повышении во избежание разжижения среды концентрации микробиологического агара, что в целом создает условия для оптимального культивирования клеток Н. capsulatum в дрожжевой фазе роста.

Пример 3. Практическое использование предлагаемой среды для выделения дрожжевых клеток Н. capsulatum при низкой посевной дозе

При сравнительном изучении ростовых характеристик предлагаемой нами питательной среды для культивирования возбудителей гистоплазмоза в дрожжевой фазе роста и стандартных питательных сред высевы на них осуществляли в трех повторностях. Культуру Н. capsulatum var. capsulatum 6651, пересеваемую в пробирках на агаре Сабуро в мицелиальной фазе роста, суспендировали в 0,15 М растворе хлорида натрия в концентрациях 10⁷, 10⁶ и 10⁵ кл/мл (согласно ОСО мутности ФГБУ НЦЭСМП), что в пересчете применительно к грибным клеткам составляет 2⋅10⁴-2⋅10² кл/мл соответственно (Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171).

На чашки с питательными средами (Сабуро, Френсиса-МПА, FT-агар, агар Френсиса на основе FT-агара) производили посев 0,5 мл суспензии клеток возбудителя гистоплазмоза Н. capsulatum var. capsulatum 6651 из каждой концентрации (соответственно 10⁴-10² клеток микромицетов на чашку). Культуру растирали по поверхности агара шпателем и помещали в термостат при 37°С в аэробных условиях. Спустя 5 сут культивирования проводили учет результатов, после чего во избежание появления на чашках Петри культур в мицелиальной фазе роста посевы инактивировали. Все работы с возбудителями гистоплазмоза осуществляли в соответствии с Санитарными правилами СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". - Рег. N 32325 от 19.05.2014, регламентирующими работу с возбудителями особо опасных инфекций.

При учете результатов опытов, проведенных в 3-х повторностях, оказалось, что роста дрожжевых клеток Н. capsulatum на питательном агаре Сабуро, как и FT-агаре в течение срока наблюдения (5 сут) зарегистрировано ни в одном случае не было. Количество выросших колоний Н. capsulatum var. capsulatum 6651 на предлагаемой среде при расчетной посевной дозе 1⋅10² клеток микромицетов составляло 65 кл/чашку (65%), в то время как на агаре Френсиса, приготовленном на основе мясного бульона - 17 кл/чашку (17%), т.е. показатель прорастания в последнем случае не соответствовал требуемым при контроле биологических показателей питательным нормативам [3]. При этом по показателю стабильности основных свойств микроорганизма все колонии на предлагаемой среде характеризовались крупными размерами, блестящей поверхностью, ровными краями, в то время как на среде Френсиса такой однородностью культуры не отличались (рис. 2. Рост дрожжевых клеток Н. capsulatum var. capsulatum 6651 на предлагаемой среде (слева) и агаре Френсиса (справа) при одних и тех же условиях посева и культивирования).

На агаре Френсиса, приготовленном по традиционной рецептуре, был отмечен рост типичных колоний дрожжеподобных клеток возбудителя гистоплазмоза, однако в количественном выражении на предлагаемой нами среде число колониеобразующих единиц во всех наблюдениях оказывалось достоверно выше (р<0,001 для возбудителей североамериканского гистоплазмоза и р<0,01 для роста клеток возбудителей африканского гистоплазмоза), что подтверждено статистическим анализом с помощью пакета компьютерных программ «MS Office Excel».

Как следует из представленных данных, благодаря полученной среде стало возможным получение дрожжевых клеток возбудителя гистоплазмоза при минимальной посевной дозе, что имеет существенное значение в клинико-лабораторных исследованиях при верификации диагноза.

Таким образом, как для штаммов Н. capsulatum var. capsulatum, так и для возбудителей Н. capsulatum var. duboisii и Н. capsulatum var. farciminosum по ростовым характеристикам предлагаемая среда демонстрирует достоверно явное преимущество (р<0,001 и р<0,01 соответственно) и может быть с полным основанием рекомендована к практическому использованию.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бочкарев М.В., Кашкин П.Н. Гистоплазмоз. / Изд-во «ШТИИНЦА», Кишинев. - 1977. - 150 с.

2. ГОСТ ISO/TS 11133-1-2014 Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории. - М., Стандартинформ, 2015. - 16 с.

3. МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред.

4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-ое, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с.

5. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.

6. Atlas of Clinical Fungi, 2^nd ed. / G.S.de Hoog, J. Guarro, J. Gene, M.J. Figueras. - Centraalbureau voor Schimmelcultures // Universitat Rovira I Virgili, 2000. - 1126 p.

7. Kauffman, CA. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update / Clin Microbiol Rev. - 2007. - Jan., vol. 20. - pp. 115-132.

Изобретение относится к лабораторной микологии. Питательная среда для получения дрожжевых клеток диморфного микроскопического гриба Histoplasma capsulatum содержит сернокислотный гидролизат рыбной муки, ферментированную кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, дрожжевой экстракт, сульфит натрия, L-цистеин, сернокислый магний, агар микробиологический, ферментативный пептон, хлористый натрий, дефибринированную кровь животного, L-цистин, D-глюкозу, RPMI 1640 - концентрат раствора витаминов и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет стимулировать in vitro быструю конверсию клеток Histoplasma capsulatum в тканевую фазу роста и увеличить выход культуры. 2 ил., 3 табл., 3 пр.

Питательная среда для получения дрожжевых клеток диморфного гриба Histoplasma capsulatum, содержащая сернокислотный гидролизат рыбной муки, ферментированную кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, дрожжевой экстракт, L-цистеин, сульфит натрия, сернокислый магний, агар микробиологический, отличающаяся тем, что для стимуляции роста и увеличения выхода дрожжевых клеток в нее введены дополнительные компоненты: ферментативный пептон, хлорид натрия и ex tempore D-глюкоза, L-цистин, концентрат раствора витаминов 100Х RPMI 1640 и дефибринированная кровь при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

сернокислотный гидролизат рыбной муки - 17,0 г

ферментативный пептон - 10,0 г

ферментированная кровь - 5,0 г

дрожжевой экстракт - 2,3 г

D-глюкоза - 14,0 г

хлорид натрия - 5,0 г

L-цистин - 1,0 г

сульфит натрия - 0,7 г

L-цистеин - 0,5 г

сернокислый магний - 0,5 г

дефибринированная кровь - 80,0 г

RPMI 1640 раствор витаминов 100Х - 10,0 г

агар микробиологический - 15,0±2,0 г

вода дистиллированная - до 1 л,

рН 7,0±0,2.