СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ МОСКИТОЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/00 A01N63/00 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии.

Кровососущие комары являются переносчиками более 150 возбудителей болезней человека и теплокровных животных. Они являются единственными переносчиками таких болезней как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге и главными переносчиками в передаче некоторых филярий и вирусных энцефалитов. Одним из путей снижения риска заболевания человека и животных трансмиссивными болезнями является контроль численности кровососущих комаров. Основным профилактическим средством борьбы с комарами является применение инсектицидных препаратов.

Известны химические средства борьбы с кровососущими комарами: карбаматы (пропоксур), фосфорорганические (малатион, темефос, фенитротион, фенатион), пиретроиды (1).

Интенсивное применение химических инсектицидов приводит к загрязнению окружающей среды и к возникновению резистентности к действующему веществу инсектицидов у большинства видов кровососущих комаров.

Известны биологические москитоцидные препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis israelensis и Bacillus sphaericus. Преимущество биопрепаратов перед химическими инсектицидами заключается в их селективности действия, безопасности для людей и теплокровных животных, нецелевых насекомых, гидробионтов.

Однако бактериальные москитоцидные препараты на основе Bacillus sphaericus не активны против многих видов комаров, включая переносчиков малярии. Повсеместное применение бактериальных инсектицидов привело к появлению резистентных популяций комаров (2).

Известны примеры использования грибов родов Lagenidium, Coelomomyces и Culicinomyces для борьбы с личинками кровососущих комаров (3). Грибы родов Coelomomyces и Culicinomyces имеют существенный недостаток, заключающийся в необходимости их культивирования на живых организмах. В связи с этим они не могут быть наработаны в больших количествах для широкого применения. Другим недостатком этих грибов являются заметные колебания эффективности из-за сложного цикла развития гриба в природе.

Известен москитоцидный препарат Лагинекс, выпускаемый в США с 1999 года на основе штамма гриба Lagenidium giganteum (4).

Недостатком этого препарата является то, что он неактивен против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии. Активное начало препарата (зооспоры) токсичны для многих видов водной фауны.

Известны синтезируемые штаммом гриба Sesquicillium candelabrum метаболиты - дитерпеноидные пироны - канделалиды А-С, обладающие иммунодепрессантными свойствами /5/, а также производное изокумарина - сесканделин В, используемое для лечения заболеваний, возникающих при патологии ангиогенеза (рак, ревматический артрит, диабетическая ретинопатия) /6/.

Известно вещество 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон, продуцируемое грибом Gliocladium roseum и названное "аурантиоглиокладином" /7/. Известно, что аурантиоглиокладин применяется в качестве красителя в шампунях для окраски волос /8/. Данных об москитоцидной активности аурантиоглиокладина в литературе не найдено. Нет также данных о том, что гриб Sesquicillium candelabrum продуцирует 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.

Задачей изобретения является получение грибного метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, активного против различных видов кровососущих комаров.

Поставленная задача решается тем, что предлагаемый метаболит 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон продуцируется штаммом гриба Sesquicillium candelabrum F-114.

Предлагаемый метаболит активен против различных видов кровососущих комаров, в том числе против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии.

Сущность изобретения заключается в том, что 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон выделяют из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114.

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum выделен в 2004 году из образцов почвы Московской области и отобран для исследования его москитоцидных свойств путем скрининга 180 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), Оболенск, Московской области, коллекционный номер F-114.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Колонии достигают 30 мм в диаметре через 7 дней при 24°С. Оптимальная температура для роста 18-24°С, максимум 27-30°С. Обратная сторона колонии на овсяном агаре от бледно-желтоватой до бледно-оранжевой. Поверхность колонии белая, порошистая до гранулированной из-за конидиофоров и конидиальных масс, воздушный мицелий скудный или отсутствует. Конидиофоры мономорфные, кисточковидные или мутовчатые, по 3-4 в мутовке. Ножка до 100 µм высотой, до 4 µм шириной в основании, кисточки до 130 µм высотой и шириной. Первичные веточки расходящиеся, формирующие свободные боковые веточки; конечные веточки и фиалиды расходящиеся или прижатые, промежуточные фиалиды под одиночными конечными фиалидами в мутовках, иногда в мутовках вместе с конечными фиалидами, почти цилиндрические, по размеру близки к конечным фиалидам. Фиалиды бутылевидные или цилиндрические, сужающиеся в верхней части, 5-8-12 µм длиной, 3-4 µм в самой широкой части и около 1 µм шириной в верхней точке, иногда деградирующие в относительно молодых колониях. Конидии в белых колонках внахлест, гладкостенные, одноклеточные от эллипсоидных до субшаровидных, 3-5,5×1,8-3,4 µм. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 хорошо развивается в глубинной культуре на жидкой питательной среде. Динамика накопления биомассы и изменения pH культуральной жидкости (КЖ) штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 приведена в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 Возраст культуры, сутки Параметры КЖ pH Сухой вес, г/л Морфология культуры 1 2 3 4 0 5,8 14,2 Посевной материал 1 6,0 20,7 Молодой растущий мицелий 2 6,07 25,5 Длинные гифы мицелия, густо переплетенные. Мицелий слабоветвящийся, однородный 3 7,5 30,2 В гифах мицелия появились жировые включения 4 7,78 26,6 Мицелий, длинные септированные гифы с жировыми включениями; конидии отсутствуют 5 8,1 25,9 То же 6 8,35 24,8 Начало лизиса 7 8,32 22,7 Мицелий септирован, гифы с жировыми включениями. Отдельные участки гиф пустые; продолжение лизиса 1 2 3 4 8 8.3 21,9 Продолжение лизиса 9 8,27 20,1 То же 10 8,24 19,4 То же

Размер гифов - толщина от 1,5 до 2,5 мкм

Биохимические признаки

Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует фермент протеазу. Из источников азота лучше всего усваивает дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.

Антибиотические свойства

Антибиотическую (бактерицидную) активность гриба Sesquicillium candelabrum F-114 определяли на односуточной культуре бактерии Staphylococcus aureus MRSA в чашках Петри на агаризованной среде из рыбокостной муки. Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного газона. Стандартизацию проводят по величине оптической плотности (OD) водной суспензии тест-культуры на фотоколориметре при длине волны 590 нм. Результаты тестирования глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-l14 представлены в таблице 2.

Таблица 2 Бактерицидная активность глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 в отношении Staphylococcus aureus Возраст культуры, сутки Зоны подавления роста Staphylococcus aureus, мм 0 0 1 0 2 18,0 3 22,0 4 14,0 5 10,0 6 10,0 7 8,0 8 8,0 9 0 10 0

Анализ данных антибиотической активности свидетельствует о том, что к 3 суткам роста штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную антибиотическую активность.

Москитоцидная активность

Активность штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 и его метаболита определяли на личинках 2-го возраста комаров Aedes aegypti. Москитоцидная активность (LC₅₀) составила: для фугата культуральной жидкости штамма гриба 5-13%; для активного метаболита гриба от 15 до 48 м.д.

Пример 1. Культивирование штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 в колбах на жидкой питательной среде

Культуру гриба выращивают на плотной питательной среде Чапека+ в чашках Петри при температуре 23°С и относительной влажности 90% в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями. Наработку биомассы проводят в качалочных колбах на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта. Культивирование проводят при 23°С на микробиологической качалке (260 об/мин) в течение 6 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Для тестирования фугат получают центрифугированием культуральной жидкости при 4000 об/мин в течение 40 мин. Для определения LC₅₀ используют ряд последовательных двукратных разведений фугата водой. Для определения LT₅₀ используют смыв мицелиальной биомассы с чашек Петри. Для тестирования смывов суспензию в объеме 1 мл разбавляют водой до концентрации конидий 1×10⁶.

Максимальный вес сухой биомассы гриба на 3-и сутки роста составляет 30,2 г/л. Морфология культуры представляет собой длинные гифы мицелия, густо переплетенные, слабоветвящиеся с жировыми включениями. Толщина гифов от 1,5 до 2,5 µм.

Москитоцидную активность штамма определяют на личинках комаров Aedes aegypti. Активность смывов определяют по смертности личинок комаров на 1, 2, 4 и 8 день с определением среднелетального времени - LT₅₀. Активность фугата определяют по величине среднелетальной концентрации - LC₅₀. Учет смертности личинок от фугата проводят через 24 часа. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими значениями москитоцидной активности: LT₅₀ смывов равна 0,5 суток; LC₅₀ фугата культуральной жидкости равна 8,5%.

Анализ данных по динамике роста свидетельствует о том, что к 3-4 суткам штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную активность и отмечается выход культуры на стационарную фазу роста.

Пример 2. Выделение 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114

2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон получают путем экстрагирования биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114. Высушенный мицелий экстрагируют хлористым метиленом на аппарате Сокслета в течение 24 часов при 30°С. Экстракцию веществ из фугата проводят хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Очистку (фракционирование) сырых экстрактов проводят последовательной обработкой неполярными и полярными растворителями (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом).

Активность сырого и очищенного экстрактов из мицелия штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими показателями москитоцидной активности: сырой экстракт - 26,5 миллионных долей (м.д.); очищенный экстракт - 21,0 м.д.

Окончательную очистку производят в несколько стадий с использованием флеш-хроматографии и жидкостного хроматографа высокого давления. Для разделения фракций используют полупрепаративные колонки (250×12 мм) с носителями "Diol", "C-18" и силикагель фирмы "Phenomenex". Структуру и класс этих соединений определяют методами ИК-спектроскопии, масс-спектроскопии (с электронной ионизацией (EI), электроспрей (ESI), МАЛДИ (MALDI), а также масс-спектроскопии высокого разрешения (HRESI)) и ЯМР-спектроскопии (¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР) на приборах с рабочими частотами для протонов 400 и 600 МГц с использованием протоколов COSY, DEPT, НМВС.

Из активного экстракта штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 получают чистый продукт и определяют его структуру. Это вещество имеет молекулярную массу 164 и брутто-формулу C₁₀H₁₂O₄. Его название по номенклатуре UIPAC - 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.

Пример 3. Лабораторные испытания 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона на различных видах комаров

Москитоцидную активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона определяют на личинках 2-го и 4-го возраста и куколках комаров четырех видов. В емкостях по 1 мл заливают культуру штамма по 1 мл и далее разводят в 2 раза, получают ряд разведений от 100% до 12,5%. В каждую емкость помещают по 10 личинок комаров и куколок. Их содержат при 25°С в термостате. В качестве контроля берут воду. Учет результатов проводят через 24 часа. Для тестируемого метаболита определяют среднелетальную концентрацию (LC₅₀), выраженную в миллионных долях (м.д.). Для определения среднелетального времени (LT₅₀) учет смертности проводят каждый час. В таблицах 3-4 приведены данные о москитоцидных свойствах метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона.

Таблица 3 Активность (LC₅₀) 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона против личинок и куколок различных видов комаров Вид комаров Время экспозиции, часов LC₅₀ (м.д.) в отношении Личинок Куколок II возраст IV возраст Aedes aegypti 24 23,0 99,0 397,0 96 20,0 65,0 90,0 Culex pipiens molestus 24 48,0 88,0 172,0   96 15,0 28,0 28,0 Culex pipiens 24 41,0 80,0 301,0 96 15,0 30,0 30,0 Anopheles messeae 24 26,0 110,0 405,0 96 20,0 75,0 60,0

Из данных таблицы 3 следует, что москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона составляет: 15-110 м.д. - для личинок комаров; 28-405 м.д. - для куколок комаров.

Таблица 4 Активность (LT₅₀) 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона против личинок и куколок различных видов комаров Вид комаров LT₅₀ (часы) в отношении Личинок Куколок II возраст IV возраст Aedes aegypti 2 10 90 Culex pipiens molestus 5 10 15 Culex pipiens 10 20 48 Anopheles messeae 6 10 52

Представленные в таблице 4 данные указывают, что москитоцидная активность тестируемого метаболита по показателю LT₅₀ составляет: 2-20 часов - для личинок комаров; 15-90 часов - для куколок комаров.

Данные таблиц 3-4 свидетельствуют о высокой активности метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона в отношении различных видов комаров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней человека и теплокровных животных.

По значениям удельной активности 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона было определено его среднее содержание в культуральной жидкости - 280 мг/л.

Таким образом, впервые установлена высокая москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона (аурантиоглиокладина). Полученные результаты позволяют рассматривать метаболит штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 (2,3 диметокси 5,6-диметил бензохинон) в качестве перспективного агента для создания москитоцидного препарата.

Источники информации

1. Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации: Методические указания под ред. Аванесова Л.И., Максаковой Е.И. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 56 стр. 2000.

2. Кербабаев Э.Б. Кровососущие комары - паразиты животных и человека. Методы и средства борьбы с комарами. М., стр.375, 2003.

3. Scholte E-J, Knols B.G.J., Samson R.A., Takken W., Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review, J. Insect Sci., Vol.4, pp.19-54, 2004.

4. Cuda J. P., et al. Evaluation of Lagenidium Giganteum for Biocontrol of Florida Mansonia Mosquitoes FIPR Publication №05, pp 37-113, 1995.

5. Singh S.B., Zink D.L., Dombrowski A.W., Dezeny G., Bills G.F., Felix J.P., Slaughter R.S., Goetz M.A., Candelalides A-C: novel diterpenoid pyrones from fermentations of Sesquicillium candelabrum as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3., Org Lett., Vol.25, 3(2), p.247-250. 2001.

6. Kimura, et al. Biosyntheses of Sescandelin B: New Isocoumarin Compounds Produced by the Fungus, Sesquicilium candelabrum, Biosci. Biotech. Biochem., Vol.58 (8), p.1525-1526, 1994.

7. Bentley R., Lawate W.V., Studies on coenzyme Q. The biosynthesis of aurantiogliocladin and coenzyme Q in molds, J. Biol. Cheem., vol.240, N1, P/532-540, 1965.

8. Lang G., (Saint-Gratien), Malaval A., (Aulnay-sois-Bois), Grollier J.F., (Paris), Rosenbaum G., (Asniers) Use of benzoquinines for the direct dyeing of keratin fibres, US Patent 4867751, 1989.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве средства борьбы с кровососущими комарами. Способ предусматривает выращивание штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114, депонированного в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ) на плотной питательной среде Чапека+ при температуре 23°С в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со взрослыми колониями с последующим культивированием при той же температуре на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта в течение 6 дней до образования бластоспор. Полученную культуральную жидкость центрифугируют с получением фугата. Полученный фугат экстрагируют хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Полученный экстракт очищают растворителями различной полярности (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом) с последующим хроматографированием на флеш-хроматографии и последующем хроматографировании на жидкостном хроматографе высокого давления с получением 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, обладающего москитоцидными свойствами. Изобретение позволяет расширить ассортимент средств для создания москитоцидных препаратов. 4 табл.

Средство, обладающее москитоцидными свойствами, представляющее собой 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон из штамма гриба Sesquicillium candelabrum ГНЦ ПМБ F-114.