ЭКСТРАКТЫ KIBDELOS PORANGIUM В КАЧЕСТВЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СРЕДСТВ Российский патент 2016 года по МПК C07D405/14 C07D413/14 C12N1/00 A61K31/5355 A61K31/4025 A61P31/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым соединениям и их фармацевтически приемлемым солям; композициям, содержащим такие соединения; получению указанных соединений путем ферментации и выделения, частичного синтеза и полного синтеза; способам ингибирования роста бактерий; способам лечения, профилактики или контроля за бактериальной инфекцией; биологически чистым культурам бактериальных штаммов, из которых могут быть получены такие соединения; и способам для получения композиций, содержащим такие соединения. Новые соединения настоящего описания, их фармацевтически приемлемые соли и композиции, включающие такие соединения и фармацевтически приемлемые соли, являются применимыми для лечения и/или профилактики бактериальных инфекций и ассоциированных заболеваний и состояний.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Инфекции, вызванные бактериями, являются нарастающей медицинской проблемой, так как множество бактериальных патогенов стали резистентными к различным обычным антибиотикам. Указанные микроорганизмы включают Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium difficile и другие патогенные бактерии. См. F. D. Lowy, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, 111(9) J. CLINICAL INVESTIGATION 1265 (2003); George Talbot et al., Bad Bugs Need Drugs: An Update on the Development Pipeline from the Antimicrobial Availability Task Force of the Infectious Disease Society of America, 42 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 657 (2006); Brad Spellberg et al., The Epidemic of Antibiotic-Resistant Infections: A Call to Action for the Medical Community from the Infectious Disease Society of America, 46 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 155 (2007). Несмотря на необходимость в новых антибактериальных соединениях, эффективных против таких микроорганизмов, устойчивых к множеству лекарственных средств, и интенсивные усилия, прикладываемые в этой области, очень мало новых антибактериальных соединений было одобрено FDA.

Следовательно, остается необходимость в сильных антибактериальных средствах, которые ингибируют рост бактерий, устойчивых к известным антибиотикам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые выбирают из группы, состоящей из соединений по формуле I и формуле II:

и их фармацевтически приемлемых солей, где:

R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и

R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-C₆ алкильных групп.

Указанные соединения являются сильными антибактериальными соединениями с широким спектром активности и могут быть использованы против патогенов, ассоциированных с бактериальными инфекциями человека и животных.

Дополнительные аспекты изобретения относятся к композициям, включающим смеси соединений по изобретению, и фармацевтическим композициям и составам, которые включают соединение по изобретению. Кроме того, аспекты изобретения относятся к способам ингибирования роста бактерий, способам лечения или профилактики бактериальных инфекций у людей и животных с использованием соединения по изобретению, и к способам регуляции бактериальных инфекций у людей и животных с использованием соединения по изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет собой ¹³C ЯМР спектр соединения A.

Фиг. 2 представляет собой ¹H ЯМР спектр соединения A.

Фиг. 3 представляет собой ¹H ЯМР спектр соединения B.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к очищенным соединениям, выбираемым из соединений по формуле I:

и их фармацевтически приемлемых солей, где: R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-C₆ алкила. Во всех аспектах варианта осуществления изобретения все другие переменные представляют собой те, как описано выше в общей формуле.

Второй вариант осуществления изобретения относится к очищенным соединениям, выбираемым из соединений по формуле II:

и их фармацевтически приемлемых солей, где: R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-C₆ алкила. Во всех аспектах варианта осуществления изобретения все другие переменные представляют собой те, как описано выше в общей формуле.

В третьем варианте осуществления настоящего изобретения R¹ выбирают из группы, состоящей из водорода и хлора. Во всех аспектах варианта осуществления изобретения все другие переменные представляют собой те, как описано выше в общей формуле, или в одном или более из первого и второго вариантов осуществления изобретения.

В четвертом варианте осуществления настоящего изобретения R² выбирают из группы, состоящей из водорода и хлора. Во всех аспектах варианта осуществления изобретения все другие переменные представляют собой те, как описано выше в общей формуле, или в одном или более из первого - третьего вариантов осуществления изобретения.

В пятом варианте осуществления настоящего изобретения R³ выбирают из группы, состоящей из водорода, метила и этила. В определенных аспектах настоящего варианта осуществления изобретения R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и метила. Во всех аспектах варианта осуществления изобретения все другие переменные представляют собой те, как описано выше в общей формуле, или в одном или более из первого - четвертого вариантов осуществления изобретения.

В шестом варианте осуществления настоящего изобретения очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из:

и их фармацевтически приемлемых солей.

В первом аспекте шестого варианта осуществления настоящего изобретения очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей. В первом случае указанного первого аспекта очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей. Во втором случае указанного первого аспекта, очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей.

Во втором аспекте шестого варианта осуществления настоящего изобретения очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей. В первом случае указанного второго аспекта очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей. Во втором случае указанного второго аспекта очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из

и их фармацевтически приемлемых солей.

Седьмой вариант осуществления настоящего изобретения относится к очищенным или частично очищенным бактериальным экстрактам, включающим одно или более соединений, как описано выше, в общей формуле или в одном или более из первого - шестого вариантов осуществления изобретения.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают следующее:

(a) Фармацевтическая композиция, включающая одно или более соединений, как описано выше в общей формуле или в одном или более из первого - шестого вариантов осуществления изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель.

(b) Способ ингибирования роста бактерий, способ включает лечение эффективным количеством одного или более соединений, как описано выше в общей формуле или в одном или более из первого - шестого вариантов осуществления изобретения.

(c) Способ лечения или профилактики бактериальной инфекции у млекопитающего, способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или более соединений, как описано выше в общей формуле или в одном или более из первого - шестого вариантов осуществления изобретения.

(d) Способ по (c), где указанная бактериальная инфекция вызвана Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae или другими бактериями, включая Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Stenotrophomonas maltophilia или Clostridium difficile.

(e) Способ регуляции бактериальной инфекции у млекопитающего, способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества одного или более соединений, как описано выше в общей формуле или в одном или более из первого - шестого вариантов осуществления изобретения.

(f) Способ по (e), где указанная бактериальная инфекция вызвана Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, или другими бактериями, включая Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Stenotrophomonas maltophilia или Clostridium difficile.

(g) Биологически чистая культура бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp. (MA7385), депонированного в Американской коллекции типов культур с патентным депозитарным номером ATCC PTA-10354, или биологически чистая культура, полученная из нее.

(h) Способ получения композиции, как описано выше в шестом варианте осуществления изобретения, способ включает культивирование и ферментирование культуры бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp. (MA7385), депонированного в Американской коллекции типов культур с патентным депозитарным номером ATCC PTA-10354, или биологически чистой культуры, полученной из нее.

Настоящее изобретение также включает соединение по настоящему изобретению (i) для применения в, (ii) для применения в качестве лекарственного препарата для, или (iii) для применения в получении лекарственного препарата для: (a) ингибирования бактериального роста или (b) профилактики или лечения инфекций, вызванных бактериями. В таких вариантах применения соединения по настоящему изобретению могут необязательно использоваться в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительным, независимо выбираемым терапевтическим средством, выбираемым из клинически применяемых средств, таких как бета-лактамы, хинолоны, оксазолидиноны, ванкомицин, сульфамидные препараты и даптомицин.

Дополнительные варианты осуществления изобретения включают фармацевтические композиции, комбинации и способы, указанные в (a)-(h) выше, и применения, указанные в предшествующем параграфе, где соединение по настоящему изобретению, используемое в настоящем описании, представляет собой соединение по одному из вариантов осуществления изобретения, аспектов, классов, подклассов или характеристик соединений, описанных выше. Во всех представленных вариантах осуществления изобретения соединение может необязательно использоваться в форме фармацевтически приемлемой соли, если возможно.

В вариантах осуществления изобретения, представленных выше, необходимо понимать, что соединения по формуле I и формуле II могут быть представлены в форме свободного основания, свободной кислоты или фармацевтически приемлемой соли или в виде гидрата или сольвата соединений по формуле I и формуле II в той степени, в которой такое свободное основание, свободная кислота, фармацевтически приемлемая соль, гидрат или сольват обеспечивают стабильное соединение и согласуются с описанием вариантов осуществления изобретения. Следовательно, любая ссылка на "соединение по формуле I" и/или "соединение по формуле ΙI” в настоящем описании включает ссылку на форму свободного основания или форму свободной кислоты, а также на любые фармацевтически приемлемые соли, гидраты или сольваты, с условием, что такие формы представляют собой стабильные соединения и согласуются с описанием вариантов осуществления изобретения. Также необходимо понимать, что каждый вариант осуществления изобретения может быть скомбинирован с одним или более другими вариантами осуществления изобретения в такой степени, в которой такая композиция обеспечивает стабильное соединение и согласуется с описанием вариантов осуществления изобретения, даже если специфически не указано или не цитировано выше. "Стабильное" соединение представляет собой соединение, которое может быть получено и выделено, и чья структура и свойства остаются или могут остаться по существу неизменными в течение периода времени, достаточного для возможного использования соединения для целей, описанных в настоящем описании (например, терапевтическое или профилактическое введение пациенту).

Также необходимо понимать, что варианты осуществления композиций и способов, представленных как (a)-(h) выше понимают, как включающие все варианты осуществления соединений, включая такие варианты осуществления, как результат комбинаций вариантов осуществления изобретения.

Как используется в настоящем описании, если не отмечено иначе, следующие термины имеют указанные значения.

Как используется в настоящем описании, все диапазоны являются включительными и все поддиапазоны включены в такие диапазоны, хотя не обязательно исключительно указано. Кроме того, термин "или", как используется в настоящем описании, обозначает альтернативы, которые могут, если необходимо, быть скомбинированы; так что термин "или" включает каждую перечисленную альтернативу отдельно, а также их комбинации.

Как используется в настоящем описании, термин "алкил" относится к любой линейной или разветвленной алкильной группе, имеющей количество атомов углерода в установленном диапазоне. Следовательно, например, "C_1-6 алкил" (или "C₁-C₆ алкил") относится ко всем изомерам гексилалкила и пентилалкила, а также к н-, изо-, втор- и трет-бутилу, н- и изопропилу, этилу и метилу. В качестве другого примера, "C_1-4 алкил" относится к н-, изо-, втор- и трет-бутилу, н- и изопропилу, этилу и метилу.

Термины "галоген", "атом галогена" и "гало" относятся к фтору, хлору, брому и йоду (альтернативно называемые как фторо, хлоро, бромо и йодо).

В результате выбора заместителей и видов заместителей определенные соединения по настоящему изобретению могут иметь асимметричные центры и могут существовать в виде смесей стереоизомеров или в виде отдельных диастереомеров или энантиомеров. Все изомерные формы заявленных соединений, отдельные или в смеси, находятся в рамках настоящего изобретения.

В соединениях по формуле I и формуле II атомы могут проявлять их натуральный изотопный состав или один или более атомов могут быть искусственно обогащены определенным изотопом, имеющим такое же атомное число, но атомную массу или массовое число, отличные от атомной массы, преимущественно встречающейся в природе. Обозначают, что настоящее изобретение включает все подходящие изотопные вариации соединений общей формулы I и формулы II. Например, различные изотопные формы водорода (H) включают протий (¹H) и дейтерий (²H). Протий является преобладающим изотопом водорода, обнаруживаемым в природе. Обогащение дейтерием может давать определенные терапевтические преимущества, такие как увеличение периода полужизни in vivo или снижение требований к дозировке, или может обеспечивать соединение, применимое в качестве стандарта для характеристики биологических образцов. Изотопно-обогащенные соединения в рамках генерических формулы I и формулы II могут быть получены без ненужных экспериментов обычными методиками, хорошо известными специалисту в области техники, или способами, аналогичными таковым, описанным в примерах в настоящем описании, с использованием соответствующих обогащенных изотопами реагентов и/или промежуточных продуктов.

Как известно обычному специалисту в области техники, определенные соединения по настоящему изобретению могут существовать как таутомеры. Для целей настоящего изобретения ссылка на соединение по формуле I и формуле II представляет собой ссылку на соединение, как таковое, или на любой из его таутомеров, как таковой, или на смесь двух или более таутомеров.

Как используется в настоящем описании, термин "композиция" предназначен для охвата продукта, включающего установленные ингредиенты, а также любого продукта, который возникает в результате, непосредственно или опосредованно, комбинации установленных ингредиентов.

Соединения по изобретению могут быть получены из биологических образцов, как описано ниже, могут быть получены химической модификацией соединений, полученных из биологических образцов, или могут быть синтезированы химически. Соединения по изобретению могут быть представлены как естественные соединения и смеси соединений, или могут быть выделены и очищены для получения "очищенных" соединений. Соединения по изобретению могут быть представлены в виде композиций, содержащих естественные соединения и смеси соединений, или могут быть выделены и очищены для получения «очищенных» композиций.

Как используется в настоящем описании термин "очищенный" относится к соединениям или композициям в окружающей среде, не имеющим одного или более компонентов, обычно ассоциированных с желаемыми соединениями по формуле I и формуле II в их оригинальном или натуральном состоянии. Ссылки на "очищенный" относятся к окружению соединения и не обязательно требуют очистки. Очищенные соединения или композиции могут быть получены, например, посредством выделения из продуцирующего штамма, посредством синтетических средств, посредством стадий очистки или посредством комбинации средств. Например, композиция, включающая смесь соединений по формуле I и формуле II, может быть названа как "очищенная" композиция, если представлена в форме, по существу не имеющей каких-либо ферментативных компонентов, иных, чем заявленная смесь. Подобным образом, композиция, выделенная из биологически чистого образца бактериального штамма, может быть "очищенной" композицией, если один или более компонентов удаляют посредством процессов выделения или очистки. В вариантах осуществления изобретения, "очищенный" может относиться к соединениям или композициям, которые имеют чистоту 50%-99%, что определено как процент массы желаемого соединения или композиций относительно общей присутствующей массы. В определенных вариантах осуществления изобретения соединения или композиции могут иметь 50% чистоту, 60% чистоту, 75% чистоту, 90% чистоту, 95% чистоту, 98% чистоту или 99% чистоту.

Как используется в настоящем описании, термин "биологически чистый образец" бактериального штамма относится к образцу интересующего бактериального штамма, который обеспечивают в форме, не обнаруженной в природе; например, биологически чистый образец бактериального штамма содержит интересующий бактериальный штамм, но по существу не имеет бактериальных штаммов, бактериальных материалов и/или других биологических материалов.

Термин "субъект" (альтернативно называемый в настоящем описании как "пациент"), как используется в настоящем описании, относится к животному, предпочтительно млекопитающему, которое является объектом лечения, наблюдения или эксперимента. Термин "млекопитающее", как используется в настоящем описании, предназначен для включения наиболее предпочтительно людей, а также теплокровных животных, включая домашних животных, таких как кошки, собаки, домашний скот и подобные.

Соединения по формуле I и формуле II и их фармацевтически приемлемые соли, также называемые в настоящем описании как "активные ингредиенты", наиболее эффективно используют при составлении композиции или состава с фармацевтически приемлемым носителем в соответствии с обычными методиками фармацевтического составления. Термин "композиция", как в "фармацевтическая композиция", предназначен охватывать продукты, которые включают один или более активных ингредиент(ов) и инертных ингредиент(ов), которые создают носитель. Термин "композиция" также предназначен охватывать любой продукт, который возникает в результате, прямо или опосредованно, комбинации, комплексообразования, агрегации или других взаимодействий любых двух или более активных ингредиентов(а) и/или инертных ингредиентов(а); любые продукты, которые возникают в результате, прямо или опосредованно, диссоциации одного или более из активных ингредиентов(а) и/или инертных ингредиентов(а); и любые продукты, которые возникают в результате любого другого типа реакций одного или более активных ингредиентов(а) и/или инертных ингредиентов(а).

Фармацевтические композиции содержат, по меньшей мере, терапевтически эффективное антибиотическое количество активного ингредиента(ов). "Терапевтически эффективное количество", как используется в настоящем описании, относится к количеству активного ингредиента, достаточному для получения желаемого терапевтического эффекта. Например, терапевтически эффективное антибиотическое количество соединения представляет собой количество, достаточное для демонстрации антибиотической активности и/или ингибирования роста одного или более бактериальных штаммов. Терапевтически эффективные антибактериальные количества активного ингредиента(ов) в фармацевтических композициях могут быть обеспечены в диапазоне от около 10 мг активного ингредиента(ов) на кг массы тела пациента до около 1000 мг активного ингредиента(ов) на кг массы тела пациента.

Под "фармацевтически приемлемым" обозначают, что ингредиенты фармацевтической композиции должны быть совместимы друг с другом и не вредными для реципиента.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в форме фармацевтически приемлемых солей. Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая обладает эффективностью исходного соединения и которая не является биологически или иным образом нежелательной (например, не является ни токсичной, ни иным образом вредной для реципиента). Подходящие фармацевтически приемлемые соли соединений по формуле I и формуле II включают, например, неорганические основные соли, такие как соли щелочных металлов (например, соли натрия и калия), соли аммония и органические основные соли. Подходящие органические основные соли включают соли аминов, такие как соли тетраалкиламмония (например, тетрабутиламмония и триметилцетиламмония), соли триалкиламина (например, триэтиламина), соли диалкиламина (дициклогексиламина), необязательно замещенные бензиламины (например, фенилбензиламин и пара-бромбензиламин), этаноламин, диэтаноламин, N-метилглюкозамин, N-метилпиперидин, пиридин, замещенные пиридины (например, коллидин, лютидин и 4-диметиламинопиридин), и соли три(гидроксиметил)метиламина; и соли аминокислот (например, соли лизина или аргинина).

Термин "введение" и его варианты (например, "введение" соединения) в отношении соединения по изобретению обозначает обеспечение соединения или пролекарства соединения пациенту, нуждающемуся в лечении. Когда соединение по изобретению или его пролекарство обеспечивают в комбинации с одним или более другими активными средствами (например, средствами, применимыми для лечения бактериальных инфекций), "введение" и его варианты каждое понимают, как включающие одновременное и последовательное обеспечение соединения, соли, гидрата или сольвата и других средств.

Термин "эффективное количество", как используется в настоящем описании, обозначает количество активного соединения или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или человека, который ожидает исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист. В одном варианте осуществления изобретения эффективное количество является "терапевтически эффективным количеством" для облегчения симптомов заболевания или состояния, подвергаемого лечению. В другом варианте осуществления изобретения эффективным количеством является "профилактически эффективное количество" для профилактики симптомов заболевания или состояния, чья вероятность возникновения или тяжесть снижается. Термин также включает в настоящем описании количество активного соединения, достаточное для ингибирования бактериального роста и посредством этого обеспечения ожидаемого ответа (т.е. "ингибирующее эффективное количество"). Когда активное соединение (т.е. активный ингредиент) вводят в виде соли, ссылки на количество активного ингредиента относятся к свободной кислой или свободной основной форме соединения.

Фармацевтические композиции могут быть получены путем тщательного смешивания одного или более активного ингредиента(ов) с носителем, и компоненты носителя могут быть выбраны для обеспечения желаемой среды. Например, составленные крем или лосьон могут быть получены путем смешивания активного ингредиента(ов) в соответствующим образом выбранных компонентах крема или лосьона для обеспечения концентрации активного ингредиента(ов) от около 0,01% до около 99%.

Фармацевтические композиции по аспектам изобретения могут быть составлены в виде композиций, подходящих для перорального, местного, парентерального (включая интраперитонеальный (и.п), подкожный, внутримышечный и внутривенный (в/в)), назального введения и введения путем суппозиториев или для введения путем инсуффляции.

Для перорального введения фармацевтические композиции по вариантам осуществления изобретения могут быть составлены в виде жидких или твердых композиций. Жидкие композиции могут быть получены путем смешивания активного ингредиента(ов) с фармацевтически приемлемым жидким носителем(ями), такими как вода, гликоли, масла, спирты и подобные. Для твердых композиций активный ингредиент(ы) может быть смешан с фармацевтически приемлемым твердым носителем(ями), такими как крахмалы, сахара, каолин, этилцеллюлоза, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, тальк и лактоза. Такой твердый носитель(и) может необязательно быть смешан со смазывающим средством, таким как стеарат кальция и/или с разрыхлителем-вяжущим веществом или подобным. Так как таблетки и капсулы легко вводить, такие лекарственные формы могут представлять собой наиболее преимущественные пероральные лекарственные формы для некоторых ситуаций. Композиции в стандартной лекарственной форме также составляют аспект изобретения.

Для введения путем инъекции фармацевтические композиции по вариантам осуществления изобретения могут быть составлены как суспензии, растворы или эмульсии. Фармацевтически приемлемые носители для инъекционных композиций могут быть масляными носителями или водными носителями, такими как 0,85% хлорид натрия в воде или 5% декстроза в воде. Кроме того, инъекционные композиции могут включать составленные средства, такие как буферы, растворители, суспендирующие средства и/или диспергирующие средства. Буферы, а также добавки, такие как солевой раствор или глюкоза, могут быть добавлены, чтобы сделать растворы изотоничными. Для капельного внутривенного введения активный ингредиент(ы) может быть растворен в спирте/пропиленгликоле или полиэтиленгликоле. Инъекционные композиции могут быть представлены как жидкие композиции, в стандартной лекарственной форме в ампулах или многодозовых контейнерах, необязательно содержащие добавленный консервант. Альтернативно, активный ингредиент(ы) может быть представлен в форме порошка и может быть восстановлен в подходящем водном носителе перед введением.

Термин "стандартная лекарственная форма", как используется в спецификации и формуле изобретения, относится к физически дискретным единицам, каждая содержащая заранее определенное количество активного ингредиента(ов), рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в ассоциации с приемлемым носителем. Примеры таких стандартных лекарственных форм включают таблетки, капсулы, пилюли, пакетики с порошками, облатки и, отмеренные единицы в ампулах или в многодозовых контейнерах и подобные.

Соединения, описанные в настоящем описании, могут быть получены путем ферментации бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp. (MA7385), или бактериальных штаммов, полученных из него и биологически чистых культур бактериальных штаммов, полученных из него, и экстракцией в растворителе. В частности, соединения по изобретению могут быть получены путем ферментации Kibdelosporangium sp. (MA7385) или предшественника, потомка или мутантного бактериальных штаммов Kibdelosporangium sp. (MA7385). В вариантах осуществления изобретения соединения, полученные путем ферментации бактериальных штаммов и экстракции в растворителе, могут быть дополнительно синтетически модифицированы для получения дополнительных соединений по изобретению. Кроме того, соединения по изобретению могут быть получены синтетически.

Kibdelosporangium sp. (MA7385) предварительно определили как штамм Streptomyces, но он был подтвержден как штамм Kibdelosporangium, который был выделен из образца почвы, собранного в лесу Центральной Африканской Республики. The Kibdelosporangium sp. (MA7385) хранится в Budapest Treaty, в коллекции культур Американской коллекции типов культур в 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 23 сентября 2009, и ему был присвоен патентный депозитарный номер ATCC PTA-10354.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Методика ферментации

Ферментацию Kibdelosporangium sp. (MA7385) осуществляли путем инокуляции нескольких агаровых пробок с мицелием в колбу с засевной средой (50 мл среды в 250 мл разделенной перегородками колбе). Состав засевной питательной среды был следующим (г на литр, если не указано иначе):

Растворимый крахмал 20,0 Декстроза 10,0 NZ амин типа Е 5,0 Экстракт говядины 3,0 Пептон 5,0 Экстракт дрожжей 5,0 CaCO₃ 1,0 Дистиллированная H₂O до 1 литра

pH доводили до 7,0 с помощью NaOH перед добавлением CaCO₃. Колбы инкубировали при 28°C, 80% относительной влажности и встряхивании на ротационной мешалке при 220 об/мин.

Когда колбы стадии засева выращивали в течение 3 дней, аликвоты 1 мл использовали для инокуляции каждой колбы со средой для продукции FR23 (50 мл среды в 250 неразделенной колбе). Композиция состояла из (г на литр):

Глюкоза 5,0 Растворимый крахмал 30,0 Меласса 20,0 Фармасреда 20,0 Дистиллированная H₂O до 1 литра

pH доводили до 7,0 с помощью NaOH перед стерилизацией. Колбы инкубировали при 28°C, 80% относительной влажности на ротационной мешалке при 220 об/мин в течение 7 дней.

Методика выделения

12 л ферментационной среды экстрагировали с помощью 12 л ацетона путем встряхивания в шейкере возвратно-поступательного действия в течение более чем 1 часа. Содержание мицелия фильтровали через CELITE, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении для удаления большей части ацетона. Водный экстракт (12 л) экстрагировали три раза с помощью 12 л каждый раз метилэтилкетона (MEK). Экстракты MEK смешивали и концентрировали при пониженном давлении досуха, получая камедь, которую растворяли в небольшом объеме метанола (~20 мл) и хроматографировали на колонке 450 cc SEPHADEX LH 20. Колонку элюировали метанолом, и фракции, содержащие соединения, собирали и концентрировали досуха. Одну третью часть фракции LH20 растворяли в минимальном объеме метанола и разводили метиленхлоридом до соотношения 90 частей метиленхлорида на 10 частей метанола. Полученный раствор затем загружали на силикагелевый картридж 35 cc (10 г) и промывали 3-4 объемами колонки с помощью 10, 20, 30% метанола в метиленхлориде. Интересующие соединения элюировали в 10-20% метаноловой фракции. Указанный процесс повторяли дважды с остатком материала и собранные фракции с трех колонок концентрировали при пониженном давлении для получения коричневой смолы. Обогащенный материал с силикагеля растворяли в 10 мл метанола. Одну пятую (2 мл) хроматографировали на однодюймовой PRP-1 с обратной фазой (pH стабильная ВЭЖХ колонка Hamilton's, 250×21,5 мм) с использованием элюции по градиенту с метанолом:0,25M натрий-фосфатным буфером (pH 7) 60:40-80:20 в 40 минут при скорости тока 10 мл/мин. Хроматографию повторяли с остатком материала четыре раза. Собирали фракции, элюируемые через 35-38, 39-40 и 41-44 из каждых из пяти хроматографических заходов. Указанные фракции растирали с 4-6 мл метанола три раза. Раствор содержал соединение, оставляя позади большую часть буфера в виде твердого вещества. Метаноловый раствор из фракций 35-38 и 41-44 концентрировали и рехроматографировали на колонке ZORBAX RX C8 (250×21,5 мм) и элюировали с 50 минутным линейным градиентом 50-100% водного метанола. Основные компоненты из каждой хроматографии лиофилизировали для получения следующих композиций в виде бесцветных порошков.

Композиция A

Соединение А-I по формуле I

3-O-ацетил-1,5-ангидро-4-О-карбамоил-6-деокси-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-дидеокси-3-C-(1-{[(3,4-дихлор-5-метил-1H-пиррол-2-ил)карбонил]амино}этил)гексапиранозил]окси}-2-метил-8-метилиден-1,2,4а,5,6,7,8,8a-октагидронафтален-1-ил)(гидрокси)метилиден]-5-оксо-6-(пропан-2-ил)-5,6-дигидро-4H-1,3-оксазин-2-ил]-2-О-метилгекситол.

Соединение А-II по формуле II

5-[(Z)-[1-(3-O-ацетил-4-O-карбамоил-6-деокси-2-O-метилгексопиранозил)-2,4-диоксо-5-(пропан-2-ил)пирролидин-3-илиден](гидрокси)метил]-6-метил-4-метилиден-1,2,3,4,4a,5,6,8a-октагидронафтален-1-ил 2,6-дидеокси-3-C-(1-{[(3,4-дихлор-5-метил-1H-пиррол-2-илl)карбонил]амино}этил)гексопиранозид.

Физические свойства Композиции A определяли, как указано далее:

Фиг. 1 представляет спектр ядерного магнитного резонанса (ЯМР) углерода-13 (¹³C) Композиции A; характерные пики наблюдали, как суммировано в таблице 1. ¹³C ЯМР спектры получали на спектрометре VARIAN INOVA 500 или 600 МГц, действуя или при 125, или при 150 МГц для ядра ¹³C. Химические сдвиги соотносили с остаточным CD₃OD (δ_с 49,0 ч./млн). Данные получали одинаково при 25°C в 3 мм пробирках для ЯМР. NORLAC 3 мм H{CN} непрямой Z-градиентный зонд использовали для всех образцов. VARIAN стандартные пульсовые последовательности использовали для всех сборов данных.

Фиг. 2 представляет собой ¹H ЯМР спектр композиции A; характерные пики наблюдали, как суммировано в таблице 1. ¹H ЯМР спектры получали на спектрометре VARIAN INOVA 500 или 600 МГц, действуя на или 500 или 600 МГц для ядра ¹H. Химические сдвиги соотносили на остаточный CHD₂OD (δ_Н 3,30 ч./млн). Данные собирали одинаково при 25°C в 3 мм ЯМР пробирках. NORLAC 3 мм H{CN) непрямой Z-градиентный зонд использовали для всех образцов. VARIAN стандартные пульсовые последовательности использовали для всех сборов данных.

Спектр ультрафиолетового (УФ) поглощения Композиции A, взятой в MeOH, проявлял характерные полосы поглощения λ_max (log ε)=248 нм (sh) и 276 нм (4,42). УФ спектр записывали на спектрометре PERKIN ELMER LAMBDA 35 UV/Vis.

Спектр инфракрасного (ИК) поглощения композиции A, взятой с использованием ZnSe, проявлял характерные полосы поглощения v_max= 3417, 2932, 1732, 1611, 1537, 1454, 1376, 1313, 1233, 1159, 1079, 1004, 893, 830, 789, 745 см^-1. ИК спектральные данные получали с использованием спектрометра PERKIN ELMER SPECTRUM ONE путем переноса небольшой аликвоты композиции A, растворенной в метаноле на планшет ZnSe.

Масс-спектр с высоким разрешением композиции A, полученный HRESIFTMS (m/z): наблюдаемый для M+H=939,3562, рассчитанный для C₄₄H₆₀Cl₂N₄O₁₄ ⁺H=939,3561. Масс-спектры с высоким разрешением получали на спектрометре THERMO FINNIGAN LTQ-FT, с использованием электролучевой ионизации и источника FINNIGAN ION MAX с фрагментацией источника на и равно 18 вольт.

Композиция B

Соединение B-I по формуле I

3-O-ацетил-1,5-ангидро-4-O-карбамоил-6-деокси-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-дидеокси-3-C-(1-{[(3,4-дихлор-1H-пиррол-2-ил)карбонил]амино}этил)гексопиранозил]окси}-2-метил-8-метилиден-1,2,4a,5,6,7,8,8a-октагидронафтален-1-ил)(гидрокси)метилиден]-5-оксо-6-(пропан-2-ил)-5,6-дигидро-4H-1,3-оксазин-2-ил]-2-O-метилгекситол.

Соединение B-II по формуле II

5-[(Z)-[1-(3-O-ацетил-4-O-карбамоил-6-деокси-2-O-метилгексопиранозил)-2,4-диоксо-5-(пропан-2-ил)пирролидин-3-илиден](гидрокси)метил]-6-метил-4-метилиден-1,2,3,4,4a,5,6,8a-октагидронафтален-1-ил-2,6-дидеокси-3-C-(1-{[(3,4-дихлор-1H-пиррол-2-ил)карбонил]амино}этил)гексопиранозид.

Фиг. 3 представляет собой ¹Н ЯМР спектр композиции B; характерные пики наблюдают, как суммировано в таблице 1. ¹Ή ЯМР спектры получали на спектрометре или VARIAN INOVA 500 или 600 МГц, действуя на или 500 или 600 МГц для ядра ¹H. Химические сдвиги соответствовали остаточному CHD₂OD (δ_Н 3,30 ч./млн). Данные собирали однородно при 25°C в 3 мм ЯМР пробирках. NORLAC 3 мм H{CN} непрямой Z-градиентный зонд использовали для всех образцов. VARIAN стандартные пульсовые последовательности использовали для сбора всех данных.

Масс-спектр высокого разрешения композиции В, полученный HRESIFTMS (m/z): наблюдаемый M+H=925,3410, рассчитанный для C₄₃H₅₈C₁₂N₄0₁₄ ⁺H=925,3405. Масс-спектры высокого разрешения получали на спектрометре THERMO FINNIGAN LTQ-FT, с использованием электролучевой ионизации и источника FINNIGAN ION MAX с фрагментацией источника на и равной 18 вольт.

Таблица 1
¹³С и ¹Н ЯМР спектральные данные   Композиция А Композиция В Тип ¹³С ¹Н ¹Н С⁰ 152,2     СН₂ 35,6 2,26, м (eq)
2,12, м (ax) 2,26, м
2,15, м СН₂ 35,3 2,25, м (eq)
1,26, м (ax) 2,25, м
1,28, м CH 79,6 3,56, дт, 4, 11 3,56, м CH 49,9 1,82, дт, 2,5, 11 1,79, м CH 126,5 5,92, дт, 10, 2 5,93, дт, 10, 2 CH 133,7 5,62, ддд, 10, 4,5, 3 5,62, ддд, 10, 4,5, 3 CH 32,1 2,65, м 2,65, уш.м CH 48,0 уш. 4,33, м 4,36, м CH 39,5 2,26, м 2,26, м С⁰ 198,0 уш.     С⁰ 105,2 уш.     С⁰ 196,6 уш.     CH 69,7 уш. 3,52, д, 2,5 3,52, д, 2,5 CH 32,0 уш. 2,14, м 2,15, м CH₃ 17,8 0,97, д, 7 0,98, д, 7 CH₃ 17,7 1,07, д, 7 1,07, д, 7 CH₂ 106,1 4,57, с
4,44, с 4,58, уш.с
4,44, уш.с CH₃ 18,9 0,80, д, 7 0,80, д, 7,5 C 178,1 уш.     CH 77,5 уш. 5,02, уш.д, 9 5,01, уш.д, 9,5 CH 75,6 4,33, м 4,33, м CH 69,9 5,88, т, 3 5,89, т, 3 CH 69,8 4,91, дд, 6, 3 4,91, дд, 6, 3,5 CH 71,4 4,30, пент, 7 4,30, пент, 7 CH₃ 14,5 1,39, д, 7 1,39, д, 7 CH 96,8 4,94, дд, 10, 2 4,95, уш.д, 10 CH₂ 38,5 1,79, дд, 13,5, 2 (eq)
1,57, дд, 13,5, 10 (ax) 1,80, уш.д, 13,5
1,58, дд, 13,5, 9,5 C⁰ 76,4     CH 74,9 3,17, д, 9 3,18, д, 9 CH 71,7 3,67, д кв, 9, 6 3,67, дд, 9,6 CH₃ 18,5 1,26, д, 6 1,27, д, 6 CH 52,4 4,37, кв, 7 4,38, кв, 6,5 CH₃ 16,2 1,24, д, 7 1,25, д, 7 C⁰ 161,7     C⁰ 120,0     C⁰ 112,4     C⁰ 110,6     C⁰ 129,4   6,98, с CH₃ 10,8 2,21, с   C⁰ 158,4     C⁰ 172,0     CH₃ 21,0 2,11, с 2,10, с CH₃ 57,5 3,28, с 3,34, с

ПРИМЕР 2

Композицию А исследовали в отношении антибактериальной активности против штаммов Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, и композиции A и B исследовали относительно контроля Candida albicans. Композицию B исследовали в отношении антибактериальной активности против штаммов Staphylococcus aureus.

Среда и получение среды

Следующие материалы использовали в исследовании композиций A и B: декстрозные агаровые планшеты MIC SABOURAUD (BBL); шарики MICROBANK (KRAMER SCIENTIFIC); планшетный инокулятор 2000 MICROTITER; 96-луночные планшеты MICROTITER, колпачки, инокулятные поддоны (DYNEX LABORATORIES); и 8-канальный микродозатор FINN, объем 0,5-10 мкл. Все агаровые планшеты получали готовыми от производителя.

Следующие среды использовали в исследовании композиций A и B: Катион-регулированный бульон Мюллера-Хинтона (CATION-ADJUSTED MUELLER HINTON BROTH) (MH; BBL); 50% лизированная лошадиная кровь (LHB; BBL) (хранящаяся замороженной); RPMI 1640 (BIO WHITTAKER); человеческая сыворотка (PEL-FREEZ); RPMI 1640 (BIO WHITTAKER); тестируемая среда Haemophilus (HTM, REMEL); соевая среда TRYPTICASE (TSB, 5 мл/пробирку; BBL); 0,9% хлорид натрия (солевой раствор; BAXTER); TRYPTICASE соя + 5% агаровые планшеты овечьей крови (TSA; BBL); планшеты шоколадного агара (BBL); 2X снятое молоко (REMEL); и 2X TRYPTICASE соевая среда (TSB, BBL) + 15% глицерин/50% лошадиная сыворотка. Среды получали как указано далее:

КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННЫЙ БУЛЬОН МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА: получали в соответствии с инструкциями производителя (22 г растворяли в 1000 мл воды; автоклавировали 22 минуты). Хранили в холодильнике. Стерилизовали посредством фильтрации перед использованием с применением фильтра из ацетата целлюлозы CORNING 0,45 Tm.

50% лизированная лошадиная кровь: Дефибринизированную лошадиную кровь разводили 1:1 стерильной дистиллированной водой; замораживали, оттаивали и повторно замораживали (по меньшей мере 7 раз), затем центрифугировали. Хранили замороженной при -20°C.

КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННЫЙ БУЛЬОН МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА + 2,5% лизированная лошадиная кровь: Асептически добавляли 5 мл 50% лизированной лошадиной крови к 100 мл КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННОГО БУЛЬОНА МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА. Стерилизовали посредством фильтрации перед использования с применением фильтра из ацетата целлюлозы CORNING 0,45 Tm.

КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННЫЙ БУЛЬОН МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА + 50% человеческая сыворотка: асептически добавляли 50 мл человеческой сыворотки к 50 мл 2X КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННОГО БУЛЬОНА МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА. Стерилизовали посредством фильтрации перед использованием с применением фильтра из ацетата целлюлозы CORNING 0,45 Tm.

Haemophilus тестируемая среда: Получали приготовленную от производителя. Стерилизовали посредством фильтрации перед использованием с применением фильтра из ацетата целлюлозы CORNING 0,45 Tm.

0,9% хлорид натрия: получали приготовленным от производителя.

2X снятое молоко: получали приготовленным от производителя.

Выбор и сохранение изолятов

Используемыми штаммами были изоляты из коллекции культур Merck; полученные культуры сохраняли в виде замороженных запасов при -80°C в a) шариках MICROBANK или b) 2X TRYPTICASE соевой среде + 15% глицерин/50% лошадиная сыворотка. В частности штаммы были следующие.

Используемый штамм Bacillus subtilis получали из коллекции культур Merck, и определяли как MB964. Культуру сохраняли замороженной при -80°C в шариках MICROBANK.

Используемые штаммы Staphylococcus aureus получали из коллекции культур Merck, и определяли как MB2865 и MB5957. Культуру сохраняли замороженной при -80°C в шариках MICROBANK.

Используемый штамм Enterococcus faecalis получали из коллекции культур Merck, и определяли, как CL8516. Культуру сохраняли замороженной при -80°C в шариках MICROBANK.

Используемый штамм Escherichia coli envAl tolC представляет собой штамм с проницаемой клеточной стенкой, полученный из коллекции культур Merck и определенный как ΜΒ5746. Культуру сохраняли замороженной при -80°C в шариках MICROBANK.

Используемый штамм Streptococcus pneumoniae получали из коллекции культур Merck, и определяли как CL2883. Культуру сохраняли замороженной при -80° C в 2X Trypticase соевой среде + 15% глицерин/50% лошадиная сыворотка.

Используемый штамм Haemophilus influenzae получали из коллекции культур Merck, и определяли как MB4572. Культуру поддерживали замороженной при -80° C в 2X Trypticase соевой среде + 15% глицерин/50% лошадиная сыворотка. Штамм Haemophilus influenzae представляет собой мышиный патоген, используемый для in vivo исследований в Merck.

Контрольный используемый штамм Candida albicans получали из коллекции культур Merck, и определяли как MY1055. Культуру сохраняли замороженной при -80°C в шариках MICROBANK.

Получение инокулята

Выбранные изоляты субкультивировали на или агаровых планшетах с TRYPTICASE соей + 5% овечьей кровью (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli и Streptococcus pneumoniae), или планшетах с шоколадным агаром (Haemophilus influenzae) или декстрозным агаром Sabouraud (Candida) и инкубировали при 35°C. Streptococcus pneumoniae и Haemophilus инкубировали в 5% CO₂; все другие изоляты инкубировали при окружающем воздухе. Изоляты субкультивировали дважды перед анализом.

Колонии отбирали с планшетов и использовали для получения инокулята, имеющего плотность, эквивалентную 0,5 стандарта МакФарланда в TRYPTICASE соевой среде; инокулят с плотностью, эквивалентной 1,0 стандарту МакФарланда, получали для Streptococcus pneumoniae. Плотность инокулята для всех культур была ~10⁸ КОЕ/мл в TSB. Такой TSB инокулят разводили 1:10 в стерильном солевом растворе (4 мл инокулята + 36 мл солевого раствора; эквивалентно ~10⁷ КОЕ/мл) и хранили на льду до использования для инокуляции микротитровальных планшетов.

Заполнение планшетов

Исходные растворы лекарственного средства и разведения

Тестируемые планшеты получали для каждого штамма, как указано далее. К каждой лунке 96-луночного планшета (с колонками 1-12 и рядами A-H), 100 мкл соответствующей тестируемой среды {Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli - планшеты КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННОГО БУЛЬОНА МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА; Streptococcus pneumoniae - планшеты КАТИОН-РЕГУЛИРОВАННОГО БУЛЬОНА МЮЛЛЕРА-ХИНТОНА + 5% лизированной лошадиной крови; Haemophilus influenzae - планшеты с тестируемой средой Haemophilus; Candida albicans - RPMI 1640) добавляли с использованием диспенсера Thermal-LabSystems MULTIDROP™. Формулу Института клинических лабораторных стандартов (Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)) (ранее Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)) использовали для расчета количества разведений, необходимого для стандартного раствора.

Получение композиции

Тестируемые композиции получали на массовой основе. Тестируемые композиции получали до 2 мг/мл в 100% ДМСО, затем разводили до 1 мг/мл в разведении 1:1 ДМСО/2x CAMHB (конечная концентрация=50%ДМСО/50% CAMHB). Тестируемые композиции серийно разводили 1:1 в 50% ДМСО/50% CAMHB в полипропиленовых 96-луночных планшетах с глубокими лунками BD Biosciences (начальная концентрация 1 мг/мл), как указано далее:

В первую лунку каждого ряда добавляли 100 мкл исходных растворов соединения (1 мг/мл) с помощью многоканальной пипетки Matrix. Соединения серийно разводили в два раза с помощью разбавителя Perkin Elmer CETUS PRO/PETTE™ или TECAN™ (100 мкл брали из первой лунки каждого ряда и помещали во вторую лунку и смешивали, 100 мкл из второй лунки каждого ряда брали и помещали в третью лунку и перемешивали и др.) вдоль планшета до колонки 11 (колонка 12 представляла собой лунку с контролем роста - без лекарственного средства), и последние 100 мкл сливали, получая концентрации соединения 64 - 0,00004 мкг/мл. Пенициллин G и кларитромицин, контрольные соединения, получали в виде исходного раствора 10 мг/мл в ДМСО и готовили в микротитровальном планшете, как указано выше для тестируемых соединений. Ципрофлоксацин включали как контроль для анализа связывания белка сыворотки.

Анализ разведения микросреды

С использованием автоматизированной многоканальной пипетки FINN, (объем 0,5-10 мкл) 6,4 мкл тестируемых растворов добавляли к лункам заполненных микротитровальных планшетов (концентрация антимикробного соединения в первой лунке = 64 мкг/мл; концентрация ДМСО=3,2%). Антимикробные средства добавляли таким образом для поддержания постоянного количества ДМСО в каждой лунке (для сохранения соединений растворенными и для учета возможности неспецифического уничтожения посредством ДМСО). Последний ряд содержал контроль роста 3,2% ДМСО.

Инокуляция планшетов и определение активности

Все лунки микротитровальных планшетов инокулировали с помощью культуры (разведенной солевым раствором) с использованием системы MIC 2000, автоматизированного устройства инокуляции планшетов, которое вводит инокулят по 1,5 TL на лунку. Планшеты инкубировали при 35°C в окружающем воздухе. Неинокулированный планшет также инкубировали как стерильный контроль. Результаты записывали после 18-24-часов инкубации. Планшеты считывали до отсутствия роста.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC-100) для всех соединений определяли как наименьшую концентрацию соединения, при которой не было видимого роста по сравнению с контролем роста без лекарственного средства, что определяли после периода инкубации от 22 до 24 часов. MIC получали в соответствии с руководствами CLSI.

Композиция A продемонстрировала антибактериальную активность в отношении различных штаммов Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae. Композиция B продемонстрировала антибактериальную активность в отношении различных штаммов Staphylococcus aureus. Значения минимальной ингибирующей концентрации (MIC), которые варьировались от 0,1 до 64 мкг/мл, наблюдаемые для композиций A и B, были следующими:

Таблица 2
Антибактериальная активность   MIC-100 (мкг/мл) Штамм Композиция А Композиция В Пенициллин G Кларитромицин Ципрофлоксацин Bacillus subtilis (МВ964) 0,12 NT <0,06 0,06 0,06 Staphylococcus aureus (МВ2865) 2 NT <0,06 0,12 0,12 Staphylococcus aureus (МВ5957) 1 16 NT NT 1 Enterococcus faecalis (CL8516) 2 NT 0,5 2 2 Escherichia coli envA1 tolC (MB5746) 32 NT 8 0,12 <0,015 Streptococcus pneumoniae (CL2883) 1 NT <0,06 0,03 2 Haemophilus influenzae (МВ4572) 2 NT 0,25 4 <0,015 Candida albicans (MY1055) >64 NT >64 >16 >16

Композиции A и B также продемонстрировали антибактериальную активность в отношении различных видов, которые являются устойчивыми к множеству известных антибиотиков, таких как метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA), ванкомицин-резистентный Enterococcus sp. (VRE), Enterococcus faecium с множественной лекарственной устойчивостью, макролид-резистентный Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis, и линезолид-резистентный Staphylococcus aureus и Enterococcus faecium.

ПРИМЕР 3

Композицию A исследовали в отношении антибактериальной активности против штаммов Clostridium difficile. Разведения лекарственных средств и агаровые планшеты, дополненные лекарственными средствами, получали вручную.

Среда и получение среды

Ростовые и тестируемые среды были рекомендованными Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) для исследования роста и чувствительности анаэробов. См. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. CLSI document M11-A7 [ISBN 1-56238-626-3]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2007.

Средой, используемой для MIC анализа разведения агара, был агар Brucella (Becton Dickinson, Sparks, MD # 211086, Lot #9020009) дополненный гемином (Sigma #H9039-1G, Lot #039K1121), витамином K₁ (Sigma, Lot #106K1523), и 5% лизированной овечьей кровью (Cleveland Scientific, Lot 41113-6) (1). Полученную среду называли как дополненный агар Brucella (SBA).

Среду получали, как указано далее: агар Brucella взвешивали и добавляли воду до конечного объема минус объем гемина, витамина K, и лизированной овечьей крови. Агар растворяли путем кипячения. Гемин (5 мкг/мл) и витамин K (1 мкг/мл) добавляли к агару и автоклавировали в течение 23 минут при 121°C. Агару позволяли остыть до 50°C и 18,5 мл переносили в стерильные стеклянные пробирки. Непосредственно перед заполнением планшетов к пробиркам добавляли 1 мл лизированной овечьей крови и 0,5 мл соответствующего разведения лекарственного средства. Содержимое пробирки тщательно перемешивали путем переворачивания пробирки, и дополненный лекарственным средством агар вливали в чашку петри. Планшетам, дополненным лекарственными средствами, позволяли стоять на столе до затвердения, затем переносили в анаэробную камеру Bactron II (Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR; атмосфера из 5% водорода, 5% диоксида углерода, 90% азота) позволяли пре-восстановиться в течение 2 часов перед инокуляцией.

Выбор и сохранение изолятов

Используемыми штаммами были клинические изоляты или контрольные штаммы, полученные из американской коллекции типов культур (ATCC). В частности, штаммами были Clostridium difficile 4381 (ATCC 700057) и Clostridium difficile 4822 (ATCC 43596). Культуры держали замороженными при -80°C в среде Brucella, содержащей 5 мкг/мл гемина, 1 мкг/мл витамина K, 5% лизированной лошадиной крови и 20% глицерина.

Получение инокулята

Изоляты субкультивировали на планшетах с дополненным агаром Brucella (SBA) (Remel, Lenexa, Kansas; Cat. No. R01255) в анаэробной камере Bactron II (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR), и инкубировали в течение 48 ч при 35-36°C в инкубаторе Bactron II перед использованием в анализе MIC.

Заполнение планшетов

Исходные растворы и разведения лекарственных средств

Исследуемые планшеты получали для каждого штамма, как указано далее. К каждой лунке 96-луночного планшета (с колонками 1-12 и рядами A-H) добавляли 100 мкл соответствующей исследуемой среды с использованием дозатора Thermal-LabSystems MULTIDROP™. Формулу Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) (ранее Национального комитета для клинических лабораторных стандартов (NCCLS)) использовали для расчета количества разведений, необходимых для стандартного раствора.

Получение композиции

Исследуемые композиции получали на массовой основе. Композицию A растворяли в ДМСО и исходную концентрацию 2560 мкг/мл использовали для исследования. Метронидазол и ванкомицин (оба от Sigma, St. Louis, MO), контрольные соединения, получали в исходной концентрации 1280 мкг/мл в 100% ДМСО.

Инокуляция планшетов и определение активности

Анализ проводили посредством контрольного метода разведения агара, описанного CLSI. См. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. CLSI document M11-A7 [ISBN 1-56238-626-3].

Тестируемые и контрольные изоляты субкультивировали на коммерчески приготовленных SBA агаровых планшетах (Кат. No. R01255; Remel, Lenexa, Kansas) в анаэробной камере Bactron II и инкубировали в течение 48 часов при 35°C (в анаэробной камере Bactron II).

Инокуляты для анализа MIC получали внутри анаэробной камеры Bactron II, как указано далее. Колонии собирали с помощью губки, и суспензию клеток получали в заранее восстановленной среде Brucella до плотности, равной 0,5 стандарта МакФарланда. Каждую суспензию клеток загружали в ячейку устройства репликации инокулята (Melrose Machine Shop, Woodlyn, PA), которое давало приблизительно 1-2 мкл на пятно на поверхности агара для инокулята приблизительно 10⁴-10⁵ колониеобразующих единиц на пятно. Нагрузка устройства репликации инокулята и инокуляция планшетов имели место внутри анаэробной камеры. Инокулированным агаровым планшетам позволяли стоять с агаром вверх до того, как инокулят поглотится агаром. Затем планшеты переворачивали и инкубировали при 35°C в течение 48 ч в анаэробной среде Bactron II (5% водорода, 5% диоксида углерода, 90% азота). MIC считывали согласно руководствам CLSI.

После инокуляции дополненные лекарственными средствами планшеты инкубировали при 35°C в течение 48 ч в анаэробной среде (5% водорода, 5% диоксида углерода, 90% азота) Bactron II. Планшеты считывали до отсутствия роста.

Минимальную ингибирующую концентрацию (MIC-100) для всех соединений определяли как наименьшую концентрацию соединения, при которой отсутствовал видимый рост по сравнению с контролем роста без лекарственного средства, что определяли после периода инкубации 22-24 часа. MIC получали в соответствии с руководствами CLSI.

Методика анализа MIC

Композиция A продемонстрировала антибактериальную активность в отношении различных штаммов Clostridium difficile. Значения MIC 0,12 мкг/мл наблюдали для композиции A, как показано в таблице 3. Для комбинаций организм-лекарственное средство, где существует контроль качества CLSI, полученные значения MIC находились в рамках опубликованных диапазонов контроля качества.

Таблица 3
Антибактериальная активность   MIC (мкг/мл) Штамм Композиция А Ванкомицин Метронидазол Clostridium difficile (ATCC 43596) 0,12 1 0,25 Clostridium difficile (ATCC 700057) 0,12 2 (0,5-4)¹ 0,25 (0,125-0,5)^{1 1} диапазон контроля качества CLSI

Понимают, что различные из вышеобсуждаемых и других характеристик и функций или их альтернативы могут быть желательно скомбинированы во множество других различных систем или применений. Также различные в настоящее время неизвестные или непредусмотренные альтернативы, модификации, варианты или улучшения вышеописанного и заявленного в настоящем описании предмета изобретения могут быть впоследствии осуществлены специалистом в области техники и также предназначены быть охваченными следующей формулой изобретения.

Изобретение относится к антибактериальной композиции, содержащей одно или более очищенных соединений, выбираемых из соединений формулы I:, где R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-С₆алкила; и формулы(II), где:R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и R³ представляет собой водород, и фармацевтически приемлемых солей. Эти композиции являются применимыми в лечении и/или профилактике бактериальных инфекций и ассоциированных заболеваний и состояний у человека и животных. Изобретение также относится к способу получению таких композиций путем ферментации и выделения, частичного синтеза и полного синтеза; способам ингибирования бактериального роста, а также к биологически чистым культурам бактериальных штаммов, из которых указанные соединения могут быть получены. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Антибактериальная композиция, содержащая одно или более очищенных соединений, выбираемых из соединений формулы I:

и их фармацевтически приемлемых солей, где:
R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и
R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-С₆алкила;
и одно или более очищенных соединений, выбираемых из соединений формулы II:

и их фармацевтически приемлемых солей, где:
R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и
R³ представляет собой водород.

2. Композиция по п. 1, где указанное соединение имеет формулу

или его фармацевтически приемлемая соль, где:
R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода
и галогена; и
R³ выбирают из группы, состоящей из водорода и C₁-С₆алкила.

3. Композиция по п. 1, где указанное соединение имеет формулу

или его фармацевтически приемлемая соль, где:
R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; и
R³ представляет собой водород.

4. Композиция по п. 1, где R¹ выбирают из группы, состоящей из водорода и хлора.

5. Композиция по п. 4, где R² выбирают из группы, состоящей из водорода и хлора.

6. Композиция по п. 5, где R³ формулы I выбирают из группы, состоящей из водорода, метила и этила.

7. Композиция по п. 6, где R³ формулы I выбирают из группы, состоящей из водорода и метила.

8. Композиция по п. 1, где указанное очищенное соединение выбирают из группы, состоящей из:



и их фармацевтически приемлемых солей.

9. Композиция по п. 8, где указанным очищенным соединением является

или его фармацевтически приемлемая соль.

10. Композиция по п. 8, где указанным очищенным соединением является

или его фармацевтически приемлемая соль.

11. Композиция по п. 8, где указанным очищенным соединением является

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Композиция по п. 1, где очищенное соединение формулы I представляет собой

и имеет молекулярную формулу C₄₄H₆₀Cl₂N₄O₁₄, молекулярную массу около 939,35, и где ¹³С ЯМР спектр композиции имеет характерные пики 152,2; 35,6; 35,3; 79,6; 49,9; 126,5; 133,7; 32,1; 48,0 уш; 39,5; 198,0 уш; 105,2 уш; 196,6 уш; 69,7 уш; 32,0 уш; 17,8; 17,7; 106,1; 18,9; 178,1 уш; 77,5 уш; 75,6; 69,9; 69,8; 71,4; 14,5; 96,8; 38,5; 76,4; 74,9; 71,7; 18,5; 52,4; 16,2; 161,7; 120,0; 112,4; 110,6; 129,4; 10,8; 158,4; 172,0; 21,0; и 57,5, и ¹Н ЯМР спектр композиции имеет характерные пики 2,26, м (eq); 2,12, м (ах); 2,25, м (eq); 1,26, м (ах); 3,56, дт, 4, 11; 1,82, дт, 2,5, 11; 5,92, дт, 10, 2; 5,62, ддд, 10, 4,5, 3; 2,65, м; 4,33, м; 2,26, м; 3,52, д, 2,5; 2,14, м; 0,97, д, 7; 1,07, д, 7; 4,57, с; 4,44, с; 0,80, д, 7; 5,02, уш.д, 9; 4,33, м; 5,88, т, 3; 4,91, дд, 6, 3; 4,30, пент, 7; 1,39, д, 7; 4,94, дд, 10, 2; 1,79, дд, 13,5, 2 (eq); 1,57, дд, 13,5, 10 (ах); 3,17, д, 9; 3,67, д кв, 9, 6; 1,26, Д, 6; 4,37, кв, 7; 1,24, д, 7; 2,21, с; 2,11, с; и 3,28, с.

13. Композиция по п. 1, где очищенное соединение имеет молекулярную формулу C₄₃H₅₈Cl₂N₄O₁₄, молекулярную массу около 925,34, и где ¹Н ЯМР спектр композиции имеет характерные пики 2,26, м; 2,15, м; 2,25, м; 1,28, м; 3,56, м; 1,79, м; 5,93, дт, 10, 2.; 5,62, ДДД, 10, 4,5, 3; 2,65, уш.м; 4,36, м; 2,26, м; 3,52, д, 2,5; 2,15, м; 0,98, д, 7; 1,07, д, 7; 4,58, уш.с; 4,44, уш.с; 0,80, д, 7,5; 5,01, уш.д, 9,5; 4,33, м; 5,89, т, 3; 4,91, дд, 6, 3,5; 4,30, пент, 7; 1,39, д, 7;; 4,95, уш.д, 10; 1,80, уш.д, 13,5; 1,58, дд, 13,5, 9,5; 3,18, д, 9; 3,67, дд, 9, 6; 1,27, д, 6; 4,38, кв, 6,5; 1,25, д, 7; 6,98, с; 2,10, c; и 3,34, с.

14. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики бактериальной инфекции, включающая композицию по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Способ ингибирования роста бактерий, который включает лечение эффективным количеством композиции по п. 1.

16. Способ лечения или профилактики бактериальной инфекции у млекопитающего, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п. 1.

17. Способ по п. 16, где указанная бактериальная инфекция вызвана Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae.

18. Способ по п. 16, где указанная бактериальная инфекция вызвана Clostridium difficile.

19. Биологически чистая культура бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp.(МА7385), депонированного в Американской коллекции типов культур с патентным депозитарным номером АТСС РТА-10354, или биологически чистая культура, полученная из него.

20. Способ получения композиции по п. 1, при этом способ включает культивирование и ферментирование культуры бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp.(МА7385), депонированного в Американской коллекции типов культур с патентным депозитарным номером АТСС РТА-10354, или культивирование и ферментирование биологически чистой культуры, полученной из бактериального штамма семейства Pseudonocardiaceae, рода Kibdelosporangium sp.(MA7385), депонированного в Американской коллекции типов культур с патентным депозитарным номером АТСС РТА-10354.