ПЕПТИД Российский патент 2016 года по МПК C07K5/87 A61K38/06 A61P9/12 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидам, обладающим АПФ-ингибиторными свойствами, их вариантам, композициям, содержащим вышеуказанное, и к их применению, в частности медицинскому применению, например, при лечении гипертензии.

Уровень техники

Гипертензия является одним из факторов риска развития инсультов, инфарктов, сердечной недостаточности и артериальной аневризмы и основной причиной хронической почечной недостаточности. Даже умеренное повышение артериального давления приводит к сокращению предполагаемой продолжительности жизни.

Гипертензию можно лечить путем адресного воздействия на ангиотензин I-превращающий фермент (АПФ). АПФ представляет собой фермент, участвующий в ренин-ангиотензиновой системе организма (RAS). Он является экзопептидазой, катализирующей превращение декапептида ангиотензина I в октапептид ангиотензина II. Ангиотензин II вызывает сужение кровеносных сосудов и повышает давление крови. Он также стимулирует высвобождение альдостерона из коры надпочечников. Альдостерон способствует задержке натрия в дистальном отделе нефрона почки, что также повышает давление крови.

Ингибиторы АПФ, в числе прочего, используются для контроля давления крови, лечения сердечной недостаточности, предотвращения инсультов и предотвращения повреждения почек у людей, страдающих гипертензией или диабетом. Кроме того, они улучшают выживаемость после инфарктов. Широко используемые ингибиторы АПФ включают беназеприл (лотензин), каптоприл (капотен), эналаприл (вазотек), фозиноприл (моноприл), лизиноприл (принивил, зестрил), моэксиприл (униваск), периндоприл (ацеон), хинаприл (аккуприл), рамиприл (альтаце) и трандолаприл (мавик). Эти препараты часто обладают нежелательными побочными эффектами и/или являются недостаточно эффективными, поэтому существует необходимость дальнейшей разработки ингибиторов АПФ.

Установлено, что ряд пептидов обладают АПФ-ингибиторной активностью (Vercruysse et al. September 2005, Journal of Agricultural and Food Chemistry A-J), и существует необходимость дальнейшей разработки пептидов, обладающих АПФ-ингибиторной активностью.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали пептид, обладающий особенно выраженной АПФ-ингибиторной активностью. Последовательность пептида представляет собой FSY, где F обозначает фенилаланин, также обозначаемый Phe, S обозначает серии, также обозначаемый Ser, a Y обозначает тирозин, также обозначаемый Tyr. Таким образом, настоящее изобретение в одном аспекте обеспечивает пептид, включающий или состоящий из SEQ ID NO:1 (FSY).

Авторы настоящего изобретения также установили, что вариант вышеуказанного пептида, обладающий последовательностью FTY, также обладает особенно выраженной АПФ-ингибиторной активностью. Т обозначает треонин, также обозначаемый Thr. Таким образом, настоящее изобретение в дополнительном аспекте обеспечивает пептид, включающий или состоящий из SEQ ID NO:2 (FTY).

"FSY/FTY" используется здесь для указания на то, что пептид может обладать последовательностью FSY или FTY.

Пептид может содержать, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40 или 50 аминокислот и предпочтительно не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 или 4 аминокислот, например, 3-25, 3-15, 3-10, 3-8, 3-7, 3- 6, 3-5 или 3-4 аминокислоты, предпочтительно может состоять из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 аминокислот, наиболее предпочтительно - из 3 аминокислот. Под термином "состоящий из" количества аминокислот означает, что количество присутствующих аминокислот не превышает указанного количества, однако это выражение не исключает возможности того, что пептид включает дополнительный непептидный фрагмент. Например, пептид может быть фосфорилирован или может включать блокированную C-концевую группу, как описано ниже.

Таким образом, указанный пептид обладает сердцевинной аминокислотной последовательностью FSY или FTY. Термин "сердцевинная аминокислотная последовательность", как используется здесь, относится к аминокислотной последовательности, которая может начинаться на N-конце пептида, может являться внутренней последовательностью в составе пептида, может заканчиваться на С-конце пептида или может начинаться на N-конце пептида и заканчиваться на С-конце пептида. Аминокислоты на N-и/или C-концевой стороне сердцевинной последовательности называются "фланкирующими" аминокислотами.

FSY/FTY пептид может являться рекомбинантным, т.е. он может быть экспрессирован с гетерологичного гена в клетке-хозяине, например, E.coli, и выделен из нее. Его можно получить из нерекомбинантного источника, например, выделить из образца животного или растения, которые продуцируют указанный пептид в естественных условиях. Его можно получить путем ферментативного или химического разрушения (например, гидролиза) белка, содержащего последовательность FSY/FTY. Для синтеза указанного пептида можно использовать стандартные способы синтеза пептидов, например, твердофазный синтез, причем Fmoc- или Boc-твердофазный синтез является предпочтительным.

Кроме того, представлен способ получения выделенного пептида FSY/FTY. Указанный способ может включать любой из способов, указанных выше. Предпочтительно указанный способ включает стадию гидролиза белковой композиции с целью получения гидролизата и выделения пептида FSY/FTY из гидролизата.

Кроме того, представлен способ получения композиции, включающей пептид FSY/FTY, включающий гидролиз белка, содержащего мотив FSY/FTY, с целью получения композиции, включающей пептид FSY/FTY.

Если не указано иное, любой из способов получения, упомянутых здесь, можно выполнить, используя чистый белок или смесь белков. Смесь белков может, например, представлять собой отходы переработки креветок, содержащие головы, хвосты и/или панцири креветок, предпочтительно Pandalus borealis.

В необязательном случае пептид может включать 1, 2 или 3 консервативные замены аминокислотной последовательности FSY/FTY, предпочтительно не более 1. Ser является полярной нейтральной аминокислотой, таким образом, замена Ser на Cys, Met, Thr, Asn или Gin представляет собой консервативную замену. Phe и Туг являются ароматическими аминокислотами, таким образом, каждая из них может быть независимо замещена на Phe, Trp или Tyr. Таким образом, также рассматриваются пептиды, обладающие сердцевинной последовательностью, выбранной из FTY, YSY, YSF, FCY, FMY, FNY и т.п.

В необязательном случае пептид может включать не кодируемую генетически аминокислоту в составе сердцевинной и/или фланкирующей последовательности, хотя предпочтительным является отсутствие не кодируемых генетически аминокислот в сердцевинной последовательности. Под "не кодируемой генетически аминокислотой" подразумевают аминокислоту, отличающуюся от 20 генетически кодируемых аминокислот своей боковой цепью. Таким образом, этот термин используется здесь по отношению к боковой цепи и не используется для различения L- и D-аминокислот. Примеры не кодируемых генетически аминокислот включают 3-иод-L-тирозин, азидаланин, азидгомоаланин и норлейцин.

Хорошо известно, что стабильность пептидов можно улучшить за счет так называемого блокирования концевых групп, т.е. химической модификации N- и C-концевых аминокислот. Типичное блокирование концевых групп включает амидирование C-концевой группы и ацетилирование или дезаминирование N-концевой группы. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения пептид, описанный здесь, содержит модифицированную C-концевую и/или модифицированную N-концевую группу, предпочтительно амидированную C-концевую и/или ацетилированную или дезаминированную N-концевую группу.

L-конфигурация является предпочтительной, поэтому предпочтительно все аминокислоты пептида находятся в L-конфигурации, однако пептид может включать одну или более аминокислот в D-конфигурации. В необязательном случае более половины или все аминокислоты находятся в D-конфигурации. В необязательном случае сердцевинная последовательность включает только L-аминокислоты, а фланкирующая(ие) последовательность(и) включает(ют) одну или более D-аминокислот, или наоборот.

В необязательном случае одна или более из аминокислот сердцевинной и/или фланкирующей последовательности может быть гликозилирована. В необязательном случае одна или более из аминокислот сердцевинной и/или фланкирующей последовательности может быть фосфорилирована.

Аминокислоты, которые составляют пептид, как правило, связаны пептидными связями, предпочтительно альфа-пептидными связями. Указанные связи представляют собой разновидность амидной связи. Вместе с тем, одна или более аминокислот могут быть связаны непептидными связями.

Предпочтительно пептид является линейным, но в необязательном случае он может быть циклическим или разветвленным.

Термин "пептид FSY/FTY" условно используется здесь по отношению к пептиду, определенному выше, т.е. пептиду, состоящему из или содержащему последовательность FSY/FTY, который необязательно может включать одну или более из ее модификаций, описанных здесь.

Пептид FSY обладает АПФ-ингибиторной активностью. Как показано в Примере 1, авторы настоящего изобретения обеспечили пептид FSY, IC₅₀ которого по отношению к ингибированию АПФ составляет приблизительно 4 мкМ (среднее из нескольких измерений). Типичные измерения согласно способу Dragnes et al. показали, что IC₅₀ по отношению к ингибированию АПФ составляет приблизительно 2,2 мкМ. IC₅₀ по отношению к ингибированию АПФ, измеренная согласно способу Vermeirssen, составила приблизительно 7,7 мкМ.

Пептид FTY также обладает АПФ-ингибиторной активностью. Как показано в Примере 2, авторы настоящего изобретения обеспечили пептид FTY, IC₅₀ которого по отношению к ингибированию АПФ составляет приблизительно 59 мкМ (согласно способу Dragnes et al.). IC₅₀ по отношению к ингибированию АПФ, измеренная согласно способу Vermeirssen, составила приблизительно 274 мкМ.

Таким образом, IC₅₀ пептида по отношению к ингибированию АПФ составляет предпочтительно менее 400, 300, 200, 190, 180, 170, 100, 80, 60, 40, 30 или 20 мкМ, наиболее предпочтительно - менее 18, 16, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 мкМ, например, приблизительно 4 мкм, предпочтительно приблизительно 3, 2, 1,7 или 1 мкМ. Например, IC₅₀ пептида может составлять приблизительно 1-20, 1-10, 1-6, 1-4 или 1-2 мкМ.

Ингибирование АПФ находит различное терапевтическое применение, как описано ниже. Во всех вариантах терапевтического применения, рассматриваемых здесь, FSY/FTY ингибирует активность АПФ. Пептид FSY/FTY можно использовать для лечения любого состояния, характеризующегося аномальной активностью АПФ. Под "аномальной" активностью АПФ подразумевают, что активность АПФ является слишком высокой, то есть выше, чем у здорового субъекта. Примерами таких состояний являются предгипертензия и гипертензия. С альтернативной точки зрения пептид FSY/FTY можно использовать для лечения любого субъекта, для которого ингибирование АПФ является благоприятным, например, субъекта, страдающего или подверженного риску развития предгипертензии или гипертензии.

Следует понимать, что при терапевтическом применении, описанном здесь, пептид FSY/FTY используют в эффективном АПФ-ингибирующем количестве.

Таким образом, в дополнительном аспекте представлена фармацевтическая композиция, включающая пептид FSY/FTY в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом.

В еще одном аспекте представлен пептид FSY/FTY для использования в терапии, предпочтительно для использования с целью снижения давления крови и/или предотвращения или подавления развития или прогрессирования предгипертензии или гипертензии.

Кроме того, представлен способ ингибирования АПФ-активности, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного АПФ-ингибирующего количества пептида FSY/FTY, описанного здесь.

Кроме того, представлен способ лечения или предотвращения развития или прогрессирования предгипертензии или гипертензии, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества пептида FSY/FTY, описанного здесь.

АПФ-ингибиторную активность можно оценить, используя известные способы, например, основанные на способе, описанном Cushman и Cheung (1971), за счет измерения конечного продукта гиппуровой кислоты (ГК), полученного при ферментативной реакции между АПФ (Sigma A 6778) и субстратом HHL (Sigma H 1635). (CUSHMAN, D.W. & CHEUNG, H.S. (1971). Concentrations of Angiotensin-Converting Enzyme in Tissues of Rat. Biochimica Et Biophysica Acta 250(1), 261-265 и Dragnes et al. J Food Composition and Analysis 2009; 22: 714-17). Еще один подходящий способ анализа описан в статье Vermeirssen et al. (2002), J. Biochem Biophys. Methods 51 (2002), pages 75-87, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Вкратце, это спектрофотометрический способ, при котором ингибирование АПФ измеряют, используя субстрат фуранакрилоил-Phe-Gly-Gly и ацетоновый экстракт легких кролика в качестве источника АПФ. Можно определить IC₅₀. IC₅₀ определяют как концентрацию, при которой активность ингибируется на 50%.

Ингибирование АПФ in vivo, как правило, оказывает антигипертензивное действие, поэтому действие пептида FSY in vivo можно анализировать, используя крыс со спонтанной гипертензией (SHR). SHR являются широко распространенной животной моделью гипертонии, и их подходящие линии разводят на коммерческой основе. SHR обладают нормальным давлением крови в молодом возрасте, однако по мере старения у них развивается спонтанная и длительная гипертензия, в частности, систолическое давление крови более 150 мм рт.ст. Можно протестировать способность пептида FSY/FTY ингибировать гипертензию у этих крыс. Ингибирование может быть полным, т.е. представлять собой предотвращение развития любой гипертензии, или частичным, вызывая у крыс, получавших пептид FSY/FTY, гипертензию, не достигающую тяжелой стадии, по сравнению с крысами, не получавшими лечения. Антигипертензивное действие пептида FSY/FTY in vivo также можно протестировать на других животных, например, используя субъектов, страдающих гипертензией, или путем тестирования способности пептида FSY/FTY противодействовать гипертензивному действию одного или более агентов, повышающих давление крови

Давление крови, как правило, измеряют в "миллиметрах ртутного столба" (мм рт.ст.) и выражают через систолическое и диастолическое давление. Систолическое давление представляет собой пиковое давление в артериях, возникающее в конце сердечного цикла при сокращении желудочков. Диастолическое давление представляет собой минимальное давление в артериях, возникающее во время начала сердечного цикла, когда желудочки заполнены кровью. Примером нормальных измеренных значений для отдыхающего здорового взрослого человека являются систолическое давление 90-120 мм рт.ст. и диастолическое давление 60-80 мм рт.ст., например, систолическое давление 110 мм рт.ст. и диастолическое давление 70 мм рт.ст. (пишется как 110/70 мм рт.ст.).

Для людей "высокое давление крови", как правило, определяется как давление крови, составляющее 140/90 мм рт.ст. или выше практически каждый раз во время измерения. То есть оно "поддерживается" на уровне 140/90 мм рт.ст. или выше. В то же время "высокое давление крови" также включает в себя высокое систолическое давление в сочетании с нормальным диастолическим давлением или высокое диастолическое давление в сочетании с нормальным систолическим давлением. Таким образом, термины "высокое давление крови" или "гипертензия", как используются здесь, означают систолическое давление 140 мм рт.ст. или выше и/или диастолическое давление 90 мм рт.ст. или выше. Субъект, страдающий гипертензией, таким образом, может иметь систолическое давление, по меньшей мере, 140, 145, 150, 155, 160, 165 или 170 мм рт.ст. и/или диастолическое давление, по меньшей мере, 90, 95, 100, 105, 110, 115 или 120 мм рт.ст.

Давление крови между 120/80 и 139/89 называется здесь "предгипертензией", что является обозначением субъектов-людей с повышенным риском развития гипертензии.

В данной области техники известны значения нормального или высокого давления крови других животных.

Пептид FSY/FTY или композицию, содержащую пептид FSY/FTY, можно использовать для лечения или профилактики предгипертензии или гипертензии. Это может быть особенно полезным при лечении или профилактике расстройств, выбранных из заболевания коронарных артерий (CAD) или ишемической болезни сердца (ИБС), например, стенокардии, гипертензии, атеросклерозе, инсульте, инфаркте миокарда, церебральном инфаркте и рестенозе после ангиопластики, аритмии, тахиаритмии, застойной сердечной недостаточности (CHF), недостаточности аортального клапана; дислипидемии; дислипопротеинемии; сосудистых заболеваниях, ассоциированнных с диабетом, например, диабетической нефропатии, диабетической невропатии, микроальбуминурии и диабетической ретинопатии; почечных заболеваниях, в частности, острой и хронической почечной недостаточности. Как упоминается выше, при всех указанных вариантах терапевтического применения пептид FSY/FTY используют для ингибирования активности АПФ.

Пептид FSY/FTY предпочтительно способен снижать систолическое и/или диастолическое давление крови, по меньшей мере, приблизительно на 1, 2, 3 или 4 мм рт.ст., более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 5, 6, 7 или 8 мм рт.ст., предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 мм рт.ст., например, приблизительно на 1-20, 2-15, 3-10 или 5-10 мм рт.ст. после введения, по меньшей мере, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 21 или 28 суток, предпочтительно более чем приблизительно на 7 суток.

В некоторых вариантах воплощения пептид FSY/FTY ингибирует повышение систолического и/или диастолического давления крови. Это ингибирование может быть полным, в результате чего систолическое и/или диастолическое давление крови остаются стабильными, или частичным, замедляющим повышение систолического и/или диастолического давления крови. Такое ингибирование можно оценивать, например, путем сравнения изменений систолического и/или диастолического давления крови в течение периода до введения пептида FSY/FTY с изменениями в течение периода при введении пептида FSY/FTY. Кроме того, его можно оценивать путем сравнения изменений систолического и/или диастолического давления крови субъектов, получающих пептид FSY/FTY, с контрольными субъектами, получающими плацебо или не получающими лечения.

Можно подвергать лечению любое млекопитающее, например, человека и любых сельскохозяйственных, домашних или лабораторных животных. Конкретные примеры включают мышей, крыс, свиней, кошек, собак, овец, кроликов, коров и обезьян. В то же время в предпочтительном случае млекопитающее является человеком.

Термины "терапия" или "лечение", как используются здесь, включают профилактическую терапию, которая может привести к предотвращению заболевания, а также терапевтическое лечение установленного расстройства. Термины "терапия" и "лечение" включают борьбу или излечение болезни, а также включают контролирование, ослабление или облегчение заболевания или одного или нескольких симптомов, связанных с ним.

"Эффективное количество", как используется здесь, может относиться к терапевтически эффективному количеству или профилактически эффективному количеству в зависимости от характера лечения. Терапевтически эффективным количеством может считаться количество, необходимое (в соответствующих дозах и режимах введения) для достижения желательного терапевтического результата. Профилактически эффективным количеством может считаться количество, необходимое (в соответствующих дозах и режимах введения) для достижения желательного профилактического результата. Указанные количества могут варьироваться в зависимости от массы тела, возраста и пола пациента, а также от тяжести заболевания. Преимущественно, пептид FSY/FTY используется в эффективном АПФ-ингибиторном количестве, которое предпочтительно является эффективным для профилактического и/или терапевтического лечения любого из состояний, перечисленных здесь.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает БАД-композицию, содержащую пептид FSY/FTY и, необязательно, другие ингредиенты. Термин "биологически активная добавка (БАД)", как используется здесь, обозначает продукт, который, в дополнение к питательной ценности, может являться полезным для здоровья. БАД по настоящему изобретению обладает АПФ-ингибиторной активностью. Таким образом, БАД предпочтительно может снижать давление крови и/или предотвращать или ослаблять развитие или прогрессирование высокого давления крови. В качестве альтернативы или дополнения, она может стимулировать иммунный ответ и/или стимулировать рост, в частности, при введении животным в качестве корма.

Композицию БАД можно изготовить в качестве добавки, например, она может представлять собой твердый препарат, например, капсулы, таблетки, или порошок, или жидкий препарат, например, растворы или суспензии. Ее также можно изготовить в виде продуктов питания для людей или корма для животных, не являющихся человеком, путем ее объединения или включения в состав одного или нескольких других съедобных материалов. Съедобные материалы могут быть жидкими или твердыми.

Пищевые продукты, в состав которых можно включить пептид или композицию БАД по настоящему изобретению, включают растворимые порошкообразные продукты, пищевые концентраты, например, сладкие батончики или белковые концентраты, мясные продукты и продукты из заменителей мяса, рыбные продукты и продукты из заменителей рыбы, зерновые завтраки, пасты из растительных масел, майонез, молочные продукты, соевые продукты, макаронные изделия, лапшу, хлебобулочные изделия, например, хлеб, печенье, пирожные и крекеры, готовые блюда, молочные смеси и детское питание, но не ограничиваются ими.

Подходящие примеры молочных продуктов включают масло, сыр, мороженое, йогурт, взбитые сливки, сметану и творог. Примеры мясных продуктов включают готовые мясные блюда, например, паштет, ветчину, мясные консервы, колбасу и цельное мясо, но не ограничиваются ими. Заменитель мяса может представлять собой структурный растительный, грибковый или молочный белок, имитирующий текстуру мяса, например, кворн или тофу.

Неограничивающие примеры жидких напитков, обогащенных белком, в состав которых можно включить пептид или композицию БАД по изобретению, включают газированные обогащенные безалкогольные напитки, пиво, фруктовые соки, напитки с фруктовыми вкусоароматическими добавками, растительные напитки, спортивные напитки, напитки из соевого молока, напитки из рисового молока, молочные смеси, молоко, ароматизированные молочные напитки, козье молоко, жидкий йогурт, пахту или их комбинации.

Корм, в состав которого можно включить пептид или композицию БАД по изобретению, может представлять собой любой корм для животных, включая корм для домашних животных. Корм может быть в сухой или влажной форме.

Типичные компоненты пищи, кормов или композиций БАД, кроме пептида FSY/FTY, могут включать сырой белок, сырой жир, углеводы, полисахариды, крахмал, сырую клетчатку, зольные вещества, минеральные вещества, микроэлементы, витамины, жирные кислоты, белки, пептиды (не являющиеся пептидом FSY/FTY), аминокислоты, травы, липиды, антиоксиданты, каротиноиды, токоферолы, токотриенолы, фитостерины, полифенолы, биофлавоноиды и/или пищевую клетчатку. Таким образом, все вышеуказанное представляет собой примеры подходящих съедобных материалов, которые можно использовать для получения композиции БАД.

Корма для животных, а также большинство пищевых продуктов, как правило, содержат один или более компонентов, выбранных из углеводсодержащего вещества, белоксодержащего вещества и липидсодержащего вещества, поэтому корма по изобретению могут содержать один или более из указанных компонентов, предпочтительно комбинацию всех указанных компонентов.

Подходящие крахмалсодержащие кормовые/пищевые компоненты могут, например, быть получены из зерна, например, выбранного из группы, состоящей из кукурузы, сои, пшеницы, сорго, ячменя, овса и их смесей. Примеры подходящих крахмалсодержащих веществ включают кукурузную муку, молотую кукурузу, соевую муку, пшеничную муку, овсяную муку, пшеничные отруби, соевый шрот, кукурузную крупу и их смеси, но не ограничиваются ими.

Можно использовать вещества, содержащие сырой белок, например, рыбную муку, сухую молочную сыворотку, соевый шрот и их смеси. Другие подходящие вещества, содержащие белок, включают соевый белковый концентрат, соевую муку, кровяную муку, белок плазмы, сухое обезжиренное молоко, концентрат сывороточного белка, шрот канолы, кукурузную глютеновую муку, муку из клейковины пшеницы, дрожжи, шрот подсолнечника и их смеси, но не ограничиваются ими.

Подходящие жиросодержащие вещества включают свиное сало, топленый жир, соевое масло, лецитин, кокосовое масло, смесь молочной сыворотки и жира и их смеси, но не ограничиваются ими.

Пептид FSY/FTY по настоящему изобретению можно также изготовить в виде культуральной среды или добавки для микроорганизмов.

Композиция БАД по настоящему изобретению может содержать пептид FSY/FTY в количестве, достаточном для введения субъекту подходящей (т.е. эффективной) дозы пептида FSY/FTY; подходящие дозы обсуждались выше в контексте фармацевтических композиций.

Композиция БАД по настоящему изобретению может быть представлена в виде пищевого или кормового продукта для любого животного, включая наземных и водных животных. Животное может являться млекопитающим, рыбой, птицей, позвоночным или беспозвоночным, например, морским промысловым животным, сельскохозяйственным животным, домашним животным и человеком.

В еще одном аспекте представлен способ получения композиции БАД, включающей пептид FSY/FTY. Указанный способ может включать комбинирование пептида FSY/FTY со съедобным материалом. Подходящие съедобные материалы обсуждались выше.

В еще одном аспекте предложен способ изготовления пищевого продукта, напитка или кормового продукта, обогащенного пептидом FSY/FTY. Указанный способ может включать комбинирование пептида FSY/FTY со съедобным материалом или включение пептида FSY/FTY в состав пищевого продукта, напитка или корма. Подходящие пищевые продукты, напитки и корма обсуждались выше.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид FSY/FTY, как описано здесь. Кроме того, представлена комплементарная цепь такой молекулы нуклеиновой кислоты. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность промотора и/или сайта инициации транскрипции, функционально связанную с последовательностью, кодирующей пептид, как описано здесь, и/или последовательность терминации транскрипции или трансляции, функционально связанную с последовательностью, кодирующей пептид, как описано здесь.

Молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит, по меньшей мере, 9 нуклеотидов, а предпочтительно - не более 800 нуклеотидов, более предпочтительно - не более 500, 400, 300, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 или 15 нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой выделенную молекулу. Она может являться одноцепочечной молекулой или двухцепочечной молекулой, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид FSY/FTY, и ее комплементарную цепь.

Кодоны инициации транскрипции, как правило, всегда транслируются в метионин (Met, M), так что нуклеиновая кислота обычно кодирует пептид, начинающийся с метионина. Таким образом, она может кодировать пептид, состоящий из последовательности MFSY или MFTY, и пептиды, включающие или состоящие из этих последовательностей, являются дополнительными аспектами настоящего изобретения. Предпочтительно начальный метионин является частью отщепляемой сигнальной последовательности, что дает возможность расщепления пептида, приводящего к высвобождению пептида, состоящего из последовательности FSY или FTY.

Дополнительный аспект относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, как определено здесь. Вектор может также содержать дополнительные элементы, обычно находящиеся в векторе, например, сайт инициации репликации, селектируемый маркер, например, устойчивости к антибиотикам, и/или множественный сайт клонирования. Вектор может также представлять собой экспрессирующий вектор и может включать другие элементы, например контролирующие или регуляторные элементы транскрипции и/или трансляции для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Такие регуляторные элементы, например, промоторы, сайты связывания рибосом, энхансеры, терминаторы и т.п., хорошо известны и широко описаны в данной области техники.

Вектор может, например, представлять собой плазмиду или вирус; предпочтительно его выбирают из ретровируса, аденовируса и аденоассоциированного вируса.

Нуклеиновую кислоту можно использовать вместо или в дополнение к пептиду FSY/FTY в любом из аспектов, описанных здесь. Так, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, как определено здесь, и/или вектор, как определено здесь, вместе с фармакологически (или фармацевтически) приемлемым вспомогательным веществом. Варианты применения, в частности, медицинского применения указанной нуклеиновой кислоты, представляют собой дополнительные аспекты изобретения.

В еще одном аспекте представлена рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано выше. Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, причем предпочтительными являются бактериальные и дрожжевые клетки, например, Е.coli.

Пептид представляет собой молекулу, образованную путем соединения, по меньшей мере, двух аминокислот, как правило, посредством амидной связи, также называемой пептидной связью. Таким образом, пептид включает или состоит из, по меньшей мере, двух (2) аминокислот. Пептиды, состоящие из двух аминокислот, называют дипептидами, пептиды, состоящие из трех аминокислот, - трипептидами и т.д. Пептиды, состоящие из 2-20 аминокислот, можно называть олигопептидами, а пептиды, содержащие менее приблизительно 50 аминокислот, как правило, называют полипептидами. Термин "белок", как правило, используется для обозначения крупных полипептидов или комплексов полипептидов.

Следует понимать, что любая ссылка, приведенная здесь на "пептид" FSY/FTY, означает молекулу, которая присутствует в виде пептида, и не включает белок, содержащий указанную последовательность. Под термином "присутствует в виде пептида" подразумевают, что молекула имеет размер пептида, т.е. 2-50 аминокислот, а не является неотъемлемой частью большей структуры, например, белка. Таким образом, пептид может упоминаться как находящийся в "свободной" или "выделенной" форме.

Таким образом, композиция, включающая пептид FSY/FTY, представляет собой композицию, в которой пептид FSY/FTY присутствует в виде пептида.

Пептид FSY/FTY и молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, как правило, представляют собой "выделенные" или "очищенные" молекулы, поскольку они отличаются от любых аналогичных компонентов, которые могут присутствовать in situ в живом организме, например, животного, растения, гриба или прокариоты, или образце, полученном из организма. Указанные последовательности могут, однако, соответствовать или являться практически гомологичными последовательностям, находящимся в организме. Таким образом, термин "выделенный" или "очищенный", как используется здесь по отношению к молекулам или последовательностям нуклеиновой кислоты и пептидам, относится к таким молекулам, выделенным из, очищенным из или практически не содержащим их природного окружения, например, выделенным из или очищенным из организма, либо относится к таким молекулам, полученным с помощью технического процесса, т.е. включает рекомбинантные и синтетические молекулы.

Таким образом, при использовании в связи с молекулой нуклеиновой кислоты такие термины могут относиться к нуклеиновой кислоте, практически не содержащей материала, с которым она ассоциирована в естественных условиях, например, других нуклеиновых кислот/генов или полипептидов. Указанные термины могут также относиться к нуклеиновой кислоте, практически не содержащей клеточного материала или культуральной среды при ее получении с помощью технологии рекомбинантной ДНК, или практически не содержащей химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота также может практически не содержать последовательностей, которые фланкируют указанную нуклеиновую кислоту в естественных условиях (т.е. последовательностей, расположенных на 5′- и 3′-концах нуклеиновой кислоты), производным которых является указанная нуклеиновая кислота, или последовательностей, сконструированных как фланкирующие для указанной нуклеиновой кислоты (например, маркерных последовательностей или других последовательностей, не имеющих терапевтического значения), с помощью, например, генной инженерии.

Таким образом, при использовании в связи с пептидом термин "выделенный" или "очищенный" обычно относится к пептиду, практически не содержащему клеточного материала или других белков источника, из которого он получен. В некоторых вариантах воплощения, в частности, если пептид предназначен для введения человеку или животным, такие выделенные или очищенные пептиды практически не содержат культуральной среды при их получении с помощью рекомбинантной технологии, или химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе.

Такие выделенные или очищенные пептиды также могут не содержать фланкирующих последовательностей, например, последовательностей, описанных выше для выделенных молекул нуклеиновой кислоты. Термин "свободный пептид" можно условно использовать для обозначения того, что пептид не является частью белка.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно получить в соответствии с любым из общепринятых способов, известных в данной области техники и описанных в литературе. Таким образом, пептид FSY/FTY можно объединить, необязательно вместе с другими активными веществами (примеры которых описаны ниже), с одним или несколькими общепринятыми фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами и т.д., подходящими для конкретного варианта применения композиции с целью получения общепринятых препаратов, которые пригодны или могут быть пригодны для введения. Их можно изготовить в виде жидкостей, полужидких веществ или твердых веществ, например, жидких растворов, дисперсий, суспензий, таблеток, пилюль, порошков, саше, облаток, эликсиров, эмульсий, сиропов и т.п. Пептид можно представить, например, в виде препарата, устойчивого к действию желудочного сока, и/или в форме с пролонгированным действием. Он может находиться в форме, подходящей для перорального, парентерального, местного, ректального, генитального, подкожного, трансуретрального, трансдермального, интраназального, внутрибрюшинного, внутримышечного и/или внутривенного введения и/или для введения посредством ингаляции. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.

В типичном варианте воплощения фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для липосомного введения, поэтому в предпочтительным случае настоящее изобретение обеспечивает липосомы, содержащие фармацевтическую композицию. При использовании липосом не обязательно требуется включать дополнительное вспомогательное вещество, поэтому, кроме того, настоящее изобретение обеспечивает липосомы, содержащие пептид FSY/FTY, молекулу нуклеиновой кислоты, как определено здесь, и/или вектор, как определено здесь.

Предпочтительным способом введения является пероральный. В композициях по изобретению можно использовать любой физиологически совместимый носитель, вспомогательное вещество, разбавитель, буфер или стабилизатор. Примерами подходящих носителей, вспомогательных веществ, разбавителей, буферов и стабилизаторов включают один или более из воды, физиологического раствора, физиологического раствора с фосфатным буфером, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. В некоторых случаях можно включать изотонические агенты, например сахара, многоатомные спирты (например, маннит, сорбит) или хлорид натрия. Композиции могут дополнительно включать смазывающие агенты, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, консерванты, подсластители, вкусоароматические агенты и т.п. Композиции по изобретению можно изготовить, обеспечивая быстрое, пролонгированное или замедленное высвобождение активного ингредиента после введения субъекту, используя процедуры, хорошо известные в данной области техники. В необязательном случае можно использовать энтеросолюбильное покрытие.

Кроме пептида FSY/FTY композиция может дополнительно включать один или более дополнительных активных ингредиентов, например, других агентов, подходящих для лечения (пред)гипертензии, примеры которых включают ингибиторы АПФ, блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB), бета-блокаторы, диуретики, блокаторы кальциевых каналов, альфа-блокаторы и периферические вазодилататоры. В предпочтительном случае дополнительный активный ингредиент представляет собой дополнительный ингибитор АПФ, который предпочтительно представляет собой пептид. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию или композицию БАД, включающую пептид FSY/FTY, в комбинации с одним или более дополнительными АПФ-ингибиторными пептидами. Дополнительный АПФ-ингибиторный пептид может, например, включать или состоять из последовательности, выбранной из LF, FL, LY, LVK, NPK, NVY, KLP, LYK, LNA, LVAK, LVAH, LLTK, ALPH, LLLK, LNPK и VLAH. В предпочтительном случае присутствуют, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 пептидов, выбранных из этого списка.

Как указано выше, пептид FSY/FTY содержит сердцевинную последовательность, однако он может также включать одну или более фланкирующую последовательность и/или включать модификации. Таким образом, в дополнительном аспекте представлена композиция, включающая или состоящая из, по меньшей мере, 2 различных пептидов FSY/FTY. Кроме того, может присутствовать один или более дополнительный АПФ-ингибиторный пептид, как обсуждалось выше. Пептиды FSY/FTY могут отличаться друг от друга по их сердцевинной последовательности, фланкирующей(им) последовательности(ям) и/или модификации(ям). Таким образом, в вариантах воплощения любого из аспектов, описанных здесь, могут присутствовать два или более различных пептида FSY/FTY. Композиция, содержащая пептид FSY в комбинации с пептидом FTY, является особенно предпочтительной.

Подходящие суточные дозировки легко определить, однако целесообразными могут являться дозировки, составляющие, например, приблизительно 1-5, например, приблизительно 3 мг в сутки. Типичная суточная дозировка может зависеть от массы тела субъекта. Специалист в данной области должен иметь в виду, что подходящей дозировки можно достичь путем введения одиночной дозированной формы в сутки или путем введения двух или более меньших дозированных форм в сутки.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, таким образом, содержит подходящее количество пептида FSY/FTY в твердой дозированной форме, например, приблизительно 3 мг на таблетку, или соответствующую дозировку жидкого препарата.

В дополнительном аспекте представлен способ получения фармацевтической композиции, включающей пептид FSY/FTY. Указанный способ может включать объединение пептида FSY/FTY с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или вспомогательным веществом с целью получения фармацевтической композиции, которая является подходящей или может быть приведена в подходящее состояние для введения. Соответствующие носители, разбавители и вспомогательные вещества обсуждались выше.

В еще одном аспекте представлен способ ингибирования АПФ-активности in vitro, причем указанный способ включает использование пептида FSY/FTY. В частности, пептид FSY/FTY можно использовать для регуляции активности АПФ в клеточном лизате, клетке или образце ткани. Это может обеспечить более полное представление о действии АПФ и ингибирования АПФ.

В Таблице 1 показаны результаты сравнительного анализа АПФ-ингибиторной активности ряда различных пептидов.

Изобретение будет подробнее описано в следующих неограничивающих примерах.

Пример 1

Пептид FSY анализировали с помощью ферментного анализа, при котором АПФ продуцировал гиппуровую кислоту (ГК) из субстрата гиппурил-гистидин-лейцина (HHL). Концентрацию ГК определяли с помощью количественного ВЭЖХ-анализа и снижение концентрации соотносили с ингибиторным действием. АПФ-ингибиторную активность определяли на основе способа, описанного Cushman и Cheung (1971) путем измерения конечного продукта за счет измерения конечного продукта гиппуровой кислоты (ГК), полученного при ферментативной реакции между АПФ (Sigma A 6778) и субстратом HHL (Sigma H 1635), практически как описано в Dragnes et al. J Food Composition and Analysis 2009; 22: 714-17. 100-мкл объем, содержащий 2 мМ HHL в 100 мМ натрий-боратном буфере, pH 8,3, предварительно инкубировали при 37°C в течение 30 минут с 25 мкл ингибитора (пептид FSY, разбавленный натрий-боратным буфером). Затем инициировали анализ добавлением 50 мкл АПФ (10 мЕ). Ферментативную реакцию останавливали добавлением 215 мкл 1 М HCl.

Количественный ВЭЖХ-анализ проводили на Shimadzu (Shimadzu Corporation, Япония), используя обращенно-фазную колонку Symmetry-Shield reverse phase C-18 Intelligent Speed column. ГК элюировали при температуре окружающей среды, используя подвижную фазу, состоявшую из 0,05% водного раствора трифторуксусной кислоты и ацетонитрила квалификации "для ВЭЖХ". Использовали 2-мин линейный градиент, начиная с 0,5-мин изократического элюирования 5%-ным ацетонитрилом и заканчивая 90% ацетонитрилом. Скорость потока поддерживали при 2 мл/мин 1 и измеряли УФ-поглощение при 228 нм. Концентрацию ингибиторов АПФ, необходимую для ингибирования 50% активности АПФ, определяли как IC₅₀. Определили, что IC₅₀ пептида FSY в среднем составляла приблизительно 4 мкМ, причем при некоторых определениях IC₅₀ составляла 1,7 мкМ, а при типичных измерениях - приблизительно 2,2 мкМ.

При определении IC₅₀ способом согласно Vermeirssen et al (supra) получили значения, приблизительно равные 7,7 мкМ.

Пример 2

АПФ-ингибиторную активность варианта пептида FSY, имеющего последовательность FTY, оценивали согласно способу, описанному в Примере 1. IC₅₀ пептида FTY при определении согласно способу Dragnes et al. (supra) составляла приблизительно 59 мкМ, а при определении согласно способу Vermeirssen et al (supra) - приблизительно 274 мкМ.

Пример 3

Определение значений IC₅₀ зависит от точных условий анализа, что затрудняет полноценное сравнение значений IC₅₀, определенных в ходе отдельных анализов. Поэтому для сравнения АПФ-ингибиторной активности пептида FSY с известными АПФ-ингибиторными пептидами выполнили сравнительный анализ. АПФ-ингибиторную активность определяли согласно способу Dragnes et al., описанному в Примере 1. Результаты показаны в Таблице 1.

Таблица 1 Пептид IC₅₀, мкг/мл IC₅₀, мкМ FSY 0,9 2,20 IPP 1,04 3,20 VPP 1,40 4,50 VY 3,6 13,00

Изобретение относится к пептидам, выбранным из FSY или FTY, для лечения или профилактики состояния, при котором полезно ингибирование АПФ, и их фармацевтическим композициям. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Применение пептида, обладающего АПФ-ингибиторной активностью и имеющего последовательность FSY или FTY, для лечения или профилактики состояния, при котором полезно ингибирование активности АПФ.

2. Применение по п. 1, где указанное состояние представляет собой предгипертензию или гипертензию.

3. Применение по п. 1, где указанный пептид применяют для ингибирования активности АПФ с целью лечения состояния, выбранного из коронарной стенокардии, атеросклероза, инсульта, инфаркта миокарда, церебрального инфаркта, рестеноза после ангиопластики, аритмии, тахиаритмии, застойной сердечной недостаточности (CHF), недостаточности аортального клапана, дислипидемии, дислипопротеинемии, диабетической нефропатии, диабетической невропатии, микроальбумиурии и диабетической ретинопатии.

4. Выделенный пептид, состоящий из последовательности FSY или FTY.

5. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности АПФ, включающая пептид по п. 4 в эффективном количестве вместе с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

6. Способ ингибирования активности АПФ, при котором нуждающемуся в этом субъекту вводят эффективное количество пептида последовательности FSY или FTY.