ДЕКАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1997 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к химии пептидов, точнее к декапептиду, аналогу рилизинг-фактора лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов - люлиберина, обладающего противоопухолевой активностью на экспериментальных моделях гормон-зависимых опухолей.

Декапептид имеет следующую общую структуру:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
Изобретение может стать основой для создания лекарственной противоопухолевой формы.

Известно, что при терапии ряда онкологических заболеваний (опухоли яичников, простаты, молочной железа, ряда хондросарком и остеосарком) в качестве лекарственных средств используют аналоги пептидных гормонов, в частности, люлиберина (1).

Люлиберин амид линейного декапептида:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
Основной его функцией в организме является регуляция выделения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, которые, в свою очередь, влияют на уровень половых стероидных гормонов.

Синтезировано множество агонистов и антагонистов люлиберина (см. табл. 1). Как те, так и другие могут применяться в онкологии, поскольку они способны снижать уровень гормонов и влиять таким образом на рост гормонзависимых опухолей.

Агонисты вещества, которые связываются с люлибериноновыми рецепторами и вызывают люлиберино-подобный эффект. При длительном введении больших доз высокоактивных агонистов развивается эффект парадоксальной ингибиции, связанный с уменьшением количества соответствующих рецепторов.

Антагонисты также связываются с люлибериновыми рецепторами, но люлиберино-подобного эффекта не вызывают и являются конкурентными ингибиторами люлиберина.

Такие агонисты как: "Декапептил"-pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg- Pro-Gly-NH ₂ (2,6); "Бусерилин"-pGlu His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(Bu^t)-Leu-Arg-Pro-NHEt (3, 6); "Лейпролид" -pGlu-His-Trp-Ser- Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt (3); "Золадекс" pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D- Ser(Bu^t)-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly (4) производятся в промышленности и используются в клинике.

В качестве возможных противоопухолевых препаратов описаны и антагонисты люлиберина (9): Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D- Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂, Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser- Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂.

(При написании структур использованы сокращения аминокислот, рекомендованные IUPAC-IUB (6), а также: NHEt этиламид, Aza-Gly-аза-глицин, D-Ser(Bu^t)-O-(трет-бутил)-D серин, Ac ацетил, p-F-D-Phe - пара-фтор-D-фенилаланин, p-Cl-D-Phe-пара-хлор-D-фенилаланин).

Большинство высокоактивных антагонистов люлиберина получают путем множественных замен в последовательности гормона на неприродные аминокислоты и аминокислоты D-конфигурации, что значительно повышает стоимость синтеза. Кроме того, наличие протяженных участков, состоящих из гидрофобных аминокислотных остатков, характерных для такого рода препаратов, приводит к развитию аллергических реакций (N⁷). Определенным недостатком известных аналогов люлиберина является также наличие остатков триптофана и гистидина, подверженных побочным реакциям.

В зависимости от структуры стоимость агонистов или антагонистов люлиберина составляет от 100 до 500 DM за 5 мг (см. каталог "Bachem", 1991 г).

Задачей предлагаемого изобретения является полипептид, обладающий высокой биологической активностью и лишенный вышеперечисленных недостатков, то есть не содержащий триптофан, гистидин и не имеющий протяженных участков, состоящих из гидрофобных неприродных аминокислот.

Эта задача решалась декапептидом общей формулы:
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Prg-Pro-Gly-NH₂
Заявленный декапептид синтезировали твердофазным методом с использованием стандартных приемов.

Анализ известного уровня науки и техники показал, что заявленный декапептид является новым и отличается по структуре от наиболее близких аналогов:
H-Pro-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (заявленный декапептид);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂(люлиберин);
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂,
aGlu-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (два последних пептида из каталога фирмы "Bachem", 1991)
Таким образом, можно утверждать, что вещество соответствует требованию "новизна".

Заявленный декапептид в отличие от большинства известных аналогов люлиберина, имеющих на N-конце пироглутаминовую кислоту или защищенный аминокислотный остаток, содержит в первом положении свободный пролин. Получение высокоактивного вещества при подобной модификации невозможно было предсказать заранее, поскольку существует мнение, что свободный N-конец в такого рода препаратах приводит к снижению биологической активности (8), что доказывает неочевидность предлагаемого решения.

Нами было показано, что рассматриваемый декапептид обладает высокой противоопухолевой активностью при терапии рака простаты у крыс до 84% торможения роста опухоли в дозе 100 мкг/кг в день, что соответствует 25 мкг на животное. В том же тесте и той же дозе коммерческий препарат "бусерилин" показал торможение роста опухоли 63% Было найдено также, что заявленный декапептид оказывает тормозящее воздействие (до 54%) на рак молочной железы у мышей.

По литературным данным подобные препараты исследованные на различных моделях рака предстательной и молочной желез эффективны в следующих дозах:
"Декапептил" 25 мкг в день или 25 мкг дважды в день (2, 13)
"Золадекс" 35 мкг в день (препарат вводился по 1 мг 1 раз в 28 дней в биодеградируемых капсулах) (4), "Лейпролид" 10 мкг дважды в день (3), Ac-p-F-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ или Ac-p-Cl-D-Phe-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Arg-Pro-D-Ala- NH₂ - по 50 мкг к день (5)
Высокая биологическая активность заявленного декапептида также подтверждает соответствие изобретения требованию "изобретательский уровень".

Для подтверждения соответствия заявленного изобретения требованию "промышленная применимость" приводим пример его получения.

Синтез H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
Синтез проводили твердофазным методом с использованием пептидного синтеза NPS-4000 ("Neosystem", Франция) на 4 метиобензгидриламинополимере той же фирмы. Использовали производные аминокислот L ряда фирмы "Reanal" (Венгрия): N-трет-бутилоксикарбони-O-бензилсерин, N трет-бутилоксикарбониопролин и гидрат N-трет-бутилоксикарбониллейцина; а также производные, полученные нами из аминокислот той же фирмы: N-трет бутилоксикарбонилглицин, N-трет-бутилоксикарбонил-N_G-(мезитилен -2- сульфо)-аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил-O-(3 -бромбензил)тирозин, и производные аминокислот D-ряда: N^α -трет-бутилоксикарбонил- N^ε -(2 хлорбензилоксикарбонил)-D-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-D-фенилаланин. Для отщепления пептида от смолы использовали трифторметансульфокислоту производства фирмы "Fluka" (Швейцария).

Полноту прохождения реакций пептидообразования контролировали с помощью нингидринового теста (9). В том случае, если производилось ацилирование остатка пролина, использовали изатиновый тест (10).

Трифторуксусную кислоту и растворители готовили в соответствии с требованиями для твердофазного пептидного синтеза (11), триэтиламин перегоняли над щелочью, а затем над нингидрином.

Присоединение первого аминокислотного остатка к полимерному носителю проводили по следующему протоколу:
2 г 4-Метилбензгидриламинополимера с содержанием аминогрупп 0,55 ммоль на 1 г смолы помещали в реактор. После набухания смолы в 20 мл диметилформамида последовательно проводили следующие стадии обработки: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 минута. 2). Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида по 1 мин. 4). Промывка 20 мл хлористого метилена 1 мин. 5). Заливали в реактор раствор 0,52 г (3,3 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонилглицина в 15 мл хлористого метилена, перемешивали в течение 10 минут и прибавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида. Перемешивали 2 ч. 6). Трижды промывали 20 мл хлористого метилена по 1 мин.

Проводили блокирование непрореагировавших аминогрупп. Для этого: 1). Полимер дважды обрабатывали 20 мл 10% раствора триэтиламина в хлористом метилене в течение 1 и 2 мин. 2). заливали 15,8 мл 10% раствора триэтилена в хлористом метилене и добавляли 1,04 мл (11 ммоль) уксусного ангидрида. Перемешивали 10 мин. 3). промывали 20 мл хлористого метилена 3 раза по 1 мин.

Далее все аминокислотные остатки присоединяли в соответствии с протоколом стандартного цикла, состоящего из стадий деблокирования, нейтрализации и конденсации. Протокол деблокирования включает в себя следующие операции: 1). Промывка 20 мл хлористого метилена в течение 1 мин. 2). Двукратная обработка 20 мл 50% раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 1 и 30 мин. 3). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена без перемешивания. 4). Двукратная промывка 20 мл хлористого метилена по 1 мин.

Сразу по окончании деблокирования выполняли нейтрализацию: 1). Промывка 20 мл диметилформамида 1 мин. 2) Двукратная обработка 20 мл 10% раствора триэтиламина в диметилформамиде в течение 1 и 2 мин. 3). Трехкратная промывка 20 мл диметилформамида.

Затем проводили конденсацию с трехкратным избытком соответствующего симметричного ангидрида аминокислоты в течение 1 2 ч.

Чтобы получить симметричный ангидрид, 6 эквивалентов (6,6 ммоль) защищенного производного аминокислоты растворяли в 10 мл хлористого метилена (для растворения N^α -трет-бутилоксикарбонил-N^G-(мезитилен-2-сульфо)аргинина и гидрата N-трет-бутилоксикарбониллейцина необходима добавка диметилформамида), при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре добавляли 0,517 мл (3,3 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида. Через 10 мин хлористый метилен упаривали в вакууме, а остаток растворяли в 10 мл диметилформамида, раствор вносили в реактор.

После окончания конденсации пептидил-полимер дважды промывали 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае, если тест показывал наличие непрореагировавших аминогрупп, проводили повторную конденсацию карбодиимидным методом с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Для этого проводили нейтрализацию по представленному выше протоколу и конденсацию в течение 1 2 ч.

Чтобы получить активированный карбоксильный компонент, в 10 мл диметилформамида растворяли 3 эквивалента (3,3 ммоль) защищенного производного аминокислоты и 0,446 г 1-гидроксибензотриазола (3,3 ммоль), при охлаждении до 0^oC и перемешивании добавляли 0,517 мл N,N'-диизопропилкарбодиимида (3,3 ммоль), через 30 мин вносили в реактор. По окончании конденсации дважды промывали пептидил-полимер 20 мл диметилформамида по 1 мин, промывали 20 мл хлористого метилена 1 мин, выполняли тест на полноту прохождения реакции пептидообразования. В случае необходимости остаточные аминогруппы блокировали уксусным ангидридом, как было описано выше.

После присоединения последнего аминокислотного остатка удаляли N-концевую трет-бутилоксикарбонильную группировку в соответствии с протоколом деблокирования, после чего пептидил-полимер высушивали и отщепляли пептид от смолы по следующей методике: к 1 г пептидил-полимера добавляли 1,5 мл тиоанизола, перемешивали на магнитной мешалке 10 мин, затем при охлаждении 0^oC приливали 10 мл трифторуксусной кислоты, перемешивали 10 мин. По каплям добавляли 1 мл трифторметансульфокислоты, снимали охлаждение и перемешивали 2 ч при комнатной температуре. Разбавляли реакционную смесь 250 мл охлажденного серного эфира и отфильтровывали осажденный на полимере пептид на фильтре Шотта. Затем смывали пептид с полимера 3 мл трифторуксусной кислоты и высаживали 250 мл серного эфира. Выпавший продукт отфильтровывали, промывали эфиром и сушили в вакууме. Затем пептид обессоливали на колонке с сефадексом G-15 (1,9 x 110 см в 50% уксусной кислоте).

Предварительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с сефадексом SE C-25 в градиенте пиридин-ацетатного буфера. Получили 0,148 г пептида с чистотой 75% по данным высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии.

Окончательную очистку производили с помощью высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографии на хроматографе фирмы "Millipore - Waters" (США) в следующих условиях: колонка Delta-Pak C-18 (19 x 300 мм, 15 мкм); элюент 0,01 М трифторуксусная кислота / 22% ацетонитрил, скорость потока 15 мл/мин, детекция при 230 нм.

После очистки пептид лиофилизовали.

Продукт гомогенен по данным тонкослойной хроматографии и электрофореза. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках фирмы "Merck" (Германия) в системах трет-бутиловый спирт вода уксусная кислота 4:1:1 (R_f 0,13); н-бутиловый спирт уксусная кислота пиридин вода 15:3:10:12 (R_f 0,55); этилацетат пиридин уксусная кислота вода 25:20:6:11 (R_f 0,10)
Электрофорез проводили на бумаге "Filtrak" FN-12 в 2% уксусной кислоте при напряжении 150 В в течение 30 мин. Электрофоретическая подвижность продукта относительно глицина E_Gly 1,7.

Индивидуальность продукта подтверждена высокоэффективной обращеннофазовой жидкостной хроматографией, его чистота составляет более 95% при выходе 0,115 г с 1 г пептидил-полимера, что соответствует 36% от теоретически рассчитанного.

Структура пептида подтверждена аминокислотным анализом на аминокислотном анализаторе T 339 M ("Microtechna", Чехословакия). Данные анализа: Gly 1,02 (1); Leu 1,00 (1); Ser 0,95 (1); Pro 3,07 (3); Tyr 1,05 (1); Phe - 1,02 (1); Lys 0,93 (1); Arg 0,93 (1).

По данным масс-спектрометрии пептид имеет массу 1160,6 (расчетное значение 1160,3). (Спектр снимали на времяпролетном масс-спектрометре с источником "Электроспрей" в Институте энергетических проблем химической физики).

Исследование противоопухолевой активности
H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂
Исследование противоопухолевой активности проводилось в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Онкологическом научном центре ПАМН на крысах Aci и мышах C₃H с опухолями предстательной и молочной желез соответственно. В опытных группах было 6 7 животных, в контрольных в два раза больше. Опухоли третьей генерации (предстательной железы от индуцированного метилхолантреном и тестостероном, молочной от спонтанного рака) перевивались животным под кожу правого бока. Препарат вводился подкожно в дистиллированной воде, крысам в течение 28, мышам 21 дня, в дозах 0,1; 1; 10 и 100 мкг/кг веса животного. Введение начинали через 48 ч после перевивки. Через неделю, 2, 3 и 4 недели после начала лечения опухоли измеряли по трем взаимно перпендикулярным диаметрам, вычисляли объем, находили среднюю величину, процент торможения роста опухоли вычисляли по формуле:
, где V_k и V_o средний объем опухолей в контрольной и опытной группах соответственно.

На модели рака предстательной железы был испытан коммерческий препарат "бусерилин" в дозе 100 мкг/кг.

Результаты представлены в таблице 3.

Протокол изучения цитотоксической активности H-Pro - D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ на культуре клеток карциномы яичников линии CaOv
Препарат H-Pro-D-Phe-Pro-Ser Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ проходил испытания в группе первичного отбора противоопухолевых препаратов НИИ экспериментальной диагностики в терапии опухолей ОНЦ РАМН. Вещество представляло собой лиофилизат, растворимый в воде.

В качестве объекта исследования была использована культура опухолевых клеток карциномы яичников человека (линия CaOv). Культуру клеток выращивали на среде 199, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота, при 37^oC.

Цитотоксический эффект исследуемых соединений определяли радиометрическим методом по включению ³H-тимидина в клетки линии CaOv по стандартной методике. Вещество считалось цитотоксическим, если величина его CE₅₀ (дозы, препятствующей включению в клетки 50% меченого тимидина по отношению к контролю) не превышала 1•10^-4 М.

Результат, представленный в таблице 2, свидетельствует, что цитотоксическая активность исследуемого препарата ниже существующего пограничного критерия.

Использование: в биохимии и медицине. Сущность изобретения: декапептид формулы: H-Pro-DPhe-Pro-Ser-Tyr - DLys-Leu-Arg-Pro-GlyNH₂ синтезирован твердофазным методом с использованием пептидного синтезатора NPS-400 на 4-метилбензгириламинополимере, производных аминокислот L-ряда; N-трет-бутилоксикарбонил глицин, N-трет - бутилоксикарбонил-N^G- /мезитилен-2-сульфо/аргинин, N-трет-бутилоксикарбонил -0-/3-бромбензил/тирозин и производных аминокислот Д-ряда; N^α - трет-бутилокси -карбонил- N^ε -/2-хлорбензилоксикарбонил/-D-лизин и N-трет-бутилоксикарбонил-D-фенилаланин, для очищения пептида от смолы использована трифторметансульфокислота. 3 табл.

Декапептид формулы H Pro D Phe Pro Ser Tyr D Lys Leu - Arg Pro Gly Nh₂, обладающий противоопухолевой активностьюи