СПОСОБ И АППАРАТ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ИММУННОЙ И КИСЛОРОДНОЙ СИСТЕМЫ И СКРИНИНГА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/483 

ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/328409, поданной 27 апреля 2010 года, которая полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Иммунная и кислородная система составляет жизненно важную часть функций организма и защитных механизмов против расстройств и заболеваний у животных и человека. В действительности любое живое существо, включая растения и микроорганизмы, использует внутреннюю систему для борьбы со стрессом и неблагоприятными факторами. Эта способность системы отвечать на заболевание, снабжать энергией ткани, детоксифицировать организм от загрязнений и лекарственных средств, проводить нервномышечные сигналы и т.д., варьируется от индивидуума к индивидууму и ото дня ко дню у одного и того же индивидуума. Эту систему вкратце обозначают в настоящем описании как «иммунная система».

[0003] Например, пациент, страдающий гепатитом C, злокачественной опухолью, другим заболеванием или даже физическим или физиологическим стрессом, может иметь утомленную иммунную систему. Определенные иммунотерапевтические лекарственные средства, разработанные для того, чтобы стимулировать или модулировать иммунную систему, такие как интерферон при гепатите C, или цитокины и/или активированные T-клетки при злокачественной опухоли, помогают иммунной системе индивидуума бороться с данным заболеванием. Интерферон, например, может помочь индивидууму бороться с гепатитом C. Однако, не все индивидуумы отвечают в одинаковой степени на иммунотерапию.

[0004] Различия среди ответов на иммунотерапию показаны в клиническом исследовании для оценки пациентов с гепатитом C при лечении интерфероном, как одобрено Institutional Review Board of the University of Medicine and Dentistry в New Jersey. Вкратце в этом исследовании, хорошо известно о существовании пациентов с гепатитом C, не отвечающих на лечение интерфероном. Dr. William M. Lee в University of Texas Southwestern Medical School предоставили обзор. Dr. Lee и коллеги из девяти других институтов работали над исследованием HALT-C в 2002-2007 гг. В этом исследовании отмечено, что существует 50-60% пациентов, не отвечающих на лечение интерферон плюс рибавирин. Эти не отвечающие на лечение пациенты кроме того не отвечают на длительные поддерживающие интерфероновые стратегии в том смысле, что отсутствует значимая разница в скорости прогрессирования заболевания печени между пациентами, не отвечающими на интерферон, и пациентами, не отвечающими на не интерфероновую поддерживающую терапию. В этой работе встает вопрос: Почему существует разница между отвечающими на лечение пациентами и не отвечающими на лечение пациентами?

[0005] Hinshaw, Sofer и коллеги (Am. J. Physiol Heart Cir. Phys: H742-750 (1980)) обнаружили, когда исследовали экстракорпоральную систему рециркуляции крови в моделях эндотоксического шока на собаках, воздействие сдвига, генерируемое посредством системы циркуляции с экстракорпоральным насосом, ведет к аутоантикоагуляции. То есть кровь, испытывающая воздействие, не будет коагулировать в отсутствие внешних антикоагулянтов, таких как гепарин, даже в системе циркуляции энергично перемешиваемой кровью. Дополнительно они выделили из крови, испытывающей воздействие, HLF, гепаринподобный фактор (пожалуйста, см. ниже ссылку на bNOS), который, как показано, предотвращает коагуляцию. Hinshaw и коллеги (Circ. Shock 1979; 6(3)261-9) также отметили, что такая кровь, испытывающая воздействие, у собак ведет к «излечению» у собак, и аутоантикоагулированные собаки были устойчивы к шоку, когда им вводили бактериальный эндотоксин.

[0006] Автор настоящего изобретения, Sofer, проводил исследование этой проблемы в качестве New Jersey State Sponsored Research Professor of Biotechnology, и обнаружил MOP, или пики молекулярного кислорода (не радикалы кислорода), происходящие из крови, которую создавали из крови, испытывающей воздействие (Comparative Haematology International (1999) 9:68-71). Другие опубликованные работы на основе тысяч опытов группы NJIT Biotechnology Sofer подкрепляют присутствие кислородных пиков, генерируемых посредством многих других типов воздействия: химического, теплового, pH и т.д. Здесь возникают следующие вопросы: Откуда поступает кислород из MOP ввиду того факта, что MOP создают из крови при нулевой концентрации кислорода, когда равновесное содержание кислорода в гемоглобине равно нулю? Почему воздействие высвобождает этот кислород? Почему воздействие усиливает иммунную систему против атаки бактериального эндотоксина? Эти исследователи не прояснили эти вопросы.

[0007] Несмотря на то, что группа Sofer подтвердила возможность того, что зонд, который они использовали для измерений кислорода, также может регистрировать оксид азота или H₂S или другие соединения, они не принимали во внимание комбинированное действие кислорода с этими соединениями и не постулировали существование резервуара NO или других резервуаров.

[0008] В тщательном обзоре литературы по NO, Pieper (Hypertension. 1998; 31:1047-1060.) Galen M. Pieper, Review of Alterations in Endothelial Nitrogen Oxide Production in Diabetes) не говорит о том, что кислород или NO или другие соединения присутствуют в резервуарах и не предполагает их комбинированного действия. Кроме того, в этом обзоре не удалось рассмотреть скорости изменения концентраций этих веществ в виде функции времени, т. е., наклоны кривых, относящихся к скоростям реакций. Он указывает на неубедительность учения об NO в отношении множества основных заболеваний.

[0009] Maltepe и Sougstad (Maltepe, Emin; Saugstad, Ola Didrik, Oxygen in Health and Disease: Regulation of Oxygen Homeostasis-Clinical Implications Pediatric Research: March 2009 - Volume 65 - Issue 3 - стр. 261-268) предлагают подробный обзор роли кислорода в норме и в патологии. Они не рассматривают кислород или NO или другие резервуары, или их комбинированное действие. Любые из указанных выше ссылок, цитированных в разделе уровень техники, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

[0010] Таким образом, существует необходимость в способе оценки или количественного определения способности иммунной системы индивидуума противостоять заболеванию и отвечать на стимулирующие иммунную систему лекарственные средства, такие как интерферон.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Далее упрощенно представлена сущность изобретения для того, чтобы обеспечить базовое понимание некоторых аспектов изобретения. Это краткое изложение не является всесторонним обзором изобретения. Оно не предназначено для того, чтобы идентифицировать ключевые или решающие элементы изобретения или очертить объем изобретения; его единственная цель состоит в том, чтобы представить идеи изобретения в упрощенной форме в виде вступления к более подробному описанию, которое представлено далее.

[0012] Согласно его основным аспектам и излагая кратко, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к способу, включающему этапы, на которых: предоставляют по меньшей мере один датчик; предоставляют образец, содержащий некоторое количество текучего вещества или материала организма с некоторым количеством сигнализирующего материала; определяют базовое значение для указанного количества сигнализирующего материала; оказывают воздействие на указанный образец; определяют посредством указанного датчика значение для ROX в указанном образце; и определяют посредством указанного датчика значение для BOX в указанном образце. Кроме того, настоящий способ включает этап определения изменений в концентрациях ROX и BOX с течением времени.

[0013] Настоящее изобретение кроме того включает в себя аппарат. Один из вариантов осуществления аппарата содержит: оптический зонд и мембранный зонд, функционально связанные с процессором для вычисления значения для ROX и значения для BOX в данном образце. Процессор по настоящему изобретению дополнительно вычисляет скорости изменения концентраций ROX и BOX с течением времени. Эти скорости изменения представлены посредством репрезентативных наклонов.

[0014] Настоящее изобретение кроме того включает в себя способ управления концентрациями ROX и BOX, включающий этапы, на которых: предоставляют по меньшей мере один датчик; предоставляют образец или организм, содержащий некоторое количество материала организма с некоторым количеством сигнализирующего материала; определяют базовое значение для указанного количества сигнализирующего материала; оказывают воздействие на указанный образец или организм; определяют посредством указанного датчика значение для ROX в указанном образце или организме; определяют посредством указанного датчика значение для BOX в указанном образце или организме; и вводят управляющий или блокирующий материал в указанный образец или организм, который может являться пациентом, причем указанный управляющий материал выполнен с возможностью изменения или указанного значения для ROX или указанного значения для BOX в указанном образце или организме.

[0015] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования начала отторжения трансплантата органа или лекарственного средства, включающему этапы, на которых: предоставляют по меньшей мере один датчик; предоставляют образец от пациента, намеревающегося пройти лечение, содержащий некоторое количество материала организма с некоторым количеством сигнализирующего материала; определяют базовое значение для указанного количества сигнализирующего материала; оказывают воздействие на указанный образец, причем указанное воздействие содержит некоторое количество лечебного материала, и указанный лечебный материал представляет собой материал, который является неотъемлемой частью указанного лечения; определяют посредством указанного датчика значение для ROX в указанном образце; и определяют посредством указанного датчика значение для BOX в указанном образце.

[0016] Эти и другие признаки и их преимущества будут без труда видны специалистам в области оценки состояния здоровья и готовности к медицинскому лечению при внимательном прочтении подробного описания предпочтительных вариантов осуществления, сопровождаемых следующими рисунками.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0017] На фигурах:

[0018] на фиг. 1 представлено схематическое представление биологической системы согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0019] на фиг. 2 представлено схематическое изображение, которое иллюстрирует этапы способа измерения концентрации ROX и BOX в образце крови пациента, мониторинг которого осуществляют согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0020] на фиг. 3 представлено схематическое изображение, которое иллюстрирует этапы способа прогнозирования токсичности данного лекарственного средства или другого воздействия согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0021] на фиг. 4 проиллюстрирована одна возможность для получения SOX события через этапы способа согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0022] на фиг. 5. приведено схематическое представление Immunogram™ согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0023] на фиг. 6 представлен график, показывающий типичные серии экспериментов при тестировании аппарата согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения;

[0024] на фиг. 7 представлен график, показывающий вторую серию экспериментов для того, чтобы установить воспроизводимость для тестирующего аппарата и чтобы продемонстрировать токсичность антикоагулянта ACD (кислоты-цитрат-декстроза) согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения; и

[0025] на фиг. 8 представлен график, показывающий два эксперимента, отражающих максимальный уровень BOX и данные о критических точках, определяемые посредством тестирующего аппарата согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0026] Настоящее изобретение представляет собой способ определения состояния иммунной системы практически здорового индивидуума в отношении сопротивления атаке, способ определения ответа пациента и способность отвечать на иммуномодуляторы, или вещества, которые стимулируют или модифицируют эффективность иммунной системы, в качестве части иммунотерапии, в комбинирующихся заболеваниях, таких как гепатит C, и способ корректировки дозы иммуномодуляторов, в частности тех, которые могут быть токсичны в более высоких дозах. Настоящее изобретение дополнительно представляет собой способ определения информации об общем состоянии здоровья, включая потенциал индивидуума переносить и преодолевать внутренние и внешние воздействия.

[0027] Настоящее изобретение представляет собой способ и аппарат для количественного определения способности иммунной системы индивидуума отражать заболевание и получать помощь в этом отношении за счет стимулирующих или модулирующих иммунную систему лекарственных средств, таких как интерферон. Настоящее изобретение также можно применять к нервной системе, системе детоксификации, мышечной системе и системе образования и переноса энергии индивидуума.

[0028] Когда используют внутренний стандарт, этот способ и аппарат также можно использовать для количественного определения токсичности и физиологических эффектов потенциальных будущих лекарственных средств, а также других химических средств. Как используют в настоящем описании, «внутренний стандарт» может включать любой подходящий материал, который может отражать или проявлять свойства или качества тестируемого образца. Например, для целей настоящего изобретения материал, известный как MedX™, который получают из крови коров, представляет собой подходящий внутренний стандарт для сравнения с образцами крови пациентов. Важно, что использование внутреннего стандарта, такого как MedX™, облегчает отслеживание истории и аутентичности образца. Например, если образец разрушен, и связанный внутренний стандарт также разрушен, можно допустить, что внутренний стандарт и образец подвергли схожему воздействию неправильного обращения или воздействию окружающей среды.

[0029] Настоящий способ и аппарат также можно использовать для оценки пригодности биологических маркеров. Кроме того, способ и аппарат также можно использовать для того, чтобы определять общее состояние здоровья индивидуума, включая предоставление информации в отношении силы индивидуума, касающейся способности воспринимать и преодолевать воздействие, заболевание и терапию лекарственным средством.

[0030] Не желая ограничиваться теорией, полагают, что кислород, или молекулы, содержащие кислород, такие как оксид азота и другие сигнализирующие молекулы иммунной системы или сигнализирующие молекулы организма, такие как сероводород и другие, в настоящем описании все обозначают как «сигнализирующие материалы», представляют собой значимый и мощный инструмент в защите организма против проникающих химических веществ и организмов. Хранение и высвобождение больших количеств сигнализирующих материалов, в частности, кислорода, является составной частью иммунной системы организма.

[0031] Однако, сигнализирующие материалы, такие как кислород, растворимы в плазме, например, в очень низкой концентрации. Следовательно, организм должен транспортировать сигнализирующие материалы в подвижной, упакованной форме в необходимые местоположения, такие как порезы, опухоли и ткани, требующие высоких количеств энергии. Эту упакованную форму сигнализирующих материалов обозначают как резервуар кислорода (ROX). Как используют в настоящем описании, термин «ROX» обозначает молекулы кислорода, а также другие сигнализирующие материалы, включая NO и H₂S, которые находятся в упакованной или связанной форме для эффективной доставки через кровь.

[0032] Термины «связанный» и «упакованный» используют взаимозаменяемо, и они относятся в любому средству, такому как электромагнитные силы или упаковка белка, посредством которого клетки в крови, включая белые клетки крови, концентрируют сигнализирующие материалы, такие как кислород и NO, в форме, которую можно транспортировать в крови для использования системами, такими как иммунная система, в организме. Измерение ROX представляет собой измерение врожденной жизнеспособности иммунной системы пациента и того, как пациент будет отвечать непосредственно на данное лечение или лекарственное средство. Когда ROX подвергают воздействию, происходит высвобождение молекул кислорода из связанной формы. Как используют в настоящем описании, «воздействие» определяют как любой фактор, будь он физическим, химическим, электромагнитным или другим, который изменяет существующее состояние или равновесие в крови. Кроме того, воздействие может представлять собой единое, полное воздействие, такое как полная лечебная доза лекарственного средства, частичное воздействие, такое как частичная лечебная доза, или воздействие, которое оказывают более чем один раз с течением времени, такое как полная доза лечебного лекарственного средства, которое вводят множество раз за определенный период времени.

[0033] ROX в крови или тканях представляет собой индикатор резервов сигнализирующих материалов, доступных в крови, и установлено, что он является мерой врожденной способности индивидуума предоставлять кислород или другие важные материалы организма для атаки проникающими инородными химическими веществами и организмами. В дополнение к выполнению функции сигнального средства для ответа на такую атаку, ROX, который высвобождается в кровь за счет воздействия, снабжает сигнализирующими материалами ткани, нуждающиеся, например, в энергии. Помимо просто измерения гемоглобина, который в целом отражает доступный в настоящее время кислород в артериальной крови, ROX представляет собой измерение резервуаров кислорода, NO и H₂S, а также резервуаров других сигнализирующих материалов, которые присутствуют во всех компонентах крови, включая плазму и красные клетки крови. Кроме того, настоящее изобретение можно использовать для того, чтобы анализировать любое текучее вещество организма, включая цереброспинальную жидкость, которая содержит резервуары сигнализирующих материалов.

[0034] Кроме того, установлено, что кислород и сигнализирующие материалы крови или других клеток, которые в настоящем описании называют как «BOX», также представляют собой индикатор адаптивной способности иммунной системы. Как используют в настоящем описании, «BOX» представляет собой измерение способности к окислительному потреблению клеток крови, то есть скорость, с которой происходит потребление кислорода, NO или других сигнализирующих материалов, включая связанные или упакованные, которая относится к скорости, с которой получается ROX для попадания в кровь. Таким образом, BOX также представляет собой измерение адаптивной силы иммунной системы пациента или способности клеток крови увеличивать емкость для сигнализирующих материалов и стимулировать доставку сигнализирующих материалов для использования организмом. Посредством мониторинга уровней BOX можно отслеживать ответ пациента на лечение за более длительный период времени. BOX также дает дозу, при которой происходит запуск иммунного переключателя и которую можно использовать при определении правильной дозы лекарственного средства.

[0035] Полагают, что люди и животные, которые имеют дисбаланс в нормальных концентрациях ROX и BOX в крови (см. фиг. 6 и 7), которые измеримы, более восприимчивы к заболеваниям и отвечают менее эффективно на стимулирующие иммунную систему лекарственные средства, такие как интерферон. Таким образом, точные измерения концентрации ROX и BOX могут иметь клиническое и диагностическое значение для заболеваний животных и человека, в которых иммунная система и общее состояние здоровья имеют значение. Как используют в настоящем описании, термин «дисбаланс» относится к уровню BOX, ROX или сигнализирующего материала в целом, который выше или ниже нормального диапазона, основанного на данных полученных от индивидуумов или других живых организмов, которые не имеют заболеваний, пребывают в расслабленном или не стрессовом и нормальном состоянии. Полагают, что здоровый живой организм, который не подвергается внутреннему или внешнему стрессовому воздействию, имеет нормальный диапазон значений для BOX и ROX.

[0036] Дополнительно установлено, что очень высокая концентрация сигнализирующих материалов, таких как кислород, в течение исключительно длительного времени, также необходима для организма. Этот феномен обозначают как SOX, суперокислительное событие. SOX могут создавать/генерировать клетки крови, а также другие ткани, такие как панкреатические островки. Типичное SOX событие поддается обнаружению после резкого увеличения уровня сигнализирующих материалов в конкретном текучем веществе организма. Например, SOX событие может включать очень большой выброс NO, с промежуточным выбросом O₂, сопровождаемые другими сильными индикаторами иммунного ответа, такими как лактоферрин и миелопероксидаза. Этот сценарий будет исключительно эффективен при борьбе со злокачественной опухолью или СПИДом или патогенами на поле боя в лимфатических узлах. Если, в качестве примера, SOX событие может быть запущено, белые клетки крови, ассоциированные со связыванием сигнализирующих материалов, могут быть возвращены в собственную кровь пациента, текучие вещества организма или материалы для использования в текущей борьбе с заболеванием организма или проблемой.

[0037] Дополнительно, в настоящем изобретении рассмотрен способ провоцирования или создания SOX события в текучем веществе или материале, которые не должны представлять собой текучее вещество организма или материал, которыми обладает пациент в ткани. В случае, когда материалы организма пациента слишком слабы или в целом неспособны создавать SOX событие, способ по настоящему изобретению относится к этапам: 1) предоставления подходящего текучего вещества или материала, который будет принят иммунной системой пациента; 2) провокации SOX события; и 3) введения способного к SOX материала пациенту. Этот способ даст пациенту более хорошую возможность противостоять и преодолевать заболевание, терапию лекарственными средствами или другие воздействия, основываясь на приобретенной способности этого индивидуума создавать SOX события внутри организма.

[0038] Дополнительно, измерение уровней сигнализирующих материалов по сравнению с увеличением количеств в крови, которую подвергают воздействию, предоставляет информацию в отношении врожденной способности крови преодолевать воздействие. Эту демонстрацию силы крови индивидуума, которого подвергают множеству непрерывных воздействий, называют в настоящем описании как «критическая точка» крови или «точка разворота».

[0039] Соответственно, настоящий способ и аппарат измеряют концентрацию ROX и BOX в образце крови. Когда сравнивают с соединением внутреннего стандарта, представляющим нормальную кровь, которая имеет нормальные концентрации ROX и BOX, настоящий способ и аппарат также могут измерять токсичность и физиологический ответ на лекарственные средства, химические средства и другие воздействия. Его также можно использовать в качестве исследовательского инструмента для тех, кто исследует биологические маркеры или другие феномены. Например, T-лимфоциты могут рекрутировать и использовать ROX для окислительной атаки, и нормальные клетки могут рекрутировать и использовать ROX для потребностей окисления глюкозы. ROX также может помочь объяснить и предоставить показатель устойчивости диабета II типа к инсулину.

[0040] В настоящем способе кровь берут у пациента и сравнивают с кровью здорового индивидуума. Этапы способа включают введение некоторого количества свежей взятой или замороженной крови от тестового индивидуума или пациента в лунку в тестирующем аппарате, который имеет считыватель, соединенный с датчиком для обнаружения и измерения ROX, BOX и SOX, а также другой информации, связанной с этими событиями. Пример тестирующего аппарата, подходящего для этого измерения, представляет собой Immunogram Analyzer™ (также называемый в настоящем описании как «IA»). Immunogram Analyzer™ генерирует Immunogram™, которая предоставляет сводку данных о тестовом эксперименте на аппарате. Immunogram™ можно использовать для того, чтобы идентифицировать пациентов, не отвечающих на лечение стимулирующими или модулирующими иммунную систему лекарственными средствами, такими как интерферон.

[0041] An Immunogram Analyzer™ в настоящее время находится на клинических исследованиях. В частности, проводят клинические исследования с участием пациентов с гепатитом C и контрольной группой здоровых пациентов (University of Medicine & Dentistry of New Jersey IRB Протокол № 0120090320). Цель клинического исследования состоит в том, чтобы идентифицировать пациентов, которые имеют дисбаланс в количестве уровней ROX и BOX и исследовать их прогресс во время курса лечения с использованием добавок интерферона и рибавирина. Предполагают, что измерение уровней ROX и BOX будет иметь смысл для лечения других хронических заболеваний, включая диабет и определенные злокачественные опухоли.

[0042] Датчик тестирующего аппарата обнаруживает присутствие ROX и BOX в образце и генерирует вывод концентраций ROX и BOX, включая изменения в этих концентрациях, с течением времени. Эти выведенные концентрации после этого сравнивают с таковыми для здорового индивидуума.

[0043] Тестирующий аппарат также можно использовать во время систематических физических обследований в качестве «базового» индикатора гомеостаза и здоровья. Например, можно осуществлять мониторинг эффектов упражнений, медитаций, лекарственных средств, эмоциональных и других воздействий и т.д. для улучшения состояния тела или предупреждения потенциальных слабых сторон.

[0044] Кроме того, установлено, что работа тестирующего аппарата как закрытой системы с химическими или другими воздействиями дает события, длящиеся вплоть до нескольких часов SOX.

[0045] С использованием простого теста крови посредством Immunogram™ получают информацию, необходимую для того, чтобы дать информированную рекомендацию для лечения. В образцовом тесте этапы включают добавление образца приблизительно в 0,05-0,5 мл крови пациента в лунку или кювету. Настоящим изобретением предусмотрено, что подходящая кювета может представлять собой любую структуру, включая кожу человека, наблюдаемые показания можно считывать через кожу без необходимости брать образец крови. Значения ROX и BOX можно вычислять и выводить с помощью считывателя/процессора, калиброванного на ноль и 100%, основываясь на эквивалентном проценте насыщения O₂. Флуктуации вверх и вниз, наклоны скоростей реакций и диапазоны значений являются считываемыми и имеют потенциальное значение.

[0046] Дисбаланс в концентрациях ROX и BOX указывают на подавленную иммунную систему и того, кто в меньшей степени отвечает на лечение стимулирующими или модулирующими иммунную систему лекарственными средствами. В некоторых заболеваниях, однако, ROX и BOX могут расти временно. Мониторинг уровней ROX и BOX для одного и того же пациента за определенный период времени также может иметь клиническое и диагностическое значение. Соответственно, настоящий способ, в котором измеряют уровни ROX и BOX в крови, может представлять собой инструмент для мониторинга пациента, скрининга лекарственных средств, оценки биологических маркеров, а также других связанных целей.

[0047] Воздействие на кровь, само по себе, или при измерении ROX, BOX и SOX, и впоследствии использование этой крови или веществ из этой крови, чтобы осуществлять лечение пациента, является основным применением этой технологии.

[0048] Использование этого способа для того, чтобы синтезировать признаки ROX, BOX, SOX и других таких событий для целей доставки лекарственных средств, терапии, лечения или протоколов, представляет собой дополнительное применение этой технологии.

[0049] В частности, изобретение описано со ссылкой на фиг. 1, где биологическая система представлена схематически. На фиг. 1 биологическая система, 100, содержит матрицу, 102, которая способна обратимо растворять сигнализирующие материалы, 108. Транспортный материал, 104, такой как белые клетки крови, извлекает и/или связывает сигнализирующие материалы, 108', в матрице для транспортировки к или использования для того, чтобы направить к нежелательному компоненту, 106, такому как инфекция, область злокачественной опухоли, и т.д. для его уничтожения. Для целей изобретения, доступное количество сигнализирующих материалов в матрице, 102, обозначают как ROX, а количество сигнализирующих материалов, способных быть извлеченными посредством связывания и/или транспортного материала для потребления в уничтожении нежелательного компонента, представляет собой BOX. Понятно, что желательно, чтобы как ROX, так и BOX находились в нормальном диапазоне, поскольку это даст достаточное количество сигнализирующих материалов и достаточную возможность утилизации сигнализирующих материалов.

[0050] Настоящее изобретение кроме того включает в себя аппарат для измерения ROX, BOX, SOX и других компонентов, которые относятся к иммунной системе индивидуума или другим функциям организма. В частности, настоящее изобретение относится к тестирующему аппарату, способному осуществлять тесты, которые представляют собой полезные исследовательские инструменты за пределами конкретных применений, описанных в настоящем описании.

[0051] Настоящее изобретение также можно применять к нервной системе, системе детоксификации, мышечной системе или энергетической системе индивидуума или к любому текучему веществу организма, включая способность к связыванию, такому как белые клетки крови, с тем, чтобы предоставлять информацию о силе и эффективности этих систем для преодоления воздействия в зависимости от состояния индивидуума.

[0052] В одном из вариантов осуществления настоящий способ включает этапы измерения концентраций ROX и BOX в образце крови в сравнении с нормой. Полагают, что концентрации ROX и BOX, обнаруживаемые в крови, представляют собой индикаторы для измерения способности иммунной системы снабжать кислородом для защиты от патогенов, сигнализировать и координировать иммунную реакцию и поддерживать уровень гомеостаза. ROX и BOX крови играют интегральную роль в механизме, используемого организмом человека или животного для доставки больших количеств кислорода в ткани при необходимости в зависимости от воздействия, оказываемого на организм.

[0053] Таким образом, настоящее изобретение можно использовать для множества целей, связанных с иммунным ответом у человека и животных на воздействие. Например, способ по изобретению можно использовать для того, чтобы оценивать здоровье человека и животных в целом, например, во время обычного физического обследования, и для того, чтобы оценивать подготовленность пациентов, страдающих злокачественными опухолями, диабетом и синдромом аутоиммунного дефицита (AIDS), к иммунотерапевтическим схемам. Кроме того, настоящий способ можно использовать для того, чтобы оценивать эффективность атлетов в улучшении их состояния, и для тестирования людей, подверженных воздействию загрязнения и других внешних воздействий. Настоящий способ можно использовать для изучения заболеваний, которые в настоящее время четко не определены, таких как фибромиалгия, нервномышечные и нейродегенеративные заболевания.

[0054] Настоящий способ можно использовать для более быстрого и дешевого предварительного скрининга новых лекарственных средств на токсичность и иммуногенность, и для того, чтобы осуществлять мониторинг индивидуумов, участвующих в клинических исследованиях. Другие химические средства, загрязнители окружающей среды или физические воздействия, такие как температура и давление, эмоциональное воздействие, и так далее, также можно тестировать таким образом.

[0055] Врач или ветеринар может использовать ROX и BOX в качестве меры гомеостаза. Затем он или она может использовать ROX и BOX для того, чтобы осуществлять мониторинг пациента, который может быть чувствительным к определенным лекарственным средствам и/или медицинским протоколам. Это можно осуществлять по меньшей мере двумя путями: посредством мониторинга пациента посредством взятия крови для измерения ROX и BOX в реальном времени, когда вводят лекарственное средство или протокол, или посредством измерения ROX и BOX в образце крови пациента, который подвергся воздействию лекарственного средства или протокола, фактически не воздействуя на пациента потенциально опасным лекарственным средством или протоколом.

[0056] Другой признак настоящего изобретения относится к прямому измерению NO в организме. До этого изобретения прямое измерение NO не было доступно. Здесь представлена демонстрация того, как это изобретение можно использовать в профилактике, прогнозе и лечении злокачественной опухоли и в качестве исследовательского инструмента для прояснения основных вопросов в исследовании злокачественных опухолей.

[0057] Обнаружено, что оксид азота очень важен в защите от злокачественных опухолей. Для того, чтобы организм создал оксид азота, должны пройти следующие этапы: 1) ген должен кодировать фермент, синтазу оксида азота (NOS); 2) этот код должен быть экспрессирован; 3) фермент, NOS, должен быть изготовлен из кода NOS; 4) фермент должен иметь все субстраты и кофакторы, которые ему нужны для создания оксида азота; 5) фермент должен быть активирован; и, в соответствии с этим изобретением, 6) NO должен быть связан в форме, которую легко транспортировать в место использования и накапливать в нем.

[0058] Число форм кодирующих NOS генов составляет сотни. Эти формы охарактеризованы как: эндотелиальная, eNOS; индуцируемая, iNOS; нейронная, nNOS; и митохондриальная, mNOS. Это изобретение раскрывает новый тип NOS из крови - bNOS.

[0059] Конечным продуктом является NO, который наиболее важен. Следовательно, в этом описании использован упрощенный термин «NOS» для всех этих категорий.

[0060] В статье с обзором литературы, которая озаглавлена «An emerging role for endothelial nitric oxide synthase in chronic inflammation and cancer», Cancer Res. 2007 Feb 15, 67(4): 1407-10, L. Ying и L.J. Hofseth резюмируют, что NOS модулирует все важные пути злокачественных опухолей, включая апоптоз, ангиогенез, клеточный цикл, инвазию и метастазирование. Эти исследователи отмечают, что также регуляция NOS нарушена в солидных опухолях человека и что NOS также играет роль в хроническом воспалении. Их рекомендация состоит в том, чтобы использовать NOS в качестве параметра в профилактике и лечении злокачественных опухолей.

[0061] В исследовании тканевых срезов печения человека от 100 пациентов, которое проводили M. A. Rahman et al., которое озаглавлено, Co-expression of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in hepatocellular carcinoma and surrounding liver: possible involvement of COX-2 in the angiogenesis of hepatitis C-virus positive cases Clin Cancer Res 2001 May; 7(5): 1325-32, Rahman и коллеги заключают, что несмотря на то, что отдельно экспрессия NOS не является прогностическим фактором смертности у пациентов с положительной по вирусу гепатита C (HCV) гепатоцеллюлярной злокачественной опухолью (HCC), комбинация экспрессии NOS и ЦОГ-2 коррелирует со смертностью у пациентов с HCV/HCC.

[0062] Недавно S. Fujita et al. в статье, озаглавленной «Genetic polymorphisms in the endothelial nitric oxide gene correlate with overall survival in advanced non-small-cell lung cancer patients treated with platinum-based doublet chemotherapy», BMC Medical Genetics 2010, 11:167 отмечают, что существует более 160 генетических полиморфизмов для NOS. Они обнаружили один конкретный аллель гена NOS, который является маркером выживаемости у пациентов с немелкоклеточной злокачественной опухолью легких (NSCLC). В исследовании 108 пациентов с NSCLC и получающих лечение на основе платины этот ген NOS представляет собой маркер выживаемости.

[0063] С одной стороны, пациенты с HCV и HCC не выживают, когда имеет место экспрессия генов NOS и ЦОГ-2. С другой стороны, пациенты с NSCLC, экспрессирующие NOS выживают, когда происходит экспрессия гена NOS. Как можно объяснить это явное противоречие?

[0064] Генетическая экспрессия NOS представляет собой сложный, дорогостоящий и требующий времени способ анализа. Что более важно, простая экспрессия гена NOS не является достаточной, чтобы определить, что в действительности происходит образование NO. Данное изобретение относится к инструменту, IA, который легко анализирует доступный NO. Дополнительно, это позволяет постулировать механизм, который объясняет явное противоречие. Например, можно спрогнозировать, что пациенты с NSCLC, которые выжили, имеют механизм ROXNO, тогда как пациенты с HVC/HCC, которые не выжили, не имеют достаточно ROXNO, и что для ЦОГ-2 необходим кислород и, следовательно, представляет собой дополнительную нагрузку для ROX.

[0065] Способность формировать объясняющие модели заболеваний для тестирования является важной для поиска лечения злокачественных опухолей. Как используют в настоящем описании, объясняющую модель заболевания формируют посредством следующих этапов: 1) создать модель заболевания; 2) осуществить клиническое или научное исследование для того, чтобы верифицировать модель; 3) если модель верна, расширить ее; и 4) если модель не верна, модифицировать или улучшить ее в соответствии с данными.

[0066] Как проиллюстрировано на фиг. 2, один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к следующему аппарату и этапам способа. Во-первых, предусмотрен тестирующий аппарат, который имеет лунку для образца 10 или кювету с датчиком или зондом 20 и считыватель/процессор 30. Что существенно, кювета 10 может представлять собой структуру любого типа, включая кожу человека. Тестовые зонды вставляют внутрь кюветы и тестирующий аппарат калибруют с тем, чтобы показания уровней сигнализирующих материалов находились на нуле. Например, соединение A, такое как не содержащий сигнализирующие материалы физиологический раствор, можно добавлять в кювету E, чтобы получить базовое показание инструмента без сигнализирующего материала. Альтернативно, газ, который не содержит сигнализирующий материал, можно барботировать в кювету.

[0067] Когда установлен базовый уровень, показывающий нулевое показание для сигнализирующих материалов, количество крови D добавляют в кювету E. Это количество крови D может представлять собой маленькое количество, такое как между приблизительно 0,02 мл и приблизительно 0,10 мл, свежей взятой или замороженной крови тестового индивидуума или пациента. Для удобства, образец 3,00 мл крови с добавлением антикоагулянта можно замораживать для будущего анализа. Очень маленькие образцы крови, такие как менее чем приблизительно 0,02 мл, также можно анализировать.

[0068] Начальное показание получают для уровней сигнализирующих материалов в образце перед каким-либо оказываемым воздействием. Затем смесь соединения A и крови D подвергают начальному воздействию B. Подходящее воздействие будет представлять собой воздействие физического сдвига, создаваемое посредством вводящего шприца и/или вращающегося магнитного перемешивателя. Затем датчик в кювете E определяет падение концентрации сигнализирующих материалов, которое предположительно вызвано посредством добавления воздействия B. В целом, это падение концентрации сигнализирующих материалов дает значение BOX, которое коррелирует со способностью системы инкорпорировать сигнализирующие материалы для транспортировки. После этого падения, любое повышение концентрации сигнализирующих материалов дает значение ROX, которое коррелирует со способностью системы предоставлять резервуар сигнализирующих материалов.

[0069] Датчик тестирующего аппарата предпочтительно содержит два или более датчиков - один может представлять собой мембранный кислородный электрод 22, такой как полярографический кислородный электрод Кларка, который измеряет O₂, NO, H₂S и другие сигнализирующие материалы, которые не связаны и, таким образом, могут проникать через мембрану. В полярографических датчиках анод, который поляризован, и катод погружают в электролит, в который кислород и другие сигнализирующие материалы проникают через мембрану. Пара анод/катод обуславливает протекание тока, прямо пропорциональное количеству сигнализирующего материала, такого как кислород, входящего в систему. Величина тока, таким образом, непосредственно коррелирует с количеством сигнализирующего материала, входящего в зонд или датчик. Очевидно, что мембранный датчик обязательно исчерпает образец тестируемого материала, как результат потребления, хотя в настоящем описании полагают, что уровень материала, потребляемого датчиком, имеет порядок величины, который не имеет значения для практических целей.

[0070] Другой датчик 24 или зонд может представлять собой оптический флуоресцентный анализатор растворенного кислорода, такой как покрытый рутением оптоволоконный светоизлучающий диодный (LED) зонд Ocean Optics, и также может включать другие подходящие устройства на основе света, включая лазер (далее в настоящем описании в совокупности обозначают как «оптический датчик»), который определяет величину значения для O₂ и связанного резервуара O₂ (ROXO₂). Другие датчики, такие как датчики на основе чипов, также можно использовать, исходя из цены, удобства и чувствительности к новым сигнализирующим и реагирующим веществам.

[0071] Тестирующий аппарат по настоящему изобретению может включать компьютеризированную систему, в которой линии данный для каждого зонда соединены с компьютером, который включает процессор, дисплей и системное программное обеспечение, чтобы предоставить возможность обработки и организации данных, получаемых посредством зондов, а также вычисления значений для важных событий, таких как событие ROX, BOX или SOX.

[0072] Как используют в настоящем описании, «ROXO₂» представляет собой поддающийся определению резервуар O₂, и «ROXNO» представляет собой поддающийся определению резервуар NO. Когда ROXO₂ и ROXNO связаны посредством крови и, в частности, белых клеток крови, которые подготавливают сигнализирующие материалы для использования организмом, ROXO₂ и ROXNO неспособны проходить через мембранный датчик. Однако, после наступления события BOX, повышенные уровни сигнализирующих материалов в образце, как определяют посредством мембранного или оптического датчика, которые имеют склонность повторять друг друга, дают количества ROXO₂ и ROXNO. Например, если показание мембранного датчика идет к нулю, подразумевая, что весь несвязанный O₂ измерен или проник через мембрану, последующий подъем в показаниях оптического датчика можно считать альтернативным определением количества ROXO₂. Аналогичным образом, когда мембранные показания для NO идут к нулю, что подразумевает, что весь несвязанный NO измерен или проник через мембрану, последующий подъем показаний мембранного датчика этого сигнализирующего материала дает количество ROXNO, что предполагает, что весь кислород учтен отдельно, например, посредством оптического датчика.

[0073] Среди этих двух или более датчиков, следовательно, тестирование предоставление показания для O₂, NO, ROXO₂ и NO, который находится в связанном резервуаре (ROXNO), как показано на фиг. 6 и 7. Для этого варианта осуществления полное измерение ROX включает ROXO₂+ROXNO. Таким образом, показания мембранного зонда и оптического зонда вместе предоставляют общую концентрацию BOX и ROX (ROXO₂+ROXNO) в образце после оказания физического воздействия B. Также наклоны кривых на фиг. 6 и 7 дают полезную информацию в отношении скоростей реакций этих компонентов. Например, повышение уровней сигнализирующих материалов может отражать событие ROX и его хронометраж, тогда как падение уровня сигнализирующих материалов может отражать событие BOX и его хронометраж.

[0074] Вкратце, когда сигнализирующие материалы используют в реакции для воздействия, будет показано, что уровни сигнализирующих материалов падают. Однако, когда эти падения наступают, любые последующие подъемы уровней сигнализирующих материалов отражают присутствие и количества связанных сигнализирующих материалов или резервуаров сигнализирующих материалов, которые предварительно не были обнаружены.

[0075] Как дополнительно проиллюстрировано на фиг. 2, смесь соединения A и крови D затем подвергают химическому воздействию C. Воздействие C может представлять собой мощное химическое средство, такое как 6% водный фенол или другой тип воздействия, достаточно сильный для того, чтобы высвободить по существу любой оставшийся ROX в образце. Затем датчик в кювете E измеряет любой подъем кислорода и NO, который предположительно представляет собой результат оказания воздействия C. Этот подъем кислорода и NO после оказания этого воздействия дает количество оставшегося ROX в растворе. Уровни сигнализирующих материалов, такие как уровни в образце с течением времени отслеживают и регистрируют посредством считывателя/процессора 30 тестирующего аппарата.

[0076] Важно, что BOX и ROX текучего вещества организма похоже влияют друг на друга. Например, если текучее вещество организма имеет аномально низкий ROX, BOX для этого аналогичного текучего вещества также будет проявлять тенденцию к снижению, поскольку доступно меньше сигнализирующего материала для связывания. Аналогичным образом, если BOX текучего вещества организма аномально низок, в том отношении, что текучее вещество имеет меньше способностей к связыванию, ROX проявит склонность к снижению, поскольку будет иметь место меньше связанного сигнализирующего материала. Кроме того, врожденную силу текучего вещества организма можно определять посредством поддающихся обнаружению событий ROX и BOX этого текучего вещества с течением времени. В более сильном, чем нормальное текучее вещество, при оказании большего воздействия и/или более сильного воздействия будет получено значение для BOX и/или ROX внутри нормального диапазона, по сравнению с более слабым, чем нормальное текучее вещество, при котором будет получено значение для BOX и/или ROX за пределами нормального диапазона, если подвергли аналогичным воздействиям.

[0077] Изменения в концентрациях ROX и BOX кроме того могут показывать, является ли ответ индивидуума на воздействие острым или хроническим. Например, по существу ослабленный BOX может представлять собой прогностический фактор для острого в противовес хроническому ответу. Если BOX пациента аномально низок после события воздействия, ответ пациента может представлять собой хронический ответ, тогда как если бы уровень BOX был нормальным и выше после воздействия, это могло бы быть указанием на острый ответ.

[0078] Настоящее изобретение кроме того включает в себя способ измерения токсичности данного лекарственного средства или другого воздействия. Этот способ отличается от способа на фиг. 2, поскольку внутренний стандарт (или кровь пациента), в сочетании с данным лекарственным средством или токсином, можно использовать для того, чтобы определять токсичность этого лекарственного средства по отношению к стандарту, или чувствительность отдельного пациента к этому лекарственному средству или токсину. Как показано на фиг. 3, предусмотрен тестирующий аппарат, имеющий лунку для образца 10 или кювету с датчиком 20 и считыватель/процессор 30. Соединение A вводят внутрь кюветы E тестирующего аппарата. Соединение D, которое представляет собой образец заменителя крови, такой как бычья кровь с добавлением антикоагулянта, затем добавляют в кювету E. Смесь соединения A и соединения D затем подвергают первому химическому воздействию B. Датчик кюветы E измеряет любое падение сигнализирующих материалов, которые генерируют количество BOX в образце. Затем второе химическое воздействие C добавляют в смесь в кювете E. Измеряемый подъем сигнализирующих материалов, как обнаруживают посредством датчика, дает количество ROX в образце. Таким образом токсичность данного лекарственного средства можно тестировать, или для общего скрининга лекарственных средств, или для мониторинга токсичности лекарственного средства у данного пациента.

[0079] Настоящее изобретение кроме того включает в себя способ получения SOX события и измерения ROX и BOX пациента, переносящего такое событие. Как проиллюстрировано на фиг. 4, соединение A добавляют в кювету E, которая имеет датчик или датчики. Образец крови S добавляют в кювету. Добавляют физическое или химическое воздействие B. Падение сигнализирующих материалов, измеряемое посредством кюветы, дает BOX. Физическое или химическое воздействия C и другие можно добавлять для того, чтобы ускорить «разгорание» иммунного ответа, и кювету закрывают от внешнего окружения. SOX событие происходит с течением времени и его регистрируют. SOX представляет фактическое «разгорание» клеток крови. Таким образом, смесь, содержащая этот материал, может иметь очень важное применение, например, в терапии и/или излечении злокачественной опухоли и AIDS, когда возвращают пациенту.

[0080] Чтобы иметь клиническое и диагностическое значение, показания концентрации ROX и BOX сравнивают с таковыми для здоровых индивидуумов, или с тем же индивидуумом во время нормального состояния здоровья. В целом, если концентрации ROX и BOX для тестового индивидуума или пациента находятся за пределами нормального диапазона по сравнению с концентрациями для них у здорового индивидуума (или у того же пациента, во время периода здоровья), тестовый индивидуум или пациент имеет дисбаланс и, таким образом, вероятно, более низкую способность отвечать на атаку заболевания или сниженный ответ на иммуномодуляторы, чем усредненный индивидуум. Если концентрации ROX или BOX у тестового индивидуума или пациента находятся в нормальном диапазоне концентраций по сравнению с таковыми у здорового индивидуума, будут ожидать, что тестовый индивидуум отвечает на заболевание обычным образом и пациент должен хорошо отвечать на иммуномодуляцию.

[0081] Здесь принимают во внимание, что мембранный датчик и оптический датчик, если используют, оба предоставляют измерение, которое коррелирует с молекулярным кислородом, однако, мембранный датчик обнаруживает другие материалы, такие как NO. В предпочтительном варианте осуществления корреляция измерений предоставляет аналитический инструмент, который допускает непрямое определение дополнительных компонентов, тем самым значительно расширяя диагностическую и биологическую информацию.

[0082] Схематическая Immunogram™ предоставлена на фиг. 5. В Immunogram, результаты оптического измерения показаны сплошной линией в виде функции времени (T), а результаты мембранного датчика показаны штриховой линией. Сигнал, двигающийся вверх, показывает увеличение измеряемых материалов, а сигнал, двигающийся вниз, показывает снижение измеряемого материала.

[0083] Со ссылкой на фиг. 5, устанавливают базовый уровень 200, который представляет общее количество сигнализирующих материалов, измеряемых в матрице. Два сигнала типично схожи, за исключением высокого уровня NO или других материалов, которые измеряют посредством мембранного датчика. В конкретный момент времени T1 в системе создают воздействие, в соответствии с чем происходит извлечение сигнализирующих материалов из матрицы белыми клетками крови, например, для транспортировки. Снижение измеряемого сигнализирующего материала 202 коррелирует с сигнализирующим материалом, удаляемым из матрицы для транспортировки, который обозначают в настоящем описании как BOX. В момент времени T2 воздействие увеличивают, и это дополнительное воздействие вызывает высвобождение сигнализирующих материалов в матрицу. Общее количество сигнализирующих материалов 204 представляет собой ROX. Количество кислорода, как измеряют посредством оптического датчика, 206 делает возможным определение сигнализирующих материалов, которые не являются кислородом, таких как оксид азота, посредством разницы между сигнализирующим материалом, измеряемым посредством мембранного датчика, 208, и таковым, измеряемым посредством оптического датчика, 206, который обозначают как ROXNO, 212. В частности, после формирования ROX, и ROX больше, как определяют посредством мембранного датчика, а не оптического датчика, разность представляет собой количество NO. ROXO₂, обозначаемый посредством 210, представляет собой общую сумму ROX за вычетом ROXNO, показанную посредством 212.

[0084] Пример данных, генерируемых тестирующим аппаратом по настоящему изобретению, показан на фиг. 6. На этой фигуре показаны шесть экспериментов. Начиная с левой части диаграммы, первый и третий эксперименты представляют собой повторения с использованием физиологического раствора. Второй эксперимент представляет собой калибровку нуля, где барботирование гелием (или любую другую процедуру) используют для того, чтобы отметить «нулевую» точку, с уравновешиванием 20,9% атмосферным кислородом, используемым для того, чтобы определять базовый уровень. Следующие два эксперимента представляют собой повторные инъекции с использованием смеси физиологического раствора/бората, которые демонстрируют увеличения BOX и ROX в присутствие бората, как используют типично в глазных примочках. Финальный эксперимент демонстрирует эффект аспирина, показывающий очень быстрое высвобождение NO, как ожидается из сосудорасширяющих и противосвертывающих свойств аспирина. Эксперимент также демонстрирует новый путь для механизма активности аспирина в крови: этот путь влияет на кровь непосредственно и немедленно. Новый путь также может помочь открывать пути и эффекты других лекарственных средств.

[0085] Как дополнительно показано, выходной сигнал датчика Кларка с мембраной, который измеряет O₂ и NO, представлен короткими штрихами с открытыми квадратами. Оптический датчик (показан сплошной линией с ромбами) измеряет только O₂. Разница между двумя датчиками (большие штрихи с открытыми кругами) показана для удобства. Падение на обоих датчиках связано с добавлением крови. Падение линии мембранного датчика определяют как BOX, и оно показано стрелкой меньшего размера на фиг. 6. Кривая оптического датчика не падает так сильно, как у мембранного датчика. Разница, открытые круги, представляет кислород, который не может пересечь мембрану, но может быть зарегистрирован оптически. Это ROXO₂. Точка, в которой добавляют воздействие C, представляет большое увеличение в показаниях. Стрелка большего размера на фиг. 6 обозначает повышение, которое определяют как ROX. Следует отметить, что мембранные показания выше, чем оптические показания. Это обозначает, что NO (и, возможно, другие соединения, такие как H₂S) вновь высвобождены. Это связано с прорывом ROXNO плюс любой мгновенно образованный NO. Настоящее изобретение относится к единственному известному способу для непосредственного определения NO, присутствующего в текучем веществе или материале. Кроме того, если тестируемый материал изначально показывает нулевую концентрацию для NO, и после этого обнаруживают NO, обнаружение bNOS дополнительно показано в таком тестовом эксперименте. Другие датчики, с мембранами или без них, также можно использовать, отдельно или в комбинации.

[0086] В таблице I, как показано ниже, суммированы данные, показанные на фиг. 6, и продемонстрировано использование настоящего изобретения для того, чтобы определять токсичность и другие эффекты фармацевтических средств, оказываемые на кровь. Как боратная глазная примочка, так и аспирин влияют на ROX и BOX по сравнению с экспериментами с физиологическим раствором на крови пациента. Эффект аспирина, оказываемый на того же пациента, отражает противосвертывающие результаты для этого пациента. Быстрый рост образования NO из ROXNO и результирующий синтез NO, не показанный в таблице, полезен, например, при анализе аспирина в крови. На фиг. 6 происходит образование большого количества NO в интервале между маркерами, на расстоянии 2 секунд.

Таблица I Сводка по фиг. 6, демонстрирующая использование аппарата. Эффект бората и аспирина, оказываемый на кровь человека, выдержанную в течение 5 суток при комнатной температуре. 0,10 мл крови, 0,9 мл физиологического раствора. Числа приведены в процентах насыщения воздуха. Комментарии подлежат интерпретации исследователем.   1 Физиологический раствор
Среднее 2-х экспериментов 2 Борат
Среднее 2-х экспериментов 3 Аспирин Комментарии BOX 27 41 35 Аспирин и борат увеличивают ROX и BOX, при этом борат оказывает более сильное влияние, чем аспирин. ROX 57 79 74 ROXO₂ 20 27 29 ROXNO 23 31 34 Примечание Базовое значение Борат представляет собой стимул в медицинских концентрациях Аспирин стимулирует ROXO₂ и ROXNO Аспирин образует больше ROXO₂, чем ROXNO.
Аспирин индуцирует измеримое и быстрое повышение NO, повышение 37% за 2 секунды (фиг. 4)

[0087] Большое количество дополнительной информации моно получить из типичного тестового эксперимента с помощью тестирующего аппарата: BOX, на который указывает падение в обнаруживаемых сигнализирующих материалах, может давать наклон и концентрацию в нескольких точках, из которых можно извлекать кинетику Михаэлиса-Ментен (кривая кислорода как функция скорости реакции) и более изощренные способы для анализа кинетики реакции. Последующий медленный подъем дает скорости подъема кислорода и NO, часть ROX дает скорости доставки NO и O₂. Кроме того, если понятно, что гемоглобин присутствует в образце крови, кривая BOX на уровне насыщения 50% в этом образце должна показывать значительное снижение наклона в связи со скоростью потребления O₂. Наклоны BOX показывают, что механизм для крови и потребления O₂ выходит за пределы простой диффузии O₂ из гемоглобина. Также работают электромагнитные силы. В частности, белые клетки крови также захватывают или используют сигнализирующие материалы, которые предположительно являются парамагнитными по природе, когда в связанной форме, посредством использования электромагнитных сил. По причине насыщения ниже 50% гемоглобин начинает высвобождать дополнительный O₂ d раствор. Если потребление O₂ было постоянным, наклон будет выглядеть более пологим, поскольку будет происходить добавление нового кислорода.

[0088] На фиг. 7 представлен график, показывающий 12 экспериментов с использованием тестирующего аппарата. Эти эксперименты осуществляли для того, чтобы тестировать воспроизводимость аппарата, обработку стандартного заменителя крови и навыки оператора в измерении стандартов крови. Начиная слева, первые 3 эксперимента выполнены экспериментатором 1. Остальные эксперименты осуществлял экспериментатор 2. Также тестировали концентрации антикоагулянта ACD. Результаты показывают, что замораживание стандартов крови слегка снижает BOX и ROX, и более высокие концентрации ACD, в комбинации с замораживанием, снижают ROX и BOX, наиболее часто отражающие грубое обращение со стандартной кровью.

[0089] Результаты теста на фиг. 7 резюмированы ниже в таблице II. Эти серии экспериментов демонстрируют, как определять оптимальные рабочие концентрации и условия тестирующего аппарата и как использовать аппарат для обучения операторов аппарата.

Таблица II Резюме для фиг. 7, демонстрирующее использование аппарата. Эффекты заморозки и высоких концентраций антикоагулянта ACD, оказываемые на стандарт бычьей крови. 0,05 мл крови, 0,3 мл физиологического раствора. Числа представляют собой процент насыщения воздуха. Комментарии подлежат интерпретации исследователем.   1
Среднее 5 экспериментов
Свежая 1,2× ACD 2
Среднее 3 экспериментов
Замороженная 1,2× ACD 3
Среднее 2 экспериментов
Свежая 2,2× ACD 4
Среднее 3 экспериментов
Замороженная 2,2× ACD Комментарии BOX 78 78 80 74 Самое большое воздействие с замороженной 2,2 ACD.
Клетки крови создают больше ROXO₂ в ожидании химической токсичности.
Токсичность предотвращает образование RONXO. ROX 118 113 108 99 ROXO₂ 31 30 33 34 RONXO 26 25 20 21 Примечания Замораживание 1,2× ACD снижает ROX на 4% Замораживание 2,2 ACD Снижает BOX на 8%
Снижает ROX на 9%
Увеличивает ROXO₂ на 10%
Снижает RONXO на 25%

[0090] Предпочтительно для клинического исследования, нормальные концентрации ROX и BOX, по которым сравнивают тестовые образцы, будут получать посредством получения образцов у большой популяции индивидуумов, которые не получают предписанные лекарственные средства и которые описывают себя как не являющимися больными. Распределение концентраций ROX и BOX будут генерировать по этой популяции. Среднее будет определять базовый уровень, установленный на стандартное значение, такое как 100.

[0091] Ниже в таблицах III и IV приведены данные, собранные в частной клинике, которые относятся к ответу в образцах крови «нормальных» индивидуумов (индивидуумы, которые не имели заболевание на момент теста) по сравнению с индивидуумами, инфицированными гепатитом C. Как проиллюстрировано в таблице III, устанавливали средний стандарт воздействий, и серию экспериментов выполняли для того, чтобы измерять уровни кислорода в образцах посредством мембранного датчика и оптического датчика. Основываясь на этих измерениях, мембранный датчик обнаруживал процентную долю приблизительно больше чем 20% кислорода, а оптический датчик обнаруживал процентную долю приблизительно больше чем 11,5% кислорода в крови, которая находилась в состоянии воздействия.

Таблица III Частная клиника - Ответ при среднем воздействии Эксперимент Описание Мембранный
O₂+NO₂, % Оптический
O₂+ROXO₂, % 1 MedX Stress Std 34 7,8 2 Гепатит С 26,4 12,4 3 Нормальный 13,1 11,1 4 Гепатит С 23,6 15,6 5 Нормальный 19,1 9,4 6 Нормальный 15,2 4,6

«Нормальное» среднее воздействие

M<20 L<11,5

[0092] В таблице IV показаны ROX, BOX и уровень NO, обнаруженные в образцах крови от тех же индивидуумов. Основываясь на измерениях ROX, BOX и NO, нормальная кровь проявляла ROX между приблизительно 40 и приблизительно 110, BOX между приблизительно 40 и приблизительно 160 и NO приблизительно менее 200. Задача этой таблицы заключается в том, чтобы показать способ определения диапазона значений нормального ROX и BOX для целей идентификации дисбаланса по отношению к BOX и ROX. Фактические полученные значения не так важны, как факт того, что определили, что диапазон BOX и ROX как является нормальным в пределах этого получения образцов индивидуумов. В случае пациентов с гепатитом С, например, диапазон нормальных значений можно впоследствии корректировать по мере получения большего количества клинических данных.

Таблица IV Частная клиника - ROX, BOX, NO Эксперимент Описание ROX BOX NO 1 MedX Stress Std 82,7 200 206 2 Гепатит С 110,6 187 237 3 Нормальный 108,3 155 162 4 Гепатит С 113,9 173 205 5 Нормальный 101,1 101 93 6 Нормальный 91,1 44 45

«Нормальный» ROX: 40<ROX<110

«Нормальный» BOX: 40<BOX<160

«Нормальный» NO: NO<200

[0093] Ниже в таблице V приведена информация, связанная с критической точкой крови по отношению к настоящему изобретению. Тесты проводили при постепенном увеличении токсина, на повышающихся уровнях в крови. После считывания показаний BOX при воздействии 1, химическое воздействие добавляли частями вместо добавления за один раз. Типично, количество токсина, такое как 0,2 мл 6% фенола добавляли последовательно три раза, для воздействия 2, 3 и 4. При низких уровнях в крови начинается образование ROX, и происходит рост уровней O₂ и NO. Над кровью преобладает токсин, и происходит высвобождение O₂ и NO.

[0094] При высоких уровнях в крови, кровь достаточно сильна для того, чтобы преодолеть воздействие 2, рост уровней O₂ и NO не происходит, наоборот, происходит потребление большего количества кислорода. Этот уровень представляет собой критическую точку, обозначающую, что кровь преодолевает это воздействие.

[0095] Для указанного выше оптического зонда критическая точка начинается при 0,10 мл крови. Для мембранного зонда критическая точка начинается при 0,20 мл крови. Индивидууму с более сильной кровью будет нужно меньше крови для того, чтобы достичь критической точки. Таким образом, для каждого индивидуума можно осуществлять мониторинг профиля иммунной системы. Таким образом, каждый индивидуум может оптимизировать свое состояние здоровья посредством наблюдения за двумя отдельными профилями (оптический и мембранный профили) в качестве функции образа жизни, физических нагрузок, воздействия лекарственных средств и токсинов и т. д.

Таблица V Определение силы иммунной системы Уровень воздействия
Низкий = 1
Высокий = 4 1 2 3 4 Оптический зонд
Точка разворота
Сильная или слабая 0,02 мл крови Слабая Слабая Слабая Слабая 0,05 мл крови Слабая Слабая Слабая Слабая 0,10 мл крови Слабая Слабая Сильная Сильная 0,20 мл крови Слабая Слабая Сильная Сильная Мембранный зонд
Точка разворота
Сильная или слабая 0,02 мл крови Слабая Слабая Слабая Слабая 0,05 мл крови Слабая Слабая Слабая Слабая 0,10 мл крови Слабая Слабая Слабая Сильная 0,20 мл крови Слабая Слабая Сильная Сильная

[0096] На фиг. 8 представлен график, показывающий два теста. Результат этих тестов детализирован в таблице VI. Приведенные значения представляют собой процент насыщения (100% = количество эквивалентного кислорода в воде, уравновешенное воздухом при атмосферном давлении и 25°C). Эксперименты для 0,20 и 0,05 мл крови приведены на фиг. 8. Максимальные скорости BOX берут начало только от воздействия сдвига. Формирование NO происходит после того, как добавляют химическое воздействие и завершают эксперименты.

[0097] Эти данные можно использовать многими способами для того, чтобы оценивать общую силу иммунной системы. Например, профили максимальной скорости BOX для обоих зондов можно наблюдать у пациента на данном лекарственном средстве, и сравнивать с предыдущим экспериментом без лекарственного средства, чтобы оценить ответ пациента на лекарственное средство. Это также можно выполнять для того, чтобы оценить ответ атлета на режим тренировки и т. д.

[0098] Положение точки «разворота» может быть определено по экспериментам и использовано для того, чтобы калибровать общую иммунную силу субъекта, подобно титрованию крови, как показано на фиг. 8.

[0099] Конечная концентрация NO, и общее образование NO, указывают на очень важные аспекты противосвертывающего действия на кровь для пациентов с заболеваниями сердца, доступность NO и дозу ROXNO для пациентов с нейромышечной дистрофией, в частности, пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна, которые, как известно, имеют дисбаланс NO.

Таблица VI Определение силы иммунной системы посредством измерения максимальной скорости BOX и общего образованного NO   Максимальная скорость BOX
Общая/на мл крови
Оптический зонд Максимальная скорость BOX
Общая/на мл крови
Мембранный зонд Образование NO
Общее/на мл крови 0,02 мл крови 8,47/423,5 4,24/212 39,33/1,9665 0,05 мл крови 32,98/659,6 7,87/157,4 39,33/786,6 0,10 мл крови 37,52/375,2 9,08/90,8 35,55/355,5 0,20 мл крови 42,36/211,8 17,4/87 29,95/149,75

[00100] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено, что определение ROX и BOX можно использовать во множестве применений от увеличения способности живого организма бороться с заболеванием, принимать терапию, включая трансплантат органа, и в целом улучшать здоровье.

[00101] Таким образом, настоящее изобретение кроме того включает в себя способ управления концентрациями ROX и BOX, включающий этапы: 1) предоставления датчика; 2) предоставления образца или организма, включая количество материала организма с некоторым количеством сигнализирующего материала; 3) определения базового значения посредством датчика для некоторого количества сигнализирующего материала; 4) оказания воздействия на образец или организм; 5) определения посредством датчика значения для ROX в образце или организме; 6) определения посредством датчика значения для BOX в образце или организме; и введения управляющего или блокирующего материала в образец или организм, причем управляющий материал выполнен с возможностью изменять одно из значений для ROX или BOX в образце или организме. Основываясь на этом способе, успешный управляющий или блокирующий материал можно идентифицировать и вводить в живой организм в эффективном количестве для того, чтобы корректировать любой дисбаланс ROX и BOX, чтобы создать SOX событие, или подготовить организм к приближающемуся воздействию.

[00102] Настоящее изобретение кроме того включает в себя способ прогнозирования начала отторжения трансплантата органа или лекарственного средства, включающий этапы: 1) предоставления датчика; 2) предоставления образца от пациента, намеревающегося пройти лечение, содержащего некоторое количество материала организма с некоторым количеством сигнализирующего материала; 3) определения посредством датчика базового значения для количества сигнализирующего материала; 4) оказания воздействия на образец, причем воздействие содержит некоторое количество лечебного материала, и лечебный материал представляет собой материал, который является составной частью лечения, а именно трансплантата органа; 5) определения посредством датчика значения для ROX в образце; и 6) определения посредством датчика значения для BOX в указанном образце. Основываясь на значениях ROX и BOX для пациента, которого подвергли взятию образца приближающегося лечения, можно определять способность пациента принять новый орган или отторгнуть существующий трансплантат.

[00103] Те, кто хорошо знакомы с исследованиями в науках о жизни, примут во внимание, что многие модификации и замены можно выполнять в указанных выше предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения, которые определены посредством приложенной формулы изобретения.

Группа изобретений относится к области мониторинга здоровья по части функции иммунной системы и измерения эффектов токсинов и других воздействий. Способ включает в себя предоставление аппарата, предоставление образца крови, установление базового значения молекулярного кислорода, приложение воздействия на упомянутый образец, получение данных об изменении концентрации молекулярного кислорода и скорости ее изменения, а также сравнение полученных данных с данными здорового индивидуума. При этом аппарат содержит первый и второй датчики, а также процессор, функционально связанный с первым и вторым датчиками. Также раскрывается аппарат для определения состояния иммунной системы индивидуума и способ улучшения работы иммунной системы. Заявленная группа изобретений позволяет оценить и количественно определить способность иммунной системы индивидуума противостоять заболеванию и отвечать на стимулирующие иммунную систему лекарственные средства. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 табл.

1. Способ определения состояния иммунной системы индивидуума, включающий этапы, на которых:
(a) предоставляют аппарат, содержащий
(i) первый датчик, который представляет собой оптический зонд;
(ii) второй датчик, который представляет собой мембранный зонд; и
(iii) процессор, функционально связанный с первым и вторым датчиками, причем первый и второй датчики выполнены с возможностью обнаруживать молекулярный кислород, процессор выполнен с возможностью вычислять значения концентрации молекулярного кислорода и скорость изменения концентрации молекулярного кислорода;
(b) предоставляют образец крови из тела индивидуума, причем образец крови содержит молекулярный кислород;
(c) устанавливают базовое значение молекулярного кислорода посредством упомянутого аппарата;
(d) оказывают воздействие на упомянутый образец, причем воздействие является физическим или химическим воздействием;
(e) получают данные об изменении концентрации молекулярного кислорода и скорости изменения концентрации молекулярного кислорода от упомянутого образца посредством упомянутого аппарата после осуществления воздействия;
(f) сравнивают посредством упомянутого аппарата полученные данные об изменении концентрации молекулярного кислорода и скорости изменения концентрации молекулярного кислорода индивидуума с данными здорового индивидуума, определяют на основе сравнения возможности работы иммунной системы индивидуума.

2. Способ по п. 1, в котором образец включает в себя оксид азота и в котором второй датчик обнаруживает оксид азота и отправляет процессору электрические сигналы в ответ на обнаружение оксида азота.

3. Способ по п. 2, в котором первый датчик обнаруживает только молекулярный кислород и в котором первый датчик и второй датчик вместе обнаруживают весь молекулярный кислород и оксид азота в образце и отправляют процессору электрические сигналы в ответ на обнаружение.

4. Способ по п. 3, в котором этап воздействия дополнительно содержит этап перемешивания образца со скоростью и в течение периода времени, достаточными, чтобы вызвать снижение концентрации молекулярного кислорода или оксида азота.

5. Способ по п. 4, в котором добавляют химический реагент в образец, причем химический реагент является токсином или фенолом.

6. Способ по п. 5, в котором упомянутый химический реагент имеет свойства, которые вызывают увеличение концентрации молекулярного кислорода или оксида азота.

7. Способ по п. 1, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап добавления токсина в образец.

8. Способ по п. 1, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап добавления фенола в образец.

9. Способ по п. 8, в котором упомянутый фенол является 6% фенолом.

10. Способ по п. 1, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит перемешивание образца.

11. Способ по п. 1, в котором этап воздействия дополнительно содержит этап инъекции определенного количества лекарственного препарата или объекта, предложенного для лечения пациента, в образец.

12. Способ по п. 1, в котором этап воздействия дополнительно содержит этап выдерживания образца.

13. Способ по п. 1, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап добавления определенного количества антикоагулянта в образец и затем выдерживание образца.

14. Способ по п. 13, в котором антикоагулянт представляет собой кислоту-цитрат-декстрозу.

15. Способ по п. 1, в котором первый и второй датчики выводят сигнал электрического тока, пропорциональный молекулярному кислороду в образце.

16. Способ по п. 1, в котором оптический зонд представляет собой оптический флуоресцентный зонд растворенного кислорода.

17. Способ по п. 16, в котором оптический флуоресцентный зонд растворенного кислорода является покрытым рутением оптоволоконным светодиодным зондом.

18. Способ по п. 1, в котором мембрана представляет собой полярографический кислородный зонд.

19. Аппарат для определения состояния иммунной системы индивидуума, содержащий:
первый датчик, который представляет собой оптический зонд;
второй датчик, который представляет собой мембранный зонд; и
процессор, функционально связанный с первым и вторым датчиками, причем первый и второй датчики выполнены с возможностью обнаруживать молекулярный кислород в образце, процессор выполнен с возможностью вычислять значения концентрации молекулярного кислорода и скорость изменения концентрации молекулярного кислорода, определять базовое значение молекулярного кислорода; получать данные об изменении концентрации молекулярного кислорода и скорости изменения концентрации молекулярного кислорода от упомянутого образца после осуществления химического либо физического воздействия; сравнения полученных данных об изменении концентрации молекулярного кислорода и скорости изменения концентрации молекулярного кислорода индивидуума с данными здорового индивидуума, определения на основе сравнения возможности работы иммунной системы индивидуума.

20. Аппарат по п. 19, в котором оптический зонд представляет собой спектрографический зонд.

21. Аппарат по п. 19, в котором оптический зонд представляет собой оптический флуоресцентный зонд растворенного кислорода.

22. Аппарат по п. 21, в котором оптический флуоресцентный зонд растворенного кислорода является покрытым рутением оптоволоконным светодиодным зондом.

23. Аппарат по п. 19, в котором мембрана представляет собой полярографический кислородный зонд.

24. Способ улучшения работы иммунной системы посредством управления концентрациями молекулярного кислорода в крови пациента, содержащий этапы, на которых:
(а) предоставляют аппарат, содержащий
(i) датчик на основе мембраны;
(ii) оптический датчик, причем датчик на основе мембраны и оптический датчик обеспечивают измерения сигнала электрического тока как функцию времени, которая пропорциональна концентрациям молекулярного кислорода в образце крови;
(b) берут образец крови из тела индивидуума, причем образец включает в себя молекулярный кислород;
(c) переносят образец крови в тестовую лунку, по существу закрытую от внешней среды;
(d) устанавливают базовое значение молекулярного кислорода посредством упомянутого аппарата;
(е) оказывают воздействие на образец крови в лунке воздействием, вызывающим уменьшение концентрации молекулярного кислорода, причем воздействие является физическим или химическим воздействием;
(g) определяют уменьшение концентрации молекулярного кислорода в образце крови по отношению к базовому значению посредством упомянутого аппарата;
(h) вводят управляющий материал в образец, причем управляющий материал выполнен с возможностью увеличивать одно из значений для концентрации молекулярного кислорода или скорости изменения концентрации молекулярного кислорода в образце;
(i) определяют увеличение концентрации молекулярного кислорода в образце крови по отношению к базовому значению после упомянутого этапа ввода управляющего материала посредством упомянутого аппарата;
(j) вводят управляющий материал в тело индивидуума в количестве, достаточном, чтобы корректировать концентрацию молекулярного кислорода или скорость изменения концентрации молекулярного кислорода.

25. Способ по п. 24, в котором воздействием является воздействие фенолом.

26. Способ по п. 25, в котором упомянутый фенол является 6% фенолом.

27. Способ по п. 24, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап перемешивания образца крови.

28. Способ по п. 24, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап инъекции определенного количества лекарственного препарата или объекта, предложенного для лечения индивидуума, в образец крови.

29. Способ по п. 24, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап выдерживания образца.

30. Способ по п. 24, в котором этап оказания воздействия дополнительно содержит этап добавления определенного количества антикоагулянта в образец и затем выдерживание образца.

31. Способ по п. 30, в котором антикоагулянт представляет собой кислоту-цитрат-декстрозу или гепарин.

32. Способ по п. 24, в котором индивидуум имеет биологическую систему с матрицей, способной обратимо связывать молекулярный кислород в крови.

33. Способ по п. 24, дополнительно содержащий повторение этапов (a)-(j), чтобы увеличить концентрацию молекулярного кислорода в крови индивидуума.