ШТАММ O №2108/ЗАБАЙКАЛЬСКИЙ/2010 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА О ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ТИПА О Российский патент 2016 года по МПК C12N7/00 C12Q1/04 A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано при разработке и изготовлении средств диагностики ящура типа О, а также для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является одним из самых опасных в эпизоотическом и экономическом отношении вирусных заболеваний сельскохозяйственных и диких парнокопытных животных. Его опасность обусловлена высокой контагиозностью, изменчивостью и генетическим разнообразием возбудителя, множественностью путей передачи инфекции, узкой специфичностью приобретенного иммунитета, ограничивающегося рамками определенного серотипа, и способностью вируса поражать различные виды животных [1, 2].

Экономический ущерб при ящуре складывается из потерь от гибели и вынужденного убоя больных животных, уничтожения контаминированной продукции, снижения продуктивности зараженных животных, затрат на вакцинопрофилактику, карантинирование, ветеринарно-санитарные меры, направленные на ликвидацию вспышек заболевания.

Ситуацию осложняют бессимптомные формы течения болезни, длительное вирусоносительство даже среди высокоиммунных животных, а также целый ряд встречающихся клинически сходных болезней вирусной этиологии [3].

Устойчивое благополучие, достигнутое в стране, не гарантирует от спорадических вспышек заболеваний, связанных с заносом возбудителя на животноводческие фермы из сопредельных государств, энзоотичных по ящуру [4]·

Возбудителем заболевания является вирус ящура, который относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtoviras, имеет 7 серотипов: А, О, С, Азия, Sat1, Sat-2, Sat-3 и множество антигенных вариантов [2].

Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков [2, 5].

Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых молекулярно-биологическими исследованиями, до существенных, регистрируемых серологическими методами с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.

В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.

Во второй половине 20 века в качестве производственных штаммов вируса ящура типа О на территории России использовали: штамм О₁ №1618 Чечено-Ингушский, выделенный в 1966 году; Ο₁ №194, выделенный в 1957 году в Волгоградской области. Указанные штаммы использовали для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся около полувека, в настоящее время поддерживаются в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

В начале 21 века были получены штамм типа О №1736/Абхазия/2000, выделенный от КРС в Гальском районе Абхазии, О №1964/Монголия/2004, выделенный от КРС в феврале 2004 г. в Восточно-гобийском аймаке Монголии, для изготовления диагностических и вакцинных препаратов [6].

В апреле 2000 г. на территории РФ в Приморском крае в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района от свиней был выделен изолят, из которого получен штамм типа О №1734 «Приморский-2000» [7, 8].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм типа О №1734 «Приморский-2000» принадлежит к Паназиатской генетической линии вируса ящура типа О. Паназиатский вирус вызвал пандемию ящура в 1999-2000 годах в большинстве стран Азии, в том числе во Вьетнаме, Японии, Корее, Монголии, а также Армении и Грузии. Опустошительная эпизоотия ящура в Великобритании в 2001 г. также была вызвана паназиатским вирусом. Исследуемый вирус имеет наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами О Вьетнам/99 и О Тайвань/99. Установлено, что изолят О №1734 «Приморский-2000» отличается от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от штаммов Ο₁ №194 и Ο₁ №1618, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики.

Производственный штамм №1734 «Приморский-2000» использовался в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах-членах СНГ.

В 2010 г. в Японии, Южной Корее, Гонконге и континентальном Китае вспышки ящура типа О были вызваны вирусом топотипа Юго-Восточная Азия, относящимся к генетической линии Муа-98 [9].

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм №1734 "Приморский-2000" вируса ящура типа О для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа О, выделенных в различные временные промежутки, а приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.

Вспышка ящура на территории РФ была отмечена в августе 2010 г. в селе Макарово Шилкинского района в 300 км от границы с Китаем, где не проводилась профилактическая вакцинация животных против ящура типов А, О, Азия-1. Из 95 голов КРС разного возраста, имевшихся у жителей, переболело 100%, из 182 свиней - 52 головы.

В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа О для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную активность после инактивации, пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории России.

Указанная задача решена получением штамма О №2108/Забайкальский/2010 (авторское наименование) вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2108/Забайкальский/2010, был выделен в августе 2010 года от больного крупного рогатого скота в с. Макарово Шилкинского района Забайкальского края (экспертиза №2108). Производственный штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О депонирован 27 февраля 2012 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой): вирус ящура штамм О №2108/Забайкальский/2010 (производственный).

По сравнению со штаммом-прототипом штамм О №2108/Забайкальский/2010 обладает более высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP 1.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О.

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцируется образование специфических антител, выявляемых в ИФА и РМН.

При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного штамма типа О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О имеет близкое филогенетическое родство с изолятами, выделенными в Монголии в 2010 г., и значительно отличается от штаммов Ο₁ Manisa, О №1734 «Приморский-2000» сублинии PanAsia, а также от вируса топотипа Средний Восток - Южная Азия (ME-SA) сублинии О PanAsia2. Гомология изолятов О №2108/Забайкальский/2010 и О/Монголия/С03/2010 составляет 99,69%.

Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм О №2108/Забайкальский/2010 принадлежит к топотипу Юго-Восточная Азия (SEA) генетической линии Муа-98 вируса ящура серологического типа О, но к другой генетической линии, нежели изоляты из Южной Кореи, Японии, континентального Китая и из поселка Абагайтуй Забайкальского края (июль 2010 г.).

Антигенное родство штамма О №2108/Забайкальский/2010 с производственными штаммами вируса ящура O₁ Manisa, Ο₁ №1618, О №1734/Приморский/2000 и О PanAsia2 изучено в ИФА и РМН.

Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) составило для О₁ Manisa - 0,33, О №1734 «Приморский-2000» - 0,62, О PanAsia2 - 0,42. При значении r₁≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₂≤0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [10].

Результаты исследований в ИФА представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r₁) составило для Ο₁ №1618 - 0,25, О №1734/Приморский/2000 - 0,35, О PanAsia2 - 0,47. При значении r₁ - 0,4-1,0 производственный штамм находится в близком антигенном родстве; при значении r₁ - 0,2-0,39 - полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза; при значении r₁<0,2 - полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым вирусом.

Биотехнологические характеристики

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 репродуцируется в монослойных культурах клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и IB-RS-2. В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,25 до 6,75 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,2-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2108/Забайкальский/2010, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в августе 2010 года от подозреваемого в заболевании ящуром крупного рогатого скота из села Макарово Шилкинского района Забайкальского края (экспертиза №2108/2010). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 3 сентября 2010 года.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [11].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение вируса и его адаптацию.

Выделение вируса на культуре первично трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и крупном рогатом скоте с последующей адаптацией (3 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После 30-минутного контакта при 37°C во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°C до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК и ИФА на наличие вирусного антигена, при этом использовали коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящиеся в музее штаммов ФГБУ «ВНИИЗЖ», и «Набор для выявления антигена вируса ящура в ИФА», изготовленный ФГБУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18-24 часов проявлялось (%) 90-100 ЦПД в монослое.

Адаптация эпизоотического изолята О №2108/Забайкальский/2010 к различным клеточным линиям наступала на уровне 3 пассажей. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для гипериммунизации морских свинок.

Вирус, адаптированный к культурам клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК и ИФА.

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О к использованным клеточным культурам.

Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в реакциях: РСК и ИФА с целью идентификации его типовой принадлежности (таблицы 4 и 5). Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.

Приведенные в таблицах 4 и 5 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2108/Забайкальский/2010 выявлен антиген вируса ящура типа О в разведении 1:4 в РСК и 1:64 в ИФА.

Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.

Пример 2

Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура типа О, репродуцированный в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением 8-10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000, очищают от балластных примесей добавлением 10% хлороформа. Очищенный вирус и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,05% при значении pH 8,0-8,3.

Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см³ внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [9].

После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.

После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при температуре 4°C в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют во флаконы по 0,5-1,0 см³ и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 6.

Данные, приведенные в таблице 6, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 3

Для получения антигена для серологических и иммунохимических реакций используют штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% афтозной суспензии. Пассирование проводят в течение 3-5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.

Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%) 8-10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена, характеристики которой приведены в таблице 7.

Результаты исследований, приведенные в таблице 7, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 4

Штамм О №2108/Забайкальский/2010 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1-2 животных массой 250-300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000-10000000 ИД₅₀/1 см³ с антибиотиками, вводят по 0,2-0,3 см в 20-40 каналов интрадермалингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20-30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей с последующим добавлением в нее антибиотиков и равного объема глицерина. Полученную 10% суспензию вируса оценивают в ИФА на типоспецифичность и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на соответствие исходному вирусу по первичной структуре гена VP1. Активность вируса в РСК должна быть не ниже 1:4.

Инфекционную активность вируса определяют на КРС и в первичной культуре клеток СП. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционной активности не менее 10^4,0 ИД₅₀/0,1 см. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при температуре минус (70°C - 40°C).

Источники информации

1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой. / Под ред. и с предисл. канд. вет.наук. П.В. Малярца. - М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.] - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Шажко, Ж.А. Обоснование методических основ современных схем лабораторной диагностики ящура и других везикулярных болезней / Ж.А. Шажко // Совр. аспекты вет. патол. ж-ных: матер, конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 23-31.

4. Сухарев, О.И. От эпизоотии к устойчивому благополучию по ящуру (к 100-летию открытия) / О.И. Сухарев, Б.А. Кругликов, Н.И. Черныш // Ветеринария. - 1997. - №6. - С. 8-13.

5. Вирусные болезни животных / Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. [и др.] - М., ВНИИТИБП, 1998, С. 532-548.

6. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004/ Т.А. Фомина, В.К. Спирин, А.И. Егорова [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 94-104.

7. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1734 «Приморский-2000» / В.К. Спирин, А.И. Егорова, С.Р. Кременчугская [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 52-57.

8. Пат. РФ №2204599, C12N 7/00, А61K 39/135, 20.05.2003 г.

9. Southeast Asian Foot-and-Mouth Disease Viruses in Eastern Asia / N.J. Knowles, J.J. He, Y. Shang [et al.] // Emerg Infect Dis. - 2012. - V. 18(3): P. 499-501.

10. ΟΙΕ. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and beers). - 7th Edition, Paris, 2008. -Vol. 1. - P. 203-207.

11. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002, 31 с.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae типа О сем. Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2108/Забайкальский/2010. Представленный штамм репродуцируется в первично трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и почки свиньи (IB-RS-2). В течение 18-24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений 6,25-6,75 lg ТЦД₅₀/см³. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов, сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae типа O, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером вирус ящура штамм О №2108/3абайкальский/2010 (производственный), для изготовления биопрепаратов для диагностики ящура типа О, характеризующийся тем, что он получен в течение последовательного пассирования в культурах клеток гомологичного и гетерологичного происхождения, обладает высокой биологической активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную активность после инактивации.

2. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в первично трипсинизированной культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4.

3. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток свиной почки (СП) с титром инфекционной активности 6,25 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:4, в иммуноферментном анализе (ИФА) - 1:64.

4. Штамм по п. 1, характеризующийся тем, что он получен в течение 3 последовательных пассажей в перевиваемой культуре клеток почки свиньи (IB-RS-2) с титром инфекционной активности 6,75 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в реакции связывания комплемента (РСК) 1:6, в ИФА - 1:64.

5. Штамм по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что после инактивации он индуцирует в организме морских свинок образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:30 и в ИФА в разведении 1:10000.