СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОГЕСТОГЕНА В КАЧЕСТВЕ ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО СЕНСИБИЛИЗАТОРА Российский патент 2016 года по МПК A61K31/573 A61K38/22 A61P11/06 A61P29/00 A61P37/00 

Ссылка на родственные заявки

В этой заявке заявляется приоритет по предварительной заявке на патент US 61/302,325, поданной 08 февраля 2010 г., которая полностью входит и на которой основана настоящая заявка.

Область техники

Глюкокортикоидная нечувствительность представляет собой сложную проблему при терапии болезней/состояний с помощью глюкокортикоидов, т.к. такая терапия является неэффективной. Настоящее изобретение относится к способам и наборам для назначения прогестогена в качестве глюкокортикоидного сенсибилизатора для восстановления кортикостероидной чувствительности или вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности или повышения глюкокортикоидной чувствительности с целью терапии одного или более заболеваний или состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью. Например, настоящее изобретение относится к способам вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности у субъекта, который не имел рецидива, связанного с менструальным циклом, или аллергических реакций по отношению к собственным гормонам, в частности к прогестерону, таких как предменструальное или околоменопаузальное нарушение в симптоматике, например, предменструальное ухудшение состояния здоровья или предменструальное обострение астмы, и который демонстрирует относительно или в целом рефрактерный ответ на глюкокортикоидную терапию, в частности глюкокортикоидную резистентность. Способы и наборы по настоящему изобретению обеспечиваются для назначения полового гормона субъекту, имеющему кортикостероидную зависимость или кортикоидную резистентность или невосприимчивость или интолерантность к кортикостероидам.

Предшествующий уровень техники

Кортикостероиды предназначены для терапии первого ряда различных иммунно-воспалительных и аллергических болезней. Например, аутоиммунные болезни включают более 70 хронических расстройств, которыми поражено около 5% населения США, и которые включают расстройства, которые наиболее всего проявляются у женщин (более 80%), такие как синдром Сегрена, СКВ, аутоиммунное заболевание щитовидной железы (тиреоидит Хашимото и болезнь Грейвса) и склеродермия, или которые более распространены среди женщин (6075%), такие как ревматический артрит (РА), рассеянный склероз (РС) и миастения гравис, или которые одинаково распространены как среди мужчин, так и среди женщин, такие как саркоид и воспалительная болезнь кишечника. Глюкокортикоидная нечувствительность может проявляться в виде как относительной, так и полной рефрактерности к глюкокортикоидной терапии; невосприимчивости или интолерантности к кортикостероидам; устойчивости к адекватной дозе вводимых кортикостероидов; первоначальной восприимчивости к кортикостероидам, но с последующим быстрым рецидивом после уменьшения дозы или прекращения приема (кортикостероидная зависимость); кортикоидной резистентности, т.е. необходимости приема высоких доз при терапии; или в случае «плохо поддающийся терапии» или серьезности заболевания. Например, 20-30% пациентов с тяжелой формой болезни Крона, резистентной к стероидам, не воспринимают терапию стероидами [Michetti P, Mottet C, Juillerat P, Felley C, Vader J-P, Burnand B, Gonvers J-J, Froehlich F: Severe and Steroid-Resistant Crohn's Disease. Digestion 2005;71: 19-25].

Болезни/условия, относящиеся к глюкокортикоидной нечувствительности могут включать следующие: рефрактерная воспалительная болезнь кишечника типа рефрактерного язвенного колита или тяжелой формы болезни Крона у детей, кортикостероид-рефрактерная астма или глюкокортикоид-резистентная астма или симптоматическая кортикостероид-зависимая астма, десквамативная интерстициальная пневмония, невосприимчивая к кортикостероидам, рефрактерная воспалительная миопатия, рефрактерная миастения гравис, рефрактерная вульгарная пузырчатка, ревматический артрит, рефрактерный к метотрексату, рефрактерный нефротический синдром у взрослых, кортикостероид-зависимая системная красная волчанка (СКВ), первичный синдром Сегрена, системный васкулит и полимиозит, хроническая реакция трансплантат против хозяина, кортикостероид-зависимый или рефрактерный рассеянный склероз, рефрактерная целиакия, саркоидоз, резистентный к стероидам, выпадение слизистой оболочки при рефрактерной вульгарной пузырчатке, рефрактерный синдром Шнитцлера, резистентный дерматит головы и шеи, острый рефрактерный атопический дерматит, рефрактерная идиопатическая тромбоцитопения пурпура, рефрактерный орбитальный миозит, рефрактерная или рецидивная лимфома, больные в критическом состоянии с сепсисом или синдромом острой дыхательной недостаточности (РДСВ) или недостаточностью коры надпочечников, кортикостероид-зависимые состояния (например, розацеа, ревматическая полимиалгия, гигантоклеточный артериит, полимиозит, дерматомиозит, болезнь Кавасаки, синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, мультифокальная двигательная нейропатия, синдром мышечной скованности и т.д.). Глюкокортикоидная нечувствительность несет серьезную угрозу здоровью и требует значительных социальных усилий и экономических издержек. Например, небольшой процент (5-10%) пациентов, страдающих астмой, имеет тяжелое состояние, рефрактерное к кортикостероидам вплоть до полной невосприимчивости, однако, сумма счетов этих пациентов составляет более 50% от общей суммы затрат всех пациентов, страдающих от астмы.

Супрессия глюкокортикоидов при воспалении является, главным образом, как результатом активации противовоспалительных генов, так и результатом супрессии провоспалительных генов. Экспрессия активации противовоспалительных генов начинается, как только глюкокортикоид связывается с цитозольным глюкокортикоидным рецептором (ГР), который активируется и транслоцируется к ядру. Попав в ядро, он связывается с глюкокортикоид-отвечающими элементами (ГОЭ) и молекулами коактиваторов транскрипции, и вызывает ацетилирование коровых гистонов, что приводит к экспрессии противовоспалительных генов. Воспалительные стимулы включают множество воспалительных генов, которые кодируют цитокины, хемокины, молекулы адгезии, воспалительные энзимы и рецепторы с помощью провоспалительных факторов транскрипции, таких как ядерный фактор κB (NFKB) и белок-активатор 1, и рекрутинга молекул корепрессора. Активированные глюкокортикоидные рецепторы связываются с коактиваторами в ядре для непосредственного ингибирования активности гистонацетилтрансферазы (HAT) и рекрутинга гистондеацетилазы 2 (HDAC2), что приводит к супрессии активированных воспалительных генов.

Уже было выявлено несколько возможных молекулярных механизмов глюкокортикоидной резистентности, которые включают генетическую чувствительность, отсутствие или дефект связи с ГР и транслокации, сниженная экспрессия ГР, отсутствие активности корепрессора или повышенная активация воспалительных путей. Например, глюкокортикоидные рецепторы могут фосфорилироваться неколькими киназами (например, MAP-киназой p38, c-Jun-N-терминальной киназой и киназой, регулируемой внеклеточными сигналами), что приводит к дефекту связывания, альтерации стабильности, транслокации в ядро, связывания с ДНК и взаимодействия с другими белками. Избыточная активация фактора транскрипции белка-активатора-1 может препятствовать связыванию ГР с глюкокортикоид-отвечающими элементами (ГОЭ) или ингибированию ядерного фактора κB; оксид азота (NO) может нитровать остаток тирозина на ГР; ГР может также быть убиквитинован (Ub), что ведет к деградации ГР протеосомой, пониженной экспрессии гистондеацетилазы 2 (HDAC2), повышенному фактору ингибирования миграции макрофагов и повышенному p-гликопротеин-опосредованному оттоку лекарственных веществ из клетки [Peter J Barnes, Ian M Adcock. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet 2009; 373: 1905-17].

Клинические и биологические механизмы стероидной зависимости не так хорошо изучены по сравнению с механизмами стероидной резистентности. Стероидная зависимость и стероидная резистентность могут иметь некоторые общие внутренние механизмы, в то время как другие механизмы являются просто клиническими или фармакологическими.

Предпринималось множество попыток добиться повышения эффекта терапии глюкокортикоидной нечувствительности. Обычным методом здесь является применение противовоспалительной терапии широкого спектра типа терапии иммунодепрессивными или иммуномодулирующими средствами (например, циклоспорин, метотрексат, золото, 6-меркаптопурин, биологические препараты типа иммуноглобулина и меполизумаба) и ингибиторами кальциневрина (например, циклоспорин, такролимус). Предлагались и разрабатывались различные методы для вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности терапией ингибиторами MAP-киназы p38, ингибиторами c-Jun-N-терминальной киназы, витамином D при стероид-резистентной астме (для увеличения числа регуляторных T-клеток), ингибиторами фактора торможения миграции, активаторами гистон деацетилата-2, теофиллином, ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы-5, антиоксидантами, ингибитором индуцибельной NO-синтетазы и ингибиторами p-гликопротеина. Применение прогестогена для вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности нигде не предлагалось и не обсуждалось, и настоящее изобретение представляет собой значительное, непредсказуемое и неожиданное продвижением вперед в этой области.

Различные методы управления глюкокортикоидной нечувствительностью имели ограниченный успех. Некоторые препараты действовали в определенном состоянии, но не действовали при других. Метотрексат является эффективным при ревматическом артрите, но может оказаться неэффективным в случае рефрактерной воспалительной болезни кишечника, вызванной повышенной экспрессией p-гликопротеина. Подобно этому, ингибиторы кальциневрина оказывают полезный эффект некоторым пациентам с рефрактерной воспалительной болезни кишечника, но они не оказывают положительного эффекта в случае глюкокортикоид-резистентной астмы. Далее, применение этих препаратов часто вызвано их обширной рекламой. Высокий процент пациентов (60-70%) не могут использовать терапию метотрексатом из-за побочных эффектов. Ингибиторы фосфодиэстеразы-4 для хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и воспалительных состояний имеют дозолимитирующие побочные эффекты типа тошноты, диареи и цефалгии. Значительная токсичность и побочные эффекты воспрепятствовали продвижению программ разработки таких лекарственных препаратов как ингибиторы MAP-киназы p38 и селективные ингибиторы киназы NFKB (IKKP/NFKB) [Peter J Barnes, Ian M Adcock. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet 2009; 373: 1905-17].

Учитывая то, что значительная часть пациентов с аутоиммунными, аллергическими и лимфопролиферативными заболеваниями являются невосприимчивыми к терапии глюкокортикоидами, а также то, что множество различных воспалительных заболеваний имеют подобные молекулярные механизмы глюкокортикоидной нечувствительности, то до сих пор в этой области существует нереализованная потребность в разработке способов определения общей терапевтической стратегии для вызова обратного развития стероидной нечувствительности. Для этих целей было исследовано применение прогестогена в соответствии с настоящим изобретением, что привело к разработке непредсказуемого, неожиданного и осуществимого на практике способа, который может помочь пациентам, страдающим от болезней и состояний, которые являются невосприимчивыми или интолерантными к кортикостероидам или кортикостероид-зависимыми и резистентными.

Препараты прогестогена широко использовались для широкого круга репродуктивных болезней и состояний в течение более 60 лет и известны, как препараты, обладающие противовоспалительным эффектом. Большинство исследований, относящихся к воспалительным реакциям, проводились на моделях, ассоциирующихся с беременностью [Progesterone/PR Maintains Uterine Quiescence via Antiinflammatory Actions. Carole R. Mendelson. Minireview: Fetal-Maternal Hormonal Signaling in Pregnancy and Labor Molecular Endocrinology 23: 947-954, 2009]. Один из исследователей (Gellersen, 2009) обеспечил всесторонний обзор негеномных действий прогестерона и обобщенный возможный механизм противовоспалительного эффекта прогестерона, включая такой эффект, что прогестерон противодействует продуцированию простагландина в матке беременной, в частности за счет ингибирования экспрессии циклооксигеназы (ЦОГ-2); иммуннорегуляторной функции в T-лимфоцитах посредством активации G-белка и ингибирования калиевого канала; также прогестерон-индуцируемый блокирующий фактор (ПИБФ) действует на энзим фосфолипазы A2, интерферирует в метаболизме с арахидоновой кислотой, индуцирует иммунный ответ, смещенный в сторону Th2, и проявляет антиабортивный эффект за счет контроля активности NK-клеток [Gellersen B et al. Non-genomic progesterone actions in female reproduction Human Reproduction Update, Vol.15, No. l pp. 119-138, 2009]. В другом обзоре (Challies, 2009) предполагаются другие возможные механизмы: прогестоген блокирует пролиферацию митоген-стимулированных лимфоцитов, модулирует продуцирование антител, ослабляет оксидантную реакцию моноцитов, снижает продуцирование провоспалительных цитокинов макрофагами в ответ на бактериальные продукты реакции и преобразует секрецию цитокинов клонов T-лимфоцитов, главным образом, в продуцирование IL-10, повышающее регулирует экспрессию Toll-подобных рецепторов 4 (TLR-4) и подавляет ответ TLR-2 на инфекцию во внутриматочных тканях, за счет чего играет защитную роль по отношению к преждевременным родам, ингибирует экспрессию базальных и цитокин-стимулирующих матриксных металлопротеиназ MMP-1 и MMP-3 в культивируемых децидуальных клетках, проявляющих защитные свойства против преждевременных родов [Challis JR et al. Inflammation and Pregnancy Reproductive Sciences 2009; 16; 206]. Поскольку концепция применения прогестогена для вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности нигде не раскрывалась, не изучалась, не предлагалась, не обсуждалась и не представлялась, настоящее открытие представляет собой значительный и неожиданный шаг в этой области.

Рецидивы медицинских состояний, связанные с менструальным циклом, имеют хорошо распознаваемые симптомы, и эти состояния могут включать гемицефалалгию, эпилепсию, астму, синдром раздраженного кишечника, аутоиммунные прогестероновые дерматиты и стоматиты, а также диабеты.

Рецидив вызывается гормональными изменениями менструального цикла. Основная часть этих эффектов проявляется во время лютеиновой и менструальной фаз цикла. Например, предменструальная астма означает ухудшение симптомов астмы незадолго до и/или во время менструации. Точное документирование симптомов в менструальном календаре позволяет идентифицировать женщин с циклической альтерацией активности заболевания. Женские половые стероидные гормоны играют важную роль, однако, точный механизм их действия пока неизвестен. Существует несколько теорий для объяснения этих эффектов, связанных с менструальным циклом. Они включают флуктуацию уровней половых стероидов, циклические альтерации в иммунной системе, гиперчувствительность дыхательных путей, изменение восприятия тяжести заболевания, обусловленное предменструальными изменениями настроения, что например проявляется в предменструальном синдроме, и аллергические реакции на собственные гормоны, в частности на прогестерон. Рецидив, связанный с менструальным циклом, может усиливаться за счет дополнительного прогестерона [Allison M. Case and Robert L. Reid. Menstrual cycle effects on common medical conditions. Journal Comprehensive Therapy Issue Volume 27, Number 1 /March, 2001; Beynon HL. Severe premenstrual exacerbations of asthma: effect of intramuscular progesterone. Lancet - 13-AUG- 1988; 2(8607): 370-2; Roby, Russell R et al. Sublingual progesterone dilutions as bronchodilator in asthmatic females. World Allergy Organization Journal: November 2007 - Volume - Issue - p S 148].

Глюкокортикоидная нечувствительность часто взаимосвязана с другими факторами, приводящими к частичной или полной рефрактерности к терапии глюкокортикоидами. Эти факторы включают различные риски, отмеченные выше, такие как генетическая чувствительность, патология в гене глюкокортикоидного рецептора, вирусная инфекция или окислительный стресс. Например, известно, что окислительное повреждение ДНК является главной причиной процесса мутации и основной причиной старения, рака и других заболеваний из-за гуанина, являющегося одним из четырех базовых нуклеотидов, которые составляют ДНК и формируют генетический код жизни, который является в частности чувствительным к окислительному повреждению, при этом наибольшее число генетических мутаций связаны с гуанином. Таким образом, в этой области существует проблема снижения вероятности возникновения состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью (например, рефрактерная астма, рефрактерный ревматический артрит, рефрактерная воспалительная болезнь кишечника, хроническая обструктивная болезнь легких и острый респираторный дистресс-синдром), ассоциирующимися с такими факторами риска.

Менструальная цикличность документально подтверждена для рецидивов астмы, что может иметь важное клиническое значение для пациентов с тяжелой астмой. Один из исследователей (Beynon et al., 1988) докладывал о трех случаях тяжелых предменструальных рецидивов астмы, которые лечили терапией внутримышечным прогестероном. Пациенты не реагировали на обычную терапию, включая высокие дозы кортикостероидов. Во всех случаях перед менструацией отмечалось падение максимальной скорости мочеиспускания. Добавление внутримышечного прогестерона (100 мг ежедневно и 600 мг дважды в неделю в тоже время) к схеме приема лекарств устранило предменструальное снижение скорости мочеиспускания, и ежедневные дозы преднизолона были снижены для трех пациентов. Вышеописанное исследование и результаты были опубликованы [Beynon et al. (Severe premenstrual exacerbations of asthma: effect of intramuscular progesterone. Lancet - 13-AUG-l 988; 2(8607): 370-2].

В другом исследовании (Russell R et al., 2007), была проверена гипотеза, что предменструальная астма ассоциируется с аллергической реакцией на собственные гормоны, в частности прогестерон, за счет применени сублингвальных слабых растворов прогестерона в качестве бронхолитического средства. Для исследования были отобраны шестнадцать женщин, имевших предшествующий диагноз тяжелой астмы, которые были зависимыми от введения лекарственных средств распылением. Спирометрические исследования проводили на этих субъектах. Исследования показали через некоторое время изменения объема форсированного выхода за одну секунду (FEV1), форсированной жизненной емкости (FVC) и максимальной скорости выхода (PEF), которые измеряли три раза: (1) до терапии, (2) после терапии сублингвальным изотоническим раствором и (3) после терапии сублингвальным прогестероном. После терапии сублингвальным прогестероном, у двенадцати из шестнадцати пациентов (75%) проявился бронхолитический эффект (увеличение более, чем на 12%) в отношении FEV1 или FVC. Восемь пациентов (50%) продемонстрировали увеличение как FEV1, так и FVC. Восемь пациентов (50%) продемонстрировали увеличение PEF на 27% и более. Вышеописанные исследования и результаты были опубликованы [Sublingual progesterone dilutions as bronchodilator in asthmatic females. World Allergy Organization Journal: November 2007 - Volume - Issue - p S 148].

Активация митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) является критическим событием в митогенной сигнальной трансдукции. Один из исследователей (Ruzycky AL, 1996) определил эффект 17-бета-эстрадиола и прогестерона на экспрессию и активность митоген-активируемой протеинкиназы. Экспрессия и активность MAPK была проверена на гладкой мускулатуре матки крыс, предварительно обработанных только 17-бета-эстрадиолом или 17-бета-эстрадиолом вместе с прогестероном. Экспрессию MAPK определяли иммуноблоттингом, используя антитела внеклеточно-регулируемой киназы erk l/2. Активность MAPK определяли измерением фосфориляции специфической пептидной последовательности MAPK основного белка миелина. Терапия стероидами вызвала небольшое снижение (20%) экспрессии erk 1 и 2 в мембранной и цитозольной фракциях. Как эстроген, так и прогестерон увеличили фосфориляцию тирозина MAPK и мембранную активность MAPK. Терапия стероидами увеличила цитозольную фосфориляцию тирозина MAPK, но не увеличила ферментативную активность. Вышеописанные исследования и результаты были опубликованы [Ruzycky AL. Effects of 17 beta-estradiol and progesterone on mitogen-activated protein kinase expression and activity in rat uterine smooth muscle. Eur J Pharmacol. 1996 Apr 11;300(3):247-54].

Раскрытие изобретения

Определенные варианты настоящего изобретения относятся к способам восстановления кортикостероидной чувствительности или вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности или повышения глюкокортикоидной чувствительности.

Другие варианты настоящего изобретения относятся к способам для назначения фармацевтической композиции, содержащей стероидный гормон, субъекту, который не имел рецидива, связанного с менструальным циклом, и который страдает от одного или более состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью. Состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью включают, например, круг иммуновоспалительных расстройств, лечимых терапией стероидами, когда такая терапия является неэффективной или интолерантной или зависимой или резистентной или рефрактерной к кортикостероидам, и их комбинацию.

В одном варианте, способ по настоящему изобретению включает назначение назначения фармацевтической композиции, содержащей стероидный гормон, субъекту, который не имел рецидива, связанного с менструальным циклом, когда существует риск развития у субъекта глюкокортикоидной нечувствительности в результате окислительного стресса.

Еще одни варианты настоящего изобретения относятся к способам для восстановления кортикостероидной чувствительности или вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности или повышения глюкокортикоидной чувствительности, а также для терапии одного или более состояний, выбираемых из группы, включающей болезни, резистентные к кортикостероидам, рефрактерные к кортикостероидам, кортикостероид-зависимые иммуновоспалительнные расстройства, а также их комбинацию. Некоторые примеры состояний резистентности к кортикостероидам включают, не ограничиваясь этим, следующие: глюкокортикоидная недостаточность при астме, рефрактерный ревматический артрит, рефрактерная воспалительная болезнь кишечника, хроническая обструктивная болезнь легких и острый респираторный дистресс-синдром, интерстициальный фиброз легких и муковисцедоз. Некоторые примеры состояний рефрактерности к кортикостероидам включают, не ограничиваясь этим, следующие: рефрактерный язвенный колит, тяжелая форма болезни Крона у детей, кортикостероид-рефрактерная астма, десквамативная интерстициальная пневмония, невосприимчивая к кортикостероидам, рефрактерная воспалительная миопатия, рефрактерная миастения гравис, рефрактерная вульгарная пузырчатка, ревматический полиартрит, рефрактерный к метотрексату, рефрактерный нефротический синдром, рефрактерный рассеянный склероз, рефрактерная целиакия, саркоидоз, резистентный к стероидам, выпадение слизистой оболочки при рефрактерной вульгарной пузырчатке, рефрактерный синдром Шнитцлера, резистентный дерматит головы и шеи, острый рефрактерный атопический дерматит, рефрактерная идиопатическая тромбоцитопения пурпура, рефрактерный орбитальный миозит, рефрактерная или рецидивная лимфома, больные в критическом состоянии с сепсисом или синдромом острой дыхательной недостаточности (РДСВ) и соответствующей недостаточностью коры надпочечников. Некоторые примеры кортикостероид-зависимых расстройств включают, не ограничиваясь этим, следующие: розацеа, ревматическая полимиалгия, гигантоклеточный артериит, полимиозит, дерматомиозит, болезнь Кавасаки, синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, мультифокальная двигательная нейропатия, синдром мышечной скованности, кортикостероид-зависимая системная красная волчанка, кортикостероид-зависимый рассеянный склероз, симптоматическая кортикостероид-зависимая астма, первичный синдром Сегрена, системный васкулит и полимиозит, трансплантация органов, реакция трансплантат против хозяина и глюкортикостероид-зависимый рак.

Еще одни варианты настоящего изобретения относятся к наборам, включающим (i) фармацевтическую композицию, содержащую стероидный гормон и один или более фармацевтически приемлемый носитель, и (ii) инструкции для назначения фармацевтической композиции субъекту, не имевшему рецидива, связанного с менструальным циклом, и страдающему от одного или более из состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью. Состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью включают, например, круг иммуновоспалительнных расстройств, лечимых терапией стероидами, когда такая терапия является неэффективной или интолерантной или зависимой или резистентной или рефрактерной к кортикостероидам, и их комбинацию.

В другом варианте, наборы по настоящему изобретению включают (i) фармацевтическую композицию, содержащую стероидный гормон и один или более фармацевтически приемлемый носитель, и (ii) инструкции для назначения фармацевтической композиции субъекту, когда существует высокий риск развития глюкокортикоидной нечувствительности у субъекта, который предпочтительно не имел рецидива, связанного с менструальным циклом, и, особенно, в случае риск развития одного или более состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью, в результате окислительного стресса.

В еще одних других вариантах настоящего изобретения, наборы включают (i) фармацевтическую композицию, содержащую стероидный гормон и один или более фармацевтически приемлемый носитель, и (ii) инструкции для назначения фармацевтической композиции субъекту, который предпочтительно не имел рецидива, связанного с менструальным циклом, где субъект страдает от одного или более из состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью, для достижения стероидсберегающего эффекта у пациентов с кортикостероидной зависимостью, лучшей восприимчивости или толерантности к кортикостероидам, достижения эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида, профилактики индивидуума от риска развития резистентности или сопротивляемости или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители, достижение оптимальных иммунных функций, более легкого уменьшения приема или прекращения приема или продолжения приема кортикостероидов субъектом или пациентом, для снижение риска развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз, и их сочетания.

Здесь должно быть понятно, что варианты, описанные выше, представлены в качестве характерных вариантов настоящего изобретения, и они не предназначены для ограничения объема правовой охраны настоящего изобретения.

Краткое описание фигур чертежей

На фиг. 1-12 представлены графические материалы, демонстрирующие результаты нескольких примеров некоторых вариантов осуществления этого изобретения, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.

Фиг. 1 - график уровней IL-2 от исходного уровня, после стимуляции PHA и ингибирования IL-2 дексаметазоном в зависимости от дозы.

Фиг. 2 - иллюстрация индуцирования стероидной резистентности при увеличении IL-2 и IL-4.

Фиг. 3 - иллюстрация эффектов прогестогена (максимальный процент ингибирования %Imax) в обратном развитии стероидной резистентности: сравнение 17HPC, P4 и MPA при малой дозе дексаметазона (обозначен «Dex») (10^-10 моль).

Фиг. 4 - иллюстрация эффектов прогестогена (%Imax) в обратном развитии стероидной резистентности: сравнение 17HPC, P4 и MPA при высокой дозе дексаметазона (обозначен «Dex») (10^-6 моль).

Фиг. 5 - иллюстрация восстановления кортикостероидной восприимчивости от 17HPC.

Фиг. 6 - иллюстрация обратного развития стероидной резистентности и индивидуального характера восприимчивости при обработке 17HPC.

Результаты, представленные на фиг. 7, демонстрируют, что девять из одиннадцати субъектов имели более чем 10%-ое улучшение в максимальном ингибировании дексаметазоном после приема дозы 17HPC, что согласуется с результатами, представленными на фиг. 6.

Результаты, представленные на фиг. 8, демонстрируют, что шесть из восьми субъектов имели более чем 10%-ое улучшение в максимальном ингибировании дексаметазоном после приема дозы природного прогестерона, который является подобным 17HPC.

Результаты, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что обработка MPA ведет к общему отличному характеру восприимчивости: «раздробленная» восприимчивость. Одна подгруппа имела значительно улучшение, вплоть до 58%, в то время, как другая подгруппа продемонстрировала ухудшение кортикостероидной восприимчивости с ее снижением вплоть до 88%.

Эффект 17HPC на восприимчивость дексаметазона, оцененный ингибированием IL-2, у курильщиков представлен в таблице 1 и на фиг. 10. Фиг. 10 показывает дополнительный эффект 17HPC в улучшении стероидной восприимчивости.

Максимальным противовоспалительным эффектом дексаметазона является 78%-ое ингибирование продуцирования PHA, индуцированного IL-2, при 10^-6 моль (M). Дополнительная обработка 17HPC ведет к значительно лучшей восприимчивости с результатом около 100% супрессии IL-2, индуцированного PHA (фиг. 11). Фиг. 11 тем самым представляет более лучшие результаты терапии за счет ее дополнения 17HPC.

Комбинация 17HPC с дексаметазоном неизменно повышает противовоспалительный эффект дексаметазона, который является более высоким, чем при его отдельном применении. Фиг. 12 демонстрирует, что такая комбинация приводит к синергетическому эффекту с 25-31%-ым увеличением эффективности дексаметазона. Тем самым фиг. 12 демонстрирует синергетический эффект комбинации 17HPC с дексаметазоном.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Здесь описываются предпочтительные способы, композиции и наборы по настоящему изобретению, которые предназначены для восстановления кортикостероидной чувствительности, повышения глюкокортикоидной чувствительности или вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности субъекта, демонстрирующего кортикостероидную зависимость или кортикоидную невосприимчивость или иммунологическую толерантность или интолерантность к кортикостероидам. Состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью включают, например, круг иммуновоспалительнных расстройств/болезней, лечимых терапией стероидами, когда такая терапия не в состоянии достигнуть контроля над болезнью или является неэффективной или интолерантной или зависимой или резистентной к кортикостероидам, и их комбинацию. В частности, способы, композиции и наборы по настоящему изобретению являются эффективными для достижения глюкокортикоид-сенсибилизирующих эффектов, таких как стероидсберегающий эффект у пациентов с кортикостероидной зависимостью, лучшая восприимчивость или толерантность к кортикостероидам, достижение эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида, профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители, достижение оптимальных иммунных функций, более легкой реакции при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов, сниженные риски развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз, и их сочетание. В частности, состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью, включают различные состояния/расстройства, ассоциирующихся и/или относящиеся к глюкокортикоидной резистентности, глюкокортикоид-рефрактерным реакциям, кортикостероидной зависимости или интолерантности к кортикостероидам. Главным фактором риска в развитии глюкокортикоидной нечувствительности является окислительный стресс.

Несмотря на серьезные последствия глюкокортикоидной нечувствительности, до сих пор имелся ограниченный успех в части терапии субъектов, страдающих от различных состояний/расстройств, ассоциирующихся и/или относящихся к глюкокортикоидной резистентности, глюкокортикоид-рефрактерным реакциям, кортикостероидной зависимости или интолерантности к кортикостероидам. Ингибиторы кальциневрина и метотрексат могут оказать пользу только при нескольких выборочных состояниях, но они являются неэффективными для большинства состояний, относящихся к глюкокортикоидной нечувствительности. Более того, их применение ассоциируется с их широкой рекламой. Значительная токсичность и побочные эффекты воспрепятствовали продвижению программ разработки таких лекарственных препаратов как ингибиторы MAP-киназы p38, селективные ингибиторы для блокирования киназы NFKB и ингибиторы фосфодиэстеразы-4. Основная доля расстройств, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью, не имеют каких-либо связей с менструальным циклом, и наибольшее число субъектов, страдающих от расстройств, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью, не демонстрируют рецидивов, относящихся к менструальному циклу, включая аллергическую реакцию на прогестерон. Преимущественно, в соответствии с настоящим изобретением, полагается, что раскрытые здесь способы значительно восстанавливают кортикостероидную чувствительность у субъекта, который предпочтительно не имел рецидива, связанного с менструальным циклом. Терапия и способы по настоящему изобретению были открыты неожиданно для целей вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности и/или повышения глюкокортикоидной чувствительности субъекта, страдающего от по крайней мере одного из состояний/расстройств ассоциирующихся и/или связанных с глюкокортикоидной резистентностью, глюкокортикоид-рефрактерными реакциями, кортикостероидной зависимостью или интолерантностью к кортикостероидам. Таким образом, способы по настоящему изобретению являются применимыми для достижения глюкокортикоид-сенсибилизирующих эффектов, таких как стероидсберегающий эффект у пациентов с кортикостероидной зависимостью, лучшая восприимчивость или толерантность к кортикостероидам, достижение эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида, профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители, достижение оптимальных иммунных функций, более легкой реакции при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов, сниженные риски развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз. Предпочтительно, когда способы по настоящему изобретению используются для подавления эффекта по крайней мере одного фактора риска или основного механизма, ассоциирующегося с глюкокортикоидной нечувствительностью. Таким образом, различные варианты настоящего изобретения относятся к способам для вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности субъекта, предпочтительно не имевшему рецидива, связанного с менструальным циклом, и который страдает от одного или более состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью. В этих и в различных других вариантах, субъект, которому назначается терапия, может быть мужского или женского пола и иметь любой возраст. Различные другие варианты направлены на терапию субъектов, которые либо впервые, либо повторно испытывают приступ болезни в состоянии без рецидива, связанного с менструальным циклом.

Хотя прогестерон имеет противовоспалительные свойства, испытания прогестерона для терапии воспалительных заболеваний типа ревматического артрита, главным образом, не продемонстрировали эффективной и воспроизводимой методики для контроля симптомов и лучшего клинического исхода. Субъекты, демонстрирующие глюкокортикоидную резистентность или рефрактерность, являются подгруппой популяции больных, более точно определенной, как субпопуляция «трудно поддающаяся лечению». Например, 20-30% пациентов с тяжелой формой болезни Крона, резистентной к стероидам, не воспринимают терапию стероидами. Одной из главных целей настоящего изобретения является использование прогестерона для терапии глюкокортикоид-резистентных и рефрактерных состояний, с проявлением стероидсберегающего эффекта у пациентов с кортикостероидной зависимостью, лучшей восприимчивости или толерантности к кортикостероидам, достижения эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида, профилактики индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители, достижения оптимальных иммунных функций, более легкой реакции при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов, снижения рисков развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз, и их сочетания. Далее, активация митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) является критическим событием, приводящим к кортикостероидной нечувствительности. Уже сообщалось, что прогестоген повышает активность MAPK [Ruzycky AL. Effects of 17 beta-estradiol and progesterone on mitogen-activated protein kinase expression and activity in rat uterine smooth muscle. Eur J Pharmacol. 1996 Apr 11;300(3):247-54]. Без какой-либо связи с частной теорией, в последнее время предполагалось, что специалист в данной области должен ожидать, что активация MAPK индуцирует дефект транслокации и функции глюкокортикоидного рецептора (ГР), приводящий к развитию состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью. Повторяясь, без какой-либо связи с частной теорией, в последнее время также предполагалось, что специалист в данной области должен ожидать, что увеличение MAPK за счет прогестерона должно усугубить глюкокортикоидную нечувствительность. Однако, в соответствии с настоящим изобретением, неожиданно и непредсказуемо было обнаружено, что молекулярные эффекты увеличения MAPK прогестероном не приносят вреда эффективности прогестерона при терапии глюкокортикоид-резистентного или рефрактерного состояния.

Далее, неожиданно и непредсказуемо было обнаружено, что назначение прогестерона типа 17-α-гидроксипрогестерон капроата (17HPC) субъекту с состоянием глюкокортикоидной резистентности или рефрактерности или кортикостероидной зависимости достигает глюкокортикоид-сенсибилизирующий эффект в виде стероидсберегающего эффекта. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, теперь полагается, что назначение прогестерона (например, 17HPC) может значительно восстановить кортикостероидную чувствительность, улучшить глюкокортикоидную чувствительность и/или вызвать обратное развитие глюкокортикоидной нечувствительности.

По сравнению с применением прогестерона для целей оказания им противовоспалительного эффекта, настоящее открытие неожиданно выявило новую функцию прогестерона и сферу его применения, а именно обратное развитие кортикостероидной чувствительности, а также ясно идентифицировало хорошо определенную популяцию, которой такая терапия принесет пользу, т.е. пациентов, демонстрирующих кортикостероидную резистентность, кортикостероидную зависимость, кортикостероид-рефрактерные реакции и/или кортикостероидную интолерантность. Поскольку большая часть состояний, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью, проявляется у субъектов, которые не имели рецидива, связанного с менструальным циклом, настоящее открытие является значительным вкладом в этой области.

Определения

Как было отмечено, глюкокортикоиды остаются терапией первого ряда для лечения ряда иммунных/воспалительных и аллергических болезней. Однако, 30% пациентов оказываются неспособными к контролю заболевания при приемлемых системных дозах и продолжают демонстрировать повышенный иммунный ответ с неблагоприятным клиническим исходом. Глюкокортикоидная нечувствительность является важным фактором в патогенезе и прогнозировании множества заболеваний. Она представляет собой большие терапевтические проблемы для терапии и требует значительных расходов на медицинские услуги. В том понимании, как здесь используется, термин «глюкокортикоидная нечувствительность» предназначено для определения, включающего в себя, но не ограниченного этим, кортикостероидную резистентность, кортикостероидную зависимость, кортикостероид-рефрактерные реакции, кортикостероидную интолерантность и другие типы кортикостероидной недейственности. Она распознается, когда несколько различных молекулярных механизмов способствуют снижению противовоспалительного эффекта глюкокортикоидов. Различные воспалительные заболевания могут иметь похожие молекулярные механизмы, а одна отдельная болезнь может иметь гетерогенность механизмов.

Кортикостероидная резистентность к противовоспалительному эффекту кортикостероидов определена как отсутствие клинической положительной динамики после терапии высокой дозой глюкокортикоида.

Кортикостероидная зависимость определена как состояние, при котором имеется первоначальная реакция на кортикостероиды, но которая быстро приводит к рецидиву после прекращения приема препарата или уменьшения дозы.

Кортикостероид-рефрактерная реакция определена как состояние, при котором отсутствует ответ на адекватную вводимую дозу кортикостероидов. Это состояние включает частично или полностью рефрактерные ответы на терапию глюкокортикостероидами и часто требует контроля дополнительной терапией.

Другие типы кортикостероидной недейственности включают необходимость использования очень высокой дозы при терапии, случаи «трудно поддающийся терапии», «отсутствие удовлетворительного ответа» и тяжелые случаи, а также ухудшение восприимчивости in vitro и in vivo.

Кортикостероидная интолерантность определена как токсический эффект терапии и/или риск развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз.

Глюкокортикоидный сенсибилизатор определен как фармацевтическая лекарственная форма или препарат, который обладает функцией восстановления кортикостероидной чувствительности, повышения глюкокортикоидной чувствительности или вызывания обратного развития глюкокортикоидной нечувствительности, а также для защиты от потери глюкокортикоидной чувствительности, и используется для лечения, профилактики или улучшения одного или более симптомов болезней или расстройств, связанных с глюкокортикоидной нечувствительностью (например, кортикостероидная зависимость или кортикостероидная резистентность или невосприимчивость или интолерантность к кортикостероидам). Терапевтические эффекты применения глюкокортикоидного сенсибилизатора включают любые из следующих, но не ограничиваются ими: стероидсберегающий эффект у пациентов с кортикостероидной зависимостью; лучшая восприимчивость или толерантность к кортикостероидам; достижение эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида; профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители; достижение оптимальных иммунных функций; более легкая реакция при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов; снижение риска развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции, остеопороз, патологический перелом, диабеты, катаракта; и их сочетание.

В том смысле, как здесь используется, термин «лечение» или «терапия» охватывает ответные и профилактический меры, как вместе, так и по отдельности, например, предназначенные для ингибирования или задержки развития или начала болезни, достижения полного или частичного ослабления симптомов или улучшения болезненного состояния и/или для облегчения, улучшения, уменьшения или лечения болезни или расстройства и/или их симптомов. Терапия также охватывает любое фармацевтическое применение композиции по настоящему изобретению, такое как применение для терапии болезни, расстройства или состояния, связанного с глюкокортикоидной нечувствительностью. Улучшение симптомов отдельного расстройства назначением определенного соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению относится к любому уменьшению, к постоянному или временному, длящемуся или кратковременному, которое может относиться или ассоциироваться с назначением композиции.

Субъект здесь определен как животное, главным образом млекопитающее, включая человека. Как здесь используется, термин «пациент» включает в себя субъектов, таких человек и животное.

На практике, в способах по настоящему изобретению эффективные количества соединений прогестерона или композиций, содержащих терапевтически эффективную концентрацию этих соединений в виде лекарственной формы для системной доставки, включая парентеральное, оральное, внутривенное или пульмональное введение или местную аппликацию или местное нанесение, могут использоваться для терапии болезней, расстройств или состояний, относящихся к глюкокортикоидной нечувствительности, которые включают, не ограничиваясь этим: состояния резистентности к кортикостероидам (например, глюкокортикоидная недостаточность при астме, рефрактерный ревматический артрит, рефрактерная воспалительная болезнь кишечника, хроническая обструктивная болезнь легких и острый респираторный дистресс-синдром, интерстициальный фиброз легких и муковисцедоз); состояния глюкокортикоидной рефрактерности (например, рефрактерный язвенный колит, тяжелая форма болезни Крона у детей, кортикостероид-рефрактерная астма, десквамативная интерстициальная пневмония, невосприимчивая к кортикостероидам, рефрактерная воспалительная миопатия, рефрактерная миастения гравис, рефрактерная вульгарная пузырчатка, ревматический полиартрит, рефрактерный к метотрексату, рефрактерный нефротический синдром, рефрактерный рассеянный склероз, рефрактерная целиакия, саркоидоз, резистентный к стероидам, выпадение слизистой оболочки при рефрактерной вульгарной пузырчатке, рефрактерный синдром Шнитцлера, резистентный дерматит головы и шеи, острый рефрактерный атопический дерматит, рефрактерная идиопатическая тромбоцитопения пурпура, рефрактерный орбитальный миозит, рефрактерная или рецидивная лимфома, больные в критическом состоянии с сепсисом или синдромом острой дыхательной недостаточности (РДСВ) и соответствующей недостаточностью коры надпочечников); состояния глюкокортикостероидной зависимости (например, розацеа, ревматическая полимиалгия, гигантоклеточный артериит, полимиозит, дерматомиозит, болезнь Кавасаки, синдром Гийена-Барре, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, мультифокальная двигательная нейропатия, синдром мышечной скованности, кортикостероид-зависимая системная красная волчанка, кортикостероид-зависимый рассеянный склероз, симптоматическая кортикостероид-зависимая астма, первичный синдром Сегрена, системный васкулит, полимиозит, трансплантация органов и реакция трансплантат против хозяина); и другие воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, гиперпролиферативные заболевания, и другие подобные заболевания, которые связаны с глюкокортикоидной нечувствительностью. Примерами этих заболевания являются волчанка, остеоартрит, риносинусит, узелковый периартериит, гранулематоз Вегенера, краниальный артериит, аллергический ринит, крапивница, наследственная аллергия, тендинит, бурсит, аутоиммунный хронический активный гепатит, цирроз, отторжение трансплантата, псориаз, дерматит, злокачественные образования (например, лейкемия, миелома, лимфома), острая недостаточность коры надпочечников, ревматическая лихорадка, гранлематозная болезнь, иммунная пролиферация/апоптоз, супрессия и регуляция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) системы, гиперкортизолемия, модуляция баланса цитокинов Thl/Th2, хроническая почечная болезнь, повреждение спинного мозга, отек мозга, тромбоцитопения, синдром Литтла, Аддисонова болезнь, аутоиммунная гемолитическая анемия, увеит, вульгарная пузырчатка, носовые полипы, сепсис, инфекции (например, бактериальный, вирусные, риккетсиозные и паразитарные инфекции), диабет 2 типа, ожирение, метаболический синдром, депрессия, шизофрения, аффективное расстройство, синдром Кушинга, тревожный невроз, расстройства сна, активация обучения и памяти, или глюкокортикоидная глаукома, атопическая аллергия, реакции лекарственной непереносимости, сывороточная болезнь, буллезный герпетиформный дерматит, контактный дерматит, эксфолиативная эритродермия, фунгоидная гранулема, пузырчатка, подострый тиреоидит, симпатическая офтальмия, увеит и воспалительные состояния глаз, невосприимчивые к топическим стероидам, аллергический бронхолегочный аспергиллез, прогрессирующий или диссеминированный туберкулез легких при использовании совместно с адекватной химиотерапией, гиперчувствительный пневмонит, идиопатический облитерирующий бронхиолит, осложненный пневмосклерозом, идиопатическая эозинофильная пневмония, идиопатический фиброз легких, плазмоклеточная пневмония (PCP), сопровождающаяся пониженной кислотностью в случае пациента с ВИЧ (+), который проходит терапию адекватными антибиотиками против ВИЧ, диурез или ремиссия протеинурии при нефротическом синдроме, не осложненном уремией идиопатического типа или являющегося следствием красной волчанки, анкилозирующий спондилоартрит, ревматическая полимиалгия, псориатический артрит, рецидивирующий полихондрит, трихинеллез с неврологическими или миокардиальными осложнениями и туберкулезный менингит.

Главным образом, в соответствии с настоящим изобретением, описанные в нем способы для терапии болезней, расстройств или состояний, относящихся к глюкокортикоидной нечувствительности, включают назначение фармацевтической композиции, включающей стероидный гормон. Как правило, таким липофильным гонадным стероидным гормоном является прогестоген. Прогестоген может быть прогестогеном природного происхождения или синтетическим прогестогеном (например, прогестин). Прогестогены, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, сгруппированы в следующие категории: прогестерон, ретропрогестерон, производные прогестерона, производные 17-α-гидроксипрогестерона (как предшественники, так и гонаны), производные 19-норпрогестерона, производные 19-нортестостерона (как предшественники, так и гонаны) и производные спиронолактона. В основном, прогестоген для применения в соответствии с настоящим изобретением, выбирается из группы, включающей прогестероны и их производные или активные метаболиты. Частные примеры прогестогенов, которые могут применяться в способах и наборах по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь этим, следующие: 17HPC (гидроксипрогестерон капроат), природный прогестерон, дидрогестерон, медрогистерон, медроксипрогестерон, мегестрол, хлормадинон, ципротерон, гестонорон капроат, номегестрол ацетат, демегестон, промегестон, несторон, тримегестон, норэтистерон, линестренол, этинодиол диацетат, норгестрел, левоноргестрел, дезогестрел, этоногестрел (3-кето-дезогестрел), гестоден, норгестимат, норэлгестромин (17-деацетил норгестимат), диеногест, дроспиренон, норэтистерон, норэтинодрел, норгестрел, дезогестрел, этоногестрел, 19-нортестостерон, диеногест, норэтинодрел, ципротерон, тиболон, 19-норпрогестерон и дроспиренон. Каждый прогестоген может быть в виде производных в виде соответствующих солей, сложных эфиров, энольных или простых эфиров, кислот, оснований, сольватов, гидратов или пролекарств для лекарственных форм, как приведено ниже.

Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются этим: соли амина, такие как, и не ограниченные этим, хлорпрокаин, холин, аммиачную соль, диэтаноламин и другие гидроксиалкиламины, этилендиамин, N-метилглюкамин, прокаин, диэтиламин и другие алкиламины, пиперазин и трис(гидроксиметил)аминометан; соли щелочных металлов, таких как, и не ограниченные этим, литий, калий и натрий; соли щелочноземельных металлов, таких как, и не ограниченные этим, барий, кальций и магний; соли переходных металлов, таких как, и не ограниченные этим, цинк и алюминий; и другие соли металлов, такие как, и не ограниченные этим, вторичный кислый фосфат натрия и динатрий фосфат; а также включают, но не ограничиваются этим, соли минеральных кислот, такие как, и не ограниченные этим, гидрохлориды и сульфаты; и соли органических кислот, такие как, и не ограниченные этим, ацетаты, лактаты, малаты, тартраты, цитраты, аскорбаты, сукцинаты, бутираты, валераты и фумараты. Например, ацетаты, как соль органической кислоты, часто используются в виде мегестрол ацетата, хлормадинон ацетата, ципротерон ацетата, гестонорон ацетата, номегестрол ацетат и ципротерон ацетата.

Другие показательные препараты, которые могут использоваться в соответствии со способами и в наборах по настоящему изобретению, включают, например, активные метаболиты прогестогена включают, но не ограничиваются этим, метаболиты 17-α-гидроксипрогестерона, природного прогестерона, дидрогестерона, медрогестерона, медроксипрогестерона, мегестрол ацетата, хлормадинон ацетата, ципротерон ацетата, гестонорон капроата, номегестрол ацетата, демегестона, промегестона, несторона, тримегестона, норэтистерон ацетата, норэтистерона, линестренола, этинодиол диацетата, норгестрела, левоноргестрела, дезогестрела, этоногестрела (3-кето-дезогестрела), гестодена, норгестимата, норэлгестромина (17-деацетил норгестимата), диеногеста, дроспиренона, норэтинодрела, норгестрела, дезогестрела, этоногестрела, 19-нортестостерона, диеногеста, норэтинодрела, ципротерон ацетата, тиболона, 19-норпрогестерона и дроспиренона. Например, активные метаболиты прогестерона включают аллопрегнанолон и 5α-прегнан-3,20-дион в качестве активного метаболита. Активные метаболиты 17HPC включают M13, моногидрокси-; M12, моногидрокси-; M19, моногидрокси-; M7, дигидрокси-; и M16, моногидрокси-.

В различных вариантах, другую группу стероидных гормонов, глюкокортикоидов, для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбирать из группы, включающей стероидные гормоны, продуцированные естественным образом, или синтетические соединения, которые ингибируют воспалительный процесс. Частные примеры глюкокортикоидов включают, но не ограничиваются этим, гидрокортизон (кортизол), кортизон ацетат, дексаметазон (на чертежах обозначен, как ”Dex”), преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, триамцинолон, беклометазон, параметазон, флутиказон, флудрокортизон ацетат, дезоксикортикостерон-ацетат (DOCA), флупреднизолон, флутиказон пропионат, будесонид, беклометазон дипропионат, флунизолид и триамцинолон ацетонид.

На практике, при осуществлении способов по настоящему изобретению, эффективные количества соединений или композиций, содержащих терапевтически эффективные концентрации этих соединений, предпочтительно готовят в виде лекарственной формы для системной доставки, включая парентеральное, оральное или внутривенное введение, или для местной аппликации или местного нанесения. Например, фармацевтическая композиция может быть назначена для введения подкожной, внутривенной, внутрибрюшной, внутриартериальной и внутримышечной инъекцией; ректально; трансдермальным введением, интравагинальным введением; или трансбуккально; или оральным введением. При введении подкожной или внутримышечной инъекцией, стероидный гормон можно приготовить в виде лекарственной формы с замедленным всасыванием в течение продолжительного времени. При местном введении, включая интравагинальное введение, такое введение может осуществляя в виде, например, раствора, суспензии, эмульсии и т.п., и может осуществляться лекарственными формами и средствами в виде кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, примочек, суспензий, настоев, паст, пен, аэрозолей, инфузий, спрей-аэрозолей, суппозиториев, суспензориев, пластырей или любых других форм, соответствующих способу применения. Когда в качестве способа применения используется ингаляция, введение может осуществляться, например, с помощью спрей-аэрозоли или порошка в аэрозольном баллоне или небулайзере или ингаляторе.

Что касается кратности введения, то может использоваться любая кратность введения, с помощью которой достигается желаемый результат (стероидсберегающий эффект у пациентов с кортикостероидной зависимостью, лучшая восприимчивость или толерантность к кортикостероидам, достижение эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида, профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители, достижение оптимальных иммунных функций, более легкой реакции при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов, сниженные риски развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции и остеопороз, и их сочетание). Кратность введения предпочтительно определять, по крайней мере в части, в зависимости от выбранного стероидного гормона (гормонам) и/или лекарственной формы. В различных вариантах осуществления, фармацевтическую композицию назначают для ежедневного или еженедельного приема или с большим интервалом. Например, фармацевтическая композиция может быть назначена один раз каждую неделю, один раз в месяц, один раз в два месяца или один раз в три месяца. В различных вариантах осуществления, фармацевтическая композиция может быть назначена один раз в неделю или менее одного раза в неделю (например, ежедневно или через день). Например, когда стероидным гормоном является 17-α-гидроксипрогестерон капроат (17HPC), инъекции могут назначаться ежедневно, один раз в неделю или два раза в неделю, или один раз в месяц или один раз в три месяца. Специалисты в этой области поймут, что кратность введения фармацевтической композиции, используемой в способах и наборах по настоящему изобретению, будет зависеть от различных факторов, включая, например, конкретный применяемый стероидный гормон (гормоны), лекарственную форму для введения, ткань, подвергающуюся терапии, возраст и пол индивидуума, лабораторные данные in vivo или in vitro и профессиональное суждение конкретных нужд пациента. Периоды кратности введения приведены здесь только в качестве примеров, которые не предназначены для ограничения правовой охраны или применения на практике приведенных здесь лекарственных форм.

Специалисты в этой области также поймут, что подходящая дозировка стероидного гормона будет зависеть от выбранного стероидного гормона (гормонов), метода введения и лекарственной формы, кратности введения, заболевания, терапия которого проводится, метаболической стабильности и продолжительности действия соединения, видов, возраста, веса тела, общего состояния здоровья и режима питания субъекта, уровня экскреции, комбинации используемых лекарственных средств и степени тяжести конкретного состояния. Эффективное количество стероидного гормона в фармацевтической композиции может быть определено специалистом в этой области и включает, в качестве примера, размер дозировки для млекопитающих от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг веса тела активного соединения для ежедневного орального приема. Например, для достижения эндометрического и противогонадотропного эффектов (т.е. доза для ингибирования овуляции), требуется доза 0,15 мг/день левоноргестрела или дезогестрела перорально, хотя требуемая доза может быть и выше, или 5-10 мг/день медроксипрогестерон ацетата или 200-300 мг/день прогестерона.

Специалисты в этой области также поймут, что подходящая дозировка стероидного гормона будет зависеть от пола, т.к. прогестерон является половым гормоном. Прогестерон главным образом секретируется гранулезными клетками и желтым телом в яичнике. Во время беременности, основным источником прогестерона является плацента. У мужчин прогестерон продуцируется в надпочечниках и яичках, поскольку он является предшественником тестостерона. У женщин, уровни прогестерона являются относительно низкими во время предовуляторной фазы менструального цикла, возрастают после овуляции и снижаются во время лютеиновой фазы. Уровень прогестерона обычно составляет менее 2 нг/мл до овуляции и более 5 нг/мл после овуляции. В начале беременности уровни прогестерона сначала остаются, как уровни лютеиновой фазы. С наступлением лютеально-плацентарного сдвига в поддержке беременности прогестероном, уровни начинают расти и могут достичь 100-200 нг/мл в определенный период. Для сравнения, уровень прогестерона у взрослых мужчин обычно составляет 0,13-0,97 нг/мл. У взрослых мужчин уровни подобны уровням у женщин во время фолликулярной фазы менструального цикла, как и у женщин в постклимактерический период. Известно, что женщины испытывают 17-кратное изменение концентрации прогестерона в сыворотке во время менструального цикла или более чем 100-кратное изменение во время беременности. Т.о. толернтность или максимальная доза или минимальная эффективная доза прогестогена должна быть выше у женщин, чем у мужчин. Например, когда стероидным гормоном является 17-α-гидроксипрогестерон капроат (17HPC), обычной используемой дозой является 150-500 мг в виде еженедельных инъекций для женщин с соответствующими показаниями. Предполагается, что некоторые приведенные важные эффекты прогестерона по восстановлению кортикостероидной чувствительности достигаются негеномным путем с помощью различных молекулярно-биологических моделей действия (т.е. функции, которые не относятся к гестагенной активности), что может привести к фармакодинамической вариабельности. Для мужчин можно выбирать значительно большую или меньшую дозу прогестерона (т.е. 17HPC), так же как и различный уровень доз. Интервалы значений дозировки приведенные здесь в качестве примеров и не предназначены для ограничения правовой охраны или применения на практике описанных здесь лекарственных препаратов.

Предпочтительно, когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит: (i) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество или их комбинация; и (ii) один или более из описанных здесь стероидных гормонов. Композиции могут быть в виде лекарственных форм с однократной или многократной дозировкой. Могут быть приготовлены лекарственные формы или композиции, содержащие стероидный гормон (гормоны) в пределах 0,005-100%, не нарушающих физиологический баланс, с нетоксичным носителем. Например, фармацевтическая композиция может содержать один разбавитель или более, один носитель или более, одно связывающее вещество или более, одно покрытие или более, один лубрикант или более, один растворитель или более, один буфер или более, один консервант или более, один ароматизатор или более, один краситель или более, и/или один усиливающий агент абсорбции или более, и/или один биоразлагаемый полимер или более. Включение в фармацевтическую композицию определенных вспомогательных веществ будет зависеть от выбранного стероидного гормона (гормонов) и выбранной лекарственной формы. Например, для орального приема, фармацевтически приемлемая нетоксичная композиция может быть приготовлена за счет объединения любых обычно используемых вспомогательных веществ, таких как, например, фармацевтические категории маннитола, лактозы, крахмала, стеарата магния, талька, производных целлюлозы, натрия кроскармеллоза, глюкозы, сахарозы, карбоната магния или сахарината натрия. Предпочтительно, когда такие композиции приготовлены как растворы, суспензии, таблетки, капсулы, порошки и составы с замедленным высвобождением, такие как, но не ограничиваясь этим, имплантированные и микроинкапсулированные системы доставки, а также биоразлагаемые биологически совместимые полимеры типа коллагена, этиленвинилацетата, полиангидридов, полигликолиевой кислоты, полиортоэфира, полимолочной кислоты и других подобных полимеров. В качестве других примеров, здесь могут использоваться обычные лекарственные формы для инъекций в виде жидких растворов или суспензий, твердые формы, находящиеся в твердой форме до инъекции и подходящие для использования в растворах или суспензиях, или в виде эмульсий. Здесь подходящие вспомогательные вещества включают, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, маннитол, 1,3-бутандиол, раствор Рингера, изотонический раствор хлористого натрия или этанол. В качестве еще одних примеров, суспензии для инъекций могут быть приготовлены с использованием подходящих жидких носителей, суспендирующих средств и т.п. Некоторые фармацевтические композиции могут присутствовать как в форме разовой дозы, например в ампулах, или в многодозных контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции, являющиеся суспензиями, растворами или эмульсиями, могут содержать вспомогательные вещества типа суспендирующих, стабилизирующих и/или диспергирующих агентов. Некоторые растворители, подходящие для использования в фармацевтических композициях для инъекций, включают, но не ограничиваясь этим, липофильные растворители и жирные масла типа кунжутного масла, синтетические сложные эфиры жирной кислоты типа этилолеата или триглицеридов, и липосомы.

В дополнение к назначению гормона прогестогенового ряда, способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать назначение одной или более из терапий, также нацеленных на терапию болезней, расстройств или состояний, относящихся к глюкокортикоидной нечувствительности, которые были приведены выше. Одна терапия или более могут быть выбраны, например, из группы, включающей терапии с помощью следующих средств: глюкокортикоид (например, гидрокортизон, кортизон ацетат, дексаметазон, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, бетаметазон, триамцинолон, беклометазон, параметазон, флутиказон, флудрокортизон ацетат, дезоксикортикостерон-ацетат, флупреднизолон, флутиказон пропионат, будесонид, беклометазон дипропионат, флунизолид и триамцинолон ацетонид), андроген (например, дегидроэпиандростерон (ДЭА)), эстрогеном (например, эстрадиол), иммунодепрессивными или иммуномодулирующими средствами (например, циклоспорин, метотрексат, золото, 6-меркаптопурин, биологические препараты типа инфликсимаба, этанерцепта и адалимумаба, внутривенный иммуноглобулина и меполизумаба), ингибиторы кальциневрина (например, циклоспорин, такролимус), ингибиторы MAP-киназы p38, ингибиторы c-Jun-N-терминальной киназы (для повышения АФИ), витамин D, ингибиторы фактора торможения миграции, активаторы гистон деацетилата-2, теофиллин, ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы-5, лейкотриеновые модификаторы, бета-агонисты длительного действия, антиоксиданты, ингибиторы индуцибельной NO-синтетазы, ингибиторы p-гликопротеина, и их комбинация. Вышеупомянутые другие фармацевтические средства, при их совместном назначении с препаратами по настоящему изобретению, могут применяться, например, в количествах, указанных в Настольном справочнике врача (PDR) или, иначе, в количествах, определяемых обычным специалистом в этой области. Количество препарата, применяемого введением, отличного от орального, предпочтительно определять на базе соответствующего оральной дозе уровня концентрации в сыворотке или по количеству активного соединения, которое является эффективным для снижения симптомов у субъекта, подвергающегося терапии. В описанных здесь способах, такие другие фармацевтические средства могут быть назначены до назначения, вместе с назначением или после назначения соединений по настоящему изобретению. Терапевтические эффекты применения глюкокортикоидного сенсибилизатора включают любые из следующих, но не ограничиваются ими: стероидсберегающий эффект вышеприведенных препаратов сопутствующей терапии; лучшая восприимчивость или толерантность к вышеприведенным препаратам сопутствующей терапии; достижение эффекта при использовании меньшей дозы вышеприведенных препаратов сопутствующей терапии; профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на вышеприведенные препараты сопутствующей терапии; достижение оптимальных иммунных функций; более легкая реакция при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема вышеприведенных препаратов сопутствующей терапии; снижение риска развития побочных реакций, связанных с вышеприведенными препаратами сопутствующей терапии; и их сочетание.

Примеры 1 и 2 демонстрируют установление моделей исследования для оценки стероидной восприимчивости и стероидной резистентности, т.е. PHA-индуцированного продуцирования IL-2 и стероидной резистентности, индуцированной IL-2/4, в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), взятой у здоровых курящих мужчин.

Примеры 3, 4 и 5 демонстрируют, что прогестерон вызывает обратное развитие кортикостероидной резистентности и улучшает кортикостероидную восприимчивость при состоянии стероидной резистентности (т.е., индуцированного IL-2/4).

Примеры 6, 7 и 8 демонстрируют, что прогестерон улучшает кортикостероидную восприимчивость при состоянии нестероидной резистентности (т.е., PHA-индуцированное продуцирование IL-2 без увеличения IL-2/4).

Неожиданно было открыто, что эффекты глюкокортикоидного сенсибилизатора по настоящему изобретению, включают любые из следующих, но не ограничиваются ими: стероидсберегающий эффект у пациентов с кортикостероидной зависимостью; лучшая восприимчивость или толерантность к кортикостероидам; достижение эффекта при использовании меньшей дозы кортикостероида; профилактика индивидуума от риска развития рефрактерной реакции на кортикостероиды или резистентности или рецидивов в ответ на сенсибилизацию клеток, инфекции, физическую нагрузку или раздражители; достижение оптимальных иммунных функций; более легкая реакция при назначении стероидов, при уменьшении или прекращении или пролонгировании приема кортикостероидов; снижение риска развития побочных реакций, связанных с кортикостероидами, таких как оппортунистические инфекции, остеопороз, патологический перелом, диабеты, катаракта; и их сочетание.

Материалы и методы для скрининга in vitro

Краткий обзор

Стероидная резистентность, индуцированная IL-2/4, в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) является хорошо известной моделью исследования для оценки потенциальных модификаторов стероидной резистентности и восприимчивости (Kam, J, C. etc. Combination IL-2 and IL-4 reduces glucocorticoid receptor-binding affinity and T cell response to glucocorticoids. J. Immunol 1993. 151: 3460-3466. Irusen, E. etc. p38 mitogen-activated protein kinase-induced glucocorticoid receptor phosphorylation reduces its activity: role in steroid-insensitive asthma. J. Allergy Clin. Immunol 2002. 109: 649-657. Creed TJ etc. The Effects of Cytokines on Suppression of Lymphocyte Proliferation by Dexamethasone. J Immunol 2009; 183; 164-171). Результаты этого исследования ингибирования пролиферации лимфоцитов и цитокинов дексаметазоном хорошо коррелируются с результатами стероидной терапии пациентов с воспалительными заболеваниями. Супрессия выброса цитокинов дексаметазоном (также упоминается в описании как «Дексаметазон») у здоровых добровольцев использовалась для измерения изменений стероидной восприимчивости и стероидной резистентности. После стимуляции МКПК митогеном в виде фитогемагглютинина (PHA), наблюдация сильная корреляция между уровнями секреции цитокинов и стероидной резистентностью так же, как и стероидной восприимчивости in vitro. Увеличение IL-2, IL-4 и TNF снижает стероидную восприимчивость.

Целью одного исследования была оценка эффекта соединений в отношении вызывания обратного развития кортикостероидной резистентности, оцениваемая по увеличению способности дексаметазона ингибировать PHA-индуцированное продуцирование выброса IL-2 на модели стероидной резистентности, индуцированной IL-2 и IL-4.

Эффект соединений был определен в повышении кортикостероидной восприимчивости, оцениваемой по улучшению IC50, стероидсберегающему эффекту, достижению подобного противовоспалительного эффекта при применении меньшей дозы кортикостероида, лучшей восприимчивости и синергетическому эффекту в отношении PHA-индуцированного продуцирования выброса IL-2 в МКПК.

Материалы

Система сепарации МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови): Accuspin system-Histopaque (GEHealthcare Bio-Sciences AB, США); субстрат RPMI-1640 (HyClone, Пекин, Китай), диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США), 17-α-гидроксипрогестерон капроат (17HPC) (CAS No: 630-56-8), Медроксипрогестерон ацетат (MPA) (CAS No. 71 -58-9), Прогестерон природный (P4) (CAS No. 57-83-0), Дексаметазон (Dex) (CAS No: 50-02-2) и PHA (Sigma, США); рекомбинантные лейкины IL-2 и IL-4 (PeproTech), набор для иммунносорбентного анализа IL-2 «ELISA for IL-2» (ExCell Biology, Шанхай, Китай); анти-CD3 и анти-CD28 антитела человека (R&D Systems, США).

Выделение МКПК

МКПК были выделены из лейкоцитарной пленки человеческой крови, полученной из регионального центра крови. Рандомизированные клетки лейкоцитарной пленки крови доноров мужского пола являлись побочным продуктом крови, обработанным для клинического применения, при этом не давались никакие подробности (т.е. персональная анкетная информация) за исключением данных о курении. Почти все доноры крови мужского пола были курильщиками. МКПК сепарировались с использованием пористой мембраны из полиэтилена высокой плотности (HISTOPAQUE, GEHealthcare Bio-Sciences AB, США). После центрифугирования проб крови в каждой пробирке (35 мин при 800 xg и комнатной температуре (RT)), МКПК были отделены и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS). МКПК были ресуспендированы в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 15 ммоль глютамина, после чего определили количество клеток и высеяли их на чашки.

Культивирование клеток

МКПК (2x10⁶) инкубировали вместе с IL-2 (13 нг/мл) и IL-4 (6,5 нг/мл) или без них в течение 48 час в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS и 2 ммоль глютамина. МКПК вновь подсчитывали и высеивали на чашки при 10⁷ клеток/мл перед стимуляцией с помощью, или без таковой, 17-α-гидроксипрогестерон капроатом (17HPC), Прогестероном природным (P4) и Медроксипрогестерон ацетата (MPA), которую осуществляли в течение 12 час до обработки дексаметазоном. Стимулированные МКПК IL-2 и IL-4 были также высеяны при концентрации 10⁶ клеток/мл в 96-луночную плашку, подготовленную для стимуляции выброса цитокинов с помощью PHA (15 мкг/мл, 24 час) и анализа ELISA.

Сэндвич-анализ ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ)

МКПК (2x10⁶) высевали в 96-луночную плашку и стимулировали с помощью, или без таковой, дексаметазоном (от 10^-12 до 10^-5 моль) в течение 1 час перед переносом клеток в 96-луночную плашку с PHA (15 мг/мл), или без такового, на 24 час при 37º C и 5% CO₂. После серии разведений и стандартных процедур супернатанта МКПК анализировали иммуноферментным твердофазным анализом для определения IL-2 на исходном уровне и его уровней после обработки 17HPC, P4 и MPA.

Оптическую плотность измеряли при 450 нм и корректировали с 550 нм. Концентрацию IL-2 подсчитывали с использованием калибровочной кривой, принимая во внимание состав, используемый для разведения. Предел обнаружения для IL-2 составлял 4,0 pg/мл.

Статистический анализ

Данные выражались как «величина±SD». Эффективность обработки препаратами анализировалась парным t-критерием. Однофакторный дисперсионный анализ использовался для сравнения трех или более сопоставляемых групп, а для оценки различия в процентах был выбран доверительный интервал 95%. Все графики показывают средние величины результатов или процента PHA-индуцированного продуцирования IL-2. Значения ингибирующей концентрации IC50 были рассчитаны с использованием сигмоидальной модели (BioDataFit). Значение вероятности p<0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Одновременное измерение стероидной чувствительности в МКПК (10⁶ клеток/мл)

Для одновременного измерения глюкокортикоидной чувствительности, МКПК высеяли (10⁶ клеток/мл) в 96-луночную плашку и стимулировали с помощью, или без таковой, дексаметазоном (от 10^-12 до 10^-5 моль) в течение 1 час, а затем с помощью PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂. Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Результаты на фиг.1 показывают уровни IL-2 от исходного уровня, после стимуляции PHA и ингибирования IL-2 дексаметазоном в зависимости от дозы. Уровни IL-2 в МКПК составили 19±25 pg/мл относительно исходного уровня для здоровых курильщиков мужского пола (n=11), 677±447 pg/мл после стимуляции PHA (n=20), 371±447 pg/мл при концентрации дексаметазона 10^-12 моль (n=11), 287±313 pg/мл при концентрации дексаметазона 10^-10 моль (n=14), 293±338 pg/мл при концентрации дексаметазона 10^-8 моль (n=17) и 144±157 pg/мл при концентрации дексаметазона 10^-6 моль (n=17). Обработка дексаметазоном и 17HPC не имела значительного эффекта на исходный уровень IL-2 (данные не показаны). Таким образом, фиг.1 демонстрирует уровни IL-2 (средние значения) от исходного уровня, после стимуляции PHA и эффект дексаметазона на PHA-индуцированное продуцирование IL-2 (n=20) (p<0,001). Дексаметазон продемонстрировал значительный дозозависимый эффект ингибирования продуцирования IL-2 (см. фиг.1).

Пример 1. Увеличение IL-2 и IL-4 снижает кортикостероидную чувствительность или вызывает стероидную резистентность среди курильщиков мужского пола

Стероидная резистентность, индуцированная IL-2/4 в МКПК, как хорошо известная модель исследования, была использована для оценки потенциальных модификаторов стероидной резистентности и восприимчивости. Были отобраны МКПК здоровых курильщиков. Кортикостероидная нечувствительность или резистентность индуцировалась добавлением IL-2 и IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), взятой у здоровых курящих мужчин (n=11). МКПК (10⁶ клеток/мл), стимулированные с помощью, или без таковой, IL-2 (13 нг/мл) и IL-4 (6,5 нг/мл), культивировали в 96-луночной плашке 48 час и последовательно проводили разведения с обработкой дексаметазоном (10^-10 моль, 10^-8 моль до 10^-6 моль) в течение 1 час, а затем стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂. Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Процент ингибирования PHA-индуцированного продуцирования IL-2 рассчитывали как «% ингибирования»=1 - («IL-2 с Dex»/«IL-2 без Dex»).

Результаты, приведенные на фиг.2, показывают, что среди здоровых курильщиков ингибирующая способность дексаметазона в отношении продуцирования IL-2 значительно снижается с увеличением IL-2 и IL-4. Например, % ингибирования с малой дозой дексаметазона (10^-10 моль) был полностью потерян: 52% без ингибирования, а с высокой дозой дексаметазона (10^-6 моль): 87% с 21% ингибирования, значительно снижен. Увеличение IL-2 и IL-4 снижает кортикостероидную чувствительность или вызывает стероидную резистентность среди курильщиков мужского пола, что является допустимой стероид-резистентной моделью/условием.

Пример 2. Прогестоген улучшает кортикостероидную чувствительность или вызывает обратное развитие кортикостероидной резистентности среди курильщиков мужского пола

Может быть вызвано обратное развитие кортикостероидной нечувствительности или резистентности. Нами были исследованы эффекты препаратов класса прогестогена, которые в настоящее время не были известны, в отношении его функции вызывания обратного развития кортикостероидной резистентности, при этом экспериментально исследовались такие препараты класса прогестогена, как 17-α-гидроксипрогестерон капроат (17HPC), Медроксипрогестерон ацетата (MPA) и Прогестерон природный (P4), в отношении их эффектов на улучшение глюкокортикоидной чувствительности в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) от здоровых курильщиков мужского пола.

МКПК (10⁶ клеток/мл) стимулировали IL-2 (13 нг/мл) и IL-4 (6,5 нг/мл), культивировали в 96-луночной плашке 48 час, а затем стимулировали 17HPC (10^-10 моль, 10^-7 моль и 10^-5 моль) или P4 или MPA (10^-10 моль, 10^-8 моль и 10^-5 моль) в течение 12 час до обработки, или без таковой, малой или высокой дозой дексаметазона (10^-10 моль и 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂ (n=11 для комбинации 17HPC+Dex). Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Повышение на 10% максимального ингибирования (Imax) дексаметазоном при стероид-резистентном состоянии означает клинически значимое улучшение (Creed TJ etc. The Effects of Cytokines on Suppression of Lymphocyte Proliferation by Dexamethasone. J Immunol 2009; 183; 164-171).

Результаты, представленные на фиг. 3 и 4, демонстрируют, что прогестоген улучшает кортикостероидную чувствительность при использовании всех трех препаратов класса прогестогена (17HPC, P4 и MPA), когда применяется малая доза дексаметазона. Imax увеличивается от 9% до 33%. Фиг.3 иллюстрирует эффекты прогестогена (%Imax) в обратном развитии стероидной резистентности: сравнение 17HPC, P4 и MPA при малой дозе дексаметазона (10^-10 моль). Фиг. 4 также иллюстрирует эффекты прогестогена (%Imax) в обратном развитии стероидной резистентности: сравнение 17HPC, P4 и MPA при высокой дозе дексаметазона (10^-6 моль).

Эффекты вызывания обратного развития кортикостероидной резистентности наблюдались при использовании высокой дозы дексаметазона (см. фиг.4). Каждый препарат класса прогестогена имеет свою собственную дозозависмую особенность. Среди этих трех исследованных препаратов, лучшие эффекты терапии продемонстрировал 17HPC, т.е. наибольшее улучшении (около 18%) и стабильность при всех уровнях доз (16-18%).

Прогестоген (например, 17HPC, P4 и MPA) тем самым имеет непредсказуемый и неожиданный эффект вызывания обратного развития кортикостероидной резистентности и улучшения глюкокортикоидной чувствительности у курильщиков. Таким образом прогестоген может применяться для терапии болезней с глюкокортикоидной нечувствительностью, вызываемых курением, например, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).

Пример 3. 17HPC вызывает обратное развитие кортикостероидной резистентности у курильщиков

МКПК (10⁶ клеток/мл) стимулировали IL-2 (13 нг/мл) и IL-4 (6,5 нг/мл), культивировали в 96-луночной плашке 48 час, а затем стимулировали 17HPC (10^-10 моль, 10^-7 моль и 10^-5 моль) 12 час до обработки, или без таковой, тремя дозами дексаметазона (10^-10 моль и 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂ (n=11). Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA.

Фиг. 5 иллюстрирует, что увеличение IL-2 и IL-4 значительно снижает стероидную чувствительность при всех трех концентрациях дексаметазона. Улучшение ингибирования дексаметазоном PHA-индуцированного выброса IL-2 достигается за счет добавления 17HPC. 17HPC вызывает обратное развитие глюкокортикоидной нечувствительности с дозозависимой характеристикой. Таким образом 17HPC восстанавливает кортикостероидную чувствительность. Например, уровень PHA-индуцированного IL-2 с 10^-10 моль дексаметазона без 17HPC был 2364 pg/мл, а значительное увеличение супрессии цитокинов до 2119 pg/мл, 1805 pg/мл и 1595 pg/мл наблюдалось после добавления 17HPC при 10^-10 моль, 10^-7 моль и 10^-5 моль, соответственно (p<0,05 в обеих группах 17HPC при 10^-7 моль и 10^-5 моль).

Фиг.6 иллюстрирует индивидуальный характера восприимчивости до и после обработки 17HPC, когда использовалась высокая доза дексаметазона 10^-6 моль. Десять из одиннадцати субъектов имели улучшение более 10% (в % максимального ингибирования дексаметазоном) после обработки 17HPC, и только один субъект (#6) не имел улучшения (p<0,05 по критерию хи-квадрат во всех трех группах дозировки 17HPC). Таким образом 17HPC вызывает обратное развитие стероидной резистентности и индивидуального характера восприимчивости.

Пример 4. Индивидуальный характер восприимчивости с тремя препаратами класса прогестогена: 17HPC, P4 и MPA

Пример 3 выше показал, что прогестоген вызывает обратное развитие кортикостероидной резистентности у курильщиков. На фиг. 7-9 сравнивается характер индивидуальной восприимчивости трех препаратов класса прогестогена: 17HPC, P4 и MPA, при одинаковой дозе 10^-6 моль.

Результаты, представленные на фиг. 7, демонстрируют, что девять из одиннадцати субъектов имели более чем 10%-ое улучшение в максимальном ингибировании дексаметазоном после приема дозы 17HPC, что согласуется с результатами, представленными на фиг. 6.

Результаты, представленные на фиг. 8, демонстрируют, что шесть из восьми субъектов имели более чем 10%-ое улучшение в максимальном ингибировании дексаметазоном после приема дозы природного прогестерона, который является подобным 17HPC.

Результаты, представленные на фиг. 9, демонстрируют, что обработка MPA ведет к общему отличному характеру восприимчивости: «раздробленная» восприимчивость. Одна подгруппа имела значительно улучшение, вплоть до 58%, в то время, как другая подгруппа продемонстрировала ухудшение кортикостероидной восприимчивости с ее снижением вплоть до 88%.

Пример 5. Прогестоген (например, 17HPC) улучшает кортикостероидную чувствительность при состоянии нестероидной резистентности

Для определения эффекта дополнительной терапии с помощью 17HPC на глюкокортикоидную чувствительность, МКПК (10⁶ клеток/мл) помещали в 96-луночную плашку и стимулировали 17HPC (от 10^-10 моль 10^-5 моль) 12 час до обработки, или без таковой, с последовательными разбавлениями с помощью дексаметазона (от 10^-12 моль до 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂ (n=11). Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Значение IC50 рассчитывали с использованием сигмоидальной модели (BioDataFit). Значение (IL-2=734) от негативного контроля (т.е. клетка+PHA без дексаметазона или 17HPC) было искусственно задано как Dexamethasone^-18 M или 17HPC^-17 M (т.е. предполагая концентрацию препарата ~0) для приспособления сигмоидальной модели при расчете Dexamethasone-IC₅₀ и 17HPC-IC₅₀ (N=14).

Эффект 17HPC на восприимчивость дексаметазона, оцененный ингибированием IL-2, у курильщиков представлен в таблице 1 и на фиг. 10. Фиг. 10 показывает дополнительный эффект 17HPC в улучшении стероидной восприимчивости. 17HPC, особенно при низких концентрациях, значительно улучшает стероидную чувствительность, измеряемую посредством Dexamethasone-IC₅₀, демонстрирующую улучшение, начиная с IC₅₀=7,5 (только дексаметазон) до 10,2-12,0 (дексаметазон+17HPC) (p=0,0052 в дисперсионном анализе). Высокая доза 17HPC (при 17HPC 10^-5 моль) имела минимальный эффект или не имела эффекта.

Таблица 1. Эффект 17HPC в улучшении кортикостероидной чувствительности (средние значения IL-2 pg/мл и IC₅₀)

Пример 5. Прогестоген (например, 17HPC) имеет значительный стероидсберегающий эффект

Для определения эффекта дополнительной терапии с помощью 17HPC на стероидсбережение, МКПК (10⁶ клеток/мл) помещали в 96-луночную плашку и стимулировали 17HPC (от 10^-10 моль 10^-5 моль) 12 час до обработки, или без таковой, с последовательными разбавлениями с помощью дексаметазона (от 10^-12 моль до 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂. Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Рассчитывали % ингибирования стимуляции IL-2 (pg/мл) за счет PHA в МКПК с помощью 17HPC и/или дексаметазона Значение (IL-2=734,7) от негативного контроля (т.е. клетка+PHA без обработки любым из препаратов) было задано как нулевое значение % ингибирования, а все другие значения % ингибирования получали по формуле: (1 - («уровень IL-2 при обработке» /714,5) х 100%, (N=14) (примечание: 714,5 нг/мл (PHA-индуцированного IL-2) было средним значением для 14 субъектов).

Дополнительная терапия с помощью 17HPC может достигать подобного эффекта за счет использования малой дозы кортикостероида (см. табл.2). Процент супрессии выброса IL-2 высокой дозой 10^-6 моль дексаметазона (Imax) у здоровых курильщиков составил 78%. Дополнительная терапия с помощью 17HPC значительно снижает требования к величине дозы дексаметазона. Таблица 2 демонстрирует, что добавление малых доз 17HPC (10^-11 моль до 10^-10 моль) позволяет достичь подобного противовоспалительного эффекта (>78% ингибирования IL-2) при сравнении по дозе дексаметазона 10^-6 моль, т.е. только при использовании от 1/1000 до 1/100000 исходной дозы дексаметазона, т.е. достичь значительного стероидсберегающего эффекта. Поэтому, добавление 17HPC может предотвратить риск развития у индивидуумов рефрактерных ответов или резистентности или обострений или толерантности к кортикостероидам, а также улучшить профиль безопасности препаратов.

Таблица 2. Дополнительный эффект 17HPC: Стероидсберегающий эффект, определенный в % ингибирования PHA-индуцированного выброса IL-2

Значения представлены для % ингибирования PHA-стимуляции выброса IL-2 (pg/мл) с помощью только 17HPC, только дексаметазона, а также с помощью 17HPC и дексаметазона при различных концентрациях на модели МКПК.

Пример 7. Добавление прогестогена (например, 17HPC) приводит к лучшей восприимчивости терапии, а за счет комбинации 17HPC и дексаметазона достигается синергетический эффект

Для определения эффекта дополнительной терапии с помощью 17HPC на стероидсбережение, МКПК (10⁶ клеток/мл) помещали в 96-луночную плашку и стимулировали 17HPC (от 10^-10 моль 10^-5 моль) 12 час до обработки, или без таковой, с последовательными разбавлениями с помощью дексаметазона (от 10^-12 моль до 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂. Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Рассчитывали % ингибирования стимуляции IL-2 (pg/мл) за счет PHA в МКПК с помощью 17HPC и/или дексаметазона Значение (IL-2=734,7) от негативного контроля (т.е. клетка+PHA без обработки любым из препаратов) было задано как нулевое значение % ингибирования, а все другие значения % ингибирования получали по формуле: (1 - («уровень IL-2 при обработке» /714,5) х 100%, (N=14).

Максимальным противовоспалительным эффектом дексаметазона является 78%-ое ингибирование продуцирования PHA, индуцированного IL-2, при 10^-6 моль. Дополнительная обработка 17HPC ведет к значительно лучшей восприимчивости с результатом около 100% супрессии IL-2, индуцированного PHA (фиг. 11). Фиг. 11 тем самым представляет более лучшие результаты терапии за счет ее дополнения 17HPC.

Комбинация 17HPC с дексаметазоном неизменно повышает противовоспалительный эффект дексаметазона, который является более высоким, чем при его отдельном применении. Фиг. 12 демонстрирует, что такая комбинация приводит к синергетическому эффекту с 25-31%-ым увеличением эффективности дексаметазона. Тем самым фиг. 12 демонстрирует синергетический эффект комбинации 17HPC с дексаметазоном.

Пример 8. Добавление других соединений прогестогена (например, P4 и MPA) демонстрирует подобные эффекты в улучшении глюкокортикоидной чувствительности

Для определения эффекта дополнительной терапии на стероидсбережение с помощью Медроксипрогестерон ацетата (MPA) и Прогестерона природного (P4), МКПК (10⁶ клеток/мл) помещали в 96-луночную плашку и стимулировали P4 или MPA (10^-10 моль, 10^-8 моль и 10^-5 моль) 12 час до обработки, или без таковой, с последовательными разбавлениями с помощью дексаметазона (от 10^-12 моль до 10^-6 моль) в течение 1 час, после которой стимулировали PHA (15 мг/мл) 24 час при 37º C и 5% CO₂ (n=6 для комбинации P4 или MPA+дексаметазон). Уровни IL-2 квантифицировали с помощью ELISA. Рассчитывали % ингибирования стимуляции IL-2 (pg/мл) за счет PHA в МКПК с помощью P4 или MPA и/или дексаметазона. Значение (IL-2=765) от негативного контроля (т.е. клетка+PHA без обработки любым из препаратов, n=25) было задано как нулевое значение % ингибирования, а все другие значения % ингибирования получали по формуле: (1 - («уровень IL-2 при обработке» /714,5) х 100%, (N=14).

Таблиц 3 и таблица 4 демонстрируют, что оба препарата P4 и MPA имеют подобный эффект в улучшении стероидсбережения и синергетический эффект в комбинации. Например, процент супрессии выброса IL-2 дексаметазоном при 10^-8 моль улучшился с 67% до 96% при добавлении 10^-8 моль MPA (p=0,035 в парном t-критерии). При добавлении малой дозы P4 или MPA (10^-10 моль) достигается подобный противовоспалительный эффект (>86% ингибирования IL-2) по сравнению с только дексаметазоном при 10^-6 моль, т.е. при использовании только 1/100 исходной дозы дексаметазона достигается значительный стероидсберегающий эффект.

Таблица 3. Эффект от добавления Медроксипрогестерон ацетата (MPA) в улучшении кортикостероидной чувствительности (средние значения IL-2 pg/мл и % ингибирования PHA-индуцированного продуцирования IL-2)

Таблица 4. Эффект от добавления Прогестерона природного (P4) в улучшении кортикостероидной чувствительности (средние значения IL-2 pg/мл и % ингибирования PHA-индуцированного продуцирования IL-2)

Изобретение относится к применению прогестогена, выбранного из группы, состоящей из 17НРС, Р4 и MPА, в качестве компонента фармацевтической композиции глюкокортикоидной сенсибилизации мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от субъекта, страдающего глюкокортикоидной нечувствительностью, повышенной глюкокортикоидной чувствительностью или обращением глюкокортикоидной нечувствительности, причем субъект не имеет рецидива, связанного с менструальным циклом, а состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью, включают круг иммуновоспалительных расстройств/болезней, лечимых терапией стероидами, но такая терапия не в состоянии достигнуть контроля над болезнью или является неэффективной, или интолерантной, или зависимой от кортикостероидов, или их комбинацией. Способ позволяет повысить эффект терапии глюкокортикоидной нечувствительности. 12 ил., 4 табл., 8 пр.

Применение прогестогена, выбранного из группы, состоящей из 17НРС, Р4 и MPА, в качестве компонента фармацевтической композиции глюкокортикоидной сенсибилизации мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от субъекта, страдающего глюкокортикоидной нечувствительностью, повышенной глюкокортикоидной чувствительностью или обращением глюкокортикоидной нечувствительности, причем субъект не имеет рецидива, связанного с менструальным циклом, а состояния, связанные с глюкокортикоидной нечувствительностью, включают круг иммуновоспалительных расстройств/болезней, лечимых терапией стероидами, но такая терапия не в состоянии достигнуть контроля над болезнью или является неэффективной, или интолерантной, или зависимой от кортикостероидов, или является их комбинацией.