СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБУЛОИНТЕРСТИЦИАЛЬНОГО ФИБРОЗА ПРИ ФОКАЛЬНО-СЕГМЕНТАРНОМ ГЛОМЕРУЛОСКЛЕРОЗЕ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к нефрологии и морфологической диагностике.

Результаты последних проводимых на рубеже XXI столетия экспериментальных и клинических научных исследований различных морфологических форм хронического гломерулонефрита (ХГН) с применением современных диагностических методик привели к существенным изменениям, касающимся представлений о патофизиологии почек.

Так, при помощи многофакторного анализа было показано, что наиболее значимыми факторами неблагоприятного прогноза у пациентов с ХГН являются тубулоинтерстициальные изменения /Wehrmann M., Bohle A., Held Н., Schumm G., Kendziorra H. Presslar H. Long-term prognosis of focal sclerosis glomerulonephritis. An analysis of 250 cases with particular regard to tubulointerstitial changes. Clin Nephrol 1990; 33: 115-122/. Одним из указанных факторов является тубулоинтерстициальный фиброз (ТИФ), который определяется с помощью пункционной нефробиопсии, являющейся инвазивной процедурой. Кроме нефробиопсии нефросклероз диагностировали с помощью определения уровня фибронектина в моче /Козловская Л.В., Бобкова И.Н., Варшавский В.А., Проскурнева Е.П., Мирошниченко Н.Г., Чеботарева Н.В., Мухин Н.А. Фибронектин мочи как показатель процессов фиброзирования в почке при нефрите. Терапевтический архив. - 1999. - №6. - С.34-3 8/. Однако позже было установлено, что указанный гликопротеид чаще обнаруживается при диффузном нефросклерозе, а при очаговом поражении почечной ткани выделяется лишь в 48% случаев, что значительно снижает его диагностическое значение /Сергеева Т.В., Алексеевских Ю.Г. и др. Характер и значение тубулоинтерстициальных изменений при первичном гломерулонефрите у детей. - Педиатрия. - 1997. - №2. - С.49-52/.

Известен способ диагностики нефросклероза, основанный на рентгенологической оценке степени поражения функционирующей паренхимы почек. Для реализации данного способа пациенту внутривенно вводят рентгеноконтрастные йодсодержащие вещества, после чего производится серия рентгеновских снимков, по которым оценивают степень и распространенность нефросклероза /Рентгенодиагностика в медицине // Руководство для врачей в 2-х томах. Под ред. Босина В.Ф. и Филиппкина М.А. - М.: Медицина, 1998, т. 2, с.13-46/.

Известен также способ радиологической диагностики нефросклероза, при котором пациенту внутривенно вводят радиофармпрепарат (технемек), меченый радиоактивным технецием (99m-Тс), с последующим анализом распределения радиоактивности ткани почки гамма-камерой. На основании интенсивности и равномерности накопления радиофармпрепарата почкой судят о степени и распространенности склеротического поражения органа /Piepzs A. // Radionuclide studies in paediatric nephro-urology. - Europ. Journal of Radiol. - 2002, vol.43: P.146-153/.

Недостатками этих способов являются инвазивность и лучевая нагрузка на организм. Указанные недостатки не позволяют использовать указанные диагностические процедуры для длительного динамического наблюдения за функциональным состоянием почек.

Также известен способ неинвазивной диагностики нефросклероза у детей с хроническим гломерулонефритом /патент РФ №2302633, опубликован 10.07.2007/, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание интерлейкина-10, при котором дополнительно определяют содержание трансформирующего фактора роста 1 и рассчитывают просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста 1 и интерлейкина-10, и при значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз. Данный способ принят за прототип, недостатком которого является отсутствие доказанной корреляции между развитием ТИФ (по данным нефробиопсии) и выявлением трансформирующего фактора роста 1 и интерлейкина-10, а также он не учитывает морфологическую форму ХГН.

Задача изобретения - разработать неинвазивный метод диагностики ТИФ при фокально-сегментарном гломерулосклерозе (ФСГС) с целью мониторирования его развития в процессе наблюдения пациента для определения риска развития ХПН и мероприятий по его снижению.

Технический результат - выявление ТИФ у больных с ФСГС неинвазивным методом.

Этот технический результат достигается тем, что для диагностики ТИФ при ФСГС проводят исследование протеомного паттерна мочи, при котором, исследуя мочу на масс-спектрографе и выявляя в ней белки TGF β₂ и/или цистатин В, диагностируют развитие ТИФ.

В качестве исследуемого материала используют мочу, в которой при помощи масс-спектрометрии определяют иммуноферментным методом наличие TGF β₂ и/или цистатина В. Данный способ не требует длительного наблюдения за больным, не сопряжен с осложнениями, связанными с инвазивными методами диагностики, и в то же время является высокоинформативным.

Способ осуществляется следующим образом. У пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом проводится сбор мочи с последующим ее исследованием на масс-спектрографе и при выявлении TGF β₂ и/или цистатина В диагностируют ТИФ, что может в дальнейшем изменить тактику ведения пациента.

Авторы обследовали 31 пациента с ФСГС, у которых при изучении морфологического заключения нефробиоптата регистрировался ТИФ, затем мочу этих пациентов направляли для выполнения масс-спектрометрии с целью определения протеомного паттерна мочи. В настоящем исследовании обнаружено увеличение абсолютного количества TGF β₂, относящегося к семейству цитокинов, которые являются мультифункциональными пептидами, регулирующими пролиферацию, дифференцировку, адгезию, миграцию и другие функции в клетках, передающих внутриклеточные сигналы через трансмембранные рецепторы 1 и 2 типа, а также их эффекторы SMAD-белки, и запуская активность TGFB/SMAD. Белок обладает супрессивным эффектом в отношении интерлейкина-2 - зависимого Т-клеточного роста. TGF β₂ работает как антипролиферативный фактор в нормальных эпителиальных клетках и на ранних стадиях онкогенеза. Некоторые клетки секретируют TGF β₂, имея на своей поверхности рецепторы и реализуя аутокринную сигнализацию. TGF β₂ секретируется многими типами клеток, включающих макрофаги, в латентной форме в комплексе с другими полипептидами, латентная форма TGF β₂, связанная с белком, и латентно-связанный пептид. Сывороточные протеиназы катализируют высвобождение TGF β₂ из комплекса. На поверхности макрофагов обнаруживаются латентный комплекс TGF β₂ посредством связывания через CD36 с лигандом тромбоспондином-1. Воспалительные стимулы активируют макрофаги, увеличивают высвобождение активного TGF β₂, усиливают активацию плазмина /Taylor AW (January 2009). "Review of the activation of TGF-beta in immunity". J. Leukoc. Biol. 85(1):29-33/. Таким образом, данная молекула является чувствительным маркером острого пролиферативного гломерулярного поражения в почечной ткани, при котором резко увеличивается экспрессия рецепторов к TGF β₂ I и II типов. Последний тип рецепторов при своей активации индуцируют транскрипционный ответ на TGF β₂.

Также было установлено увеличение экспрессии цистатина, который относится к семейству цистатинов и является ингибитором внутриклеточных тиоловых протеаз. Он стабилизирует нековалентные связи, ингибируя папаин и катепсины 1, h и b. Белок может играть роль защиты против протеаз, образующихся в лизосомах. Цистатин В является новым потенциальным маркером активности склеротических процессов в почечной ткани при ФСГС. Экспрессия цистатина В может коррелировать с активностью заболевания и стадией прогрессирования ФСГС. Увеличение синтеза цистатина В сопровождается увеличением экспрессии цистатина С, который секретируется в клетках проксимальных канальцев нефрона и определяет интенсивность клубочковой фильтрации /Jarvinen M, Rinne A, Hopsu-Havu VK (1988). "Human cystatins in normal and diseased tissues-a review." Acta Histochem. 82(1):5-18/.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка Т., 42 лет поступила в отделение нефрологии с жалобами на выраженные отеки нижних конечностей, пастозность лица. Суточный диурез 1000 мл. Исходный уровень креатинина и мочевины крови был в пределах нормы (соответственно 72 мкмоль/л и 6,4 ммоль/л), клубочковая фильтрация 91 мл/мин. Уровень суточной протеинурии - 8,6 грамм, в общем анализе мочи (ОАМ) протеинурия (+++), гиалиновые цилиндры. Это позволило констатировать у больной наличие нефротического синдрома. Данные лабораторного обследования в совокупности с жалобами пациентки, анамнезом заболевания (заболела около двух месяцев, когда впервые отметила вышеуказанные жалобы) позволили предположить у пациентки хронический гломерулонефрит, нефротический синдром, обострение. Выполнена нефробиопсия, по результатам которой поставлен диагноз - ФСГС, при световой микроскопии биоптата был выявлен тубулоинтерстициальный фиброз, моча пациентки исследована на масс-спектрографе (выявлен TGF β₂). Таким образом, выявление ТИФ при пункционной биопсии коррелирует с выявлением TGF β₂ в моче пациентов с ФСГС.

Пример 2. Пациент М., 50 лет поступил в отделение нефрологии с жалобами на отеки нижних конечностей, пастозность лица, общую слабость. Суточный диурез 900 мл. Из анамнеза стало известно, что 10 лет назад после выполнения пункционной нефробиопсии установлен диагноз ФСГС. При изучении морфологического исследования нефробиоптата на момент выполнения нефробиопсии ТИФ отсутствовал. Исходный уровень креатинина и мочевины крови был в пределах нормы (соответственно 76 мкмоль/л и 6,2 ммоль/л). Однако спустя 3-4 года от момента выполнения биопсии при лабораторном обследовании стал нарастать креатинин на 10-13 мкмоль/л ежегодно и мочевина на 0,2-0,4 ммоль/л соответственно, а к моменту осмотра данные показатели составляли 156 мкмоль/л и 9,1 ммоль/л соответственно, что косвенно свидетельствовало о развитии ТИФ. Уровень суточной протеинурии - 7,4 грамм/сут, в ОАМ протеинурия (+++), что позволило констатировать у пациента наличие нефротического синдрома с возможным прогрессированием нефрита. Пациент согласился на проведение повторной нефробиопсии, при световой микроскопии биоптата был выявлен тубулоинтерстициальный фиброз, моча пациента исследована на масс-спектрографе (выявлены цистатин В и TGF β₂), что соответствовало развитию ТИФ по данным биопсии. Полученные данные позволили скорректировать терапию и определить дальнейшую тактику ведения пациента.

Пример 3. Пациентка И., 28 лет поступила в отделение нефрологии с жалобами на пастозность лица, отеки нижних конечностей. Суточный диурез 1200 мл. Из анамнеза стало известно, что около двух недель назад отметила появление вышеуказанных жалоб, на момент обследования уровень креатинина и мочевины крови был в пределах нормы (соответственно 60 мкмоль/л и 4,8 ммоль/л), в ОАМ выявлена протеинурия (++), суточная протеинурия составила 4,2 г/сут, что позволило предположить у пациентки хронический гломерулонефрит, нефротический синдром. После выполнения пункционной нефробиопсии был подтвержден морфологический вариант гломерулонефрита - ФСГС, при изучении результата морфологического исследования нефробиоптата ТИФ не определялся, моча пациентки исследована на масс-спектрографе, где также не определялись искомые белки (цистатин В и/или TGF β₂), что соответствовало благоприятному прогнозу течения заболевания, определенному с помощью заявленного способа.

Пример 4. Пациентка В., 34 лет поступила в отделение нефрологии с жалобами на общую слабость, отеки стоп и голеней, пастозность лица. Суточный диурез 1100 мл. Из анамнеза стало известно, что около полугода назад впервые отметила отеки стоп, которые постепенно распространились до середины голени, после чего обратилась за медицинской помощью, в ОАМ регистрировалась протеинурия (++), в биохимическом анализе крови умеренная азотемия (креатинин 126 мкмоль/л, мочевина 6,7 ммоль/л). От предложенной нефробиопсии на тот момент отказалась. На момент обследования уровень креатинина и мочевины крови уже был 148 мкмоль/л и 8,4 ммоль/л соответственно, что клинически соответствовало развитию ТИФ. Пациентке была выполнена пункционная нефробиопсия, при изучении которой был выявлен тубулоинтерстициальный фиброз, моча пациентки исследована на масс-спектрографе (выявлены цистатин В и/или TGF β₂), что соответствовало развитию ТИФ по данным биопсии.

Таким образом, предлагаемый способ выявления ТИФ у пациентов с ФСГС позволяет выявлять пациентов с риском развития ТИФ неинвазивным способом. Способ прост, доступен для широкого применения в клинической практике и позволяет сократить сроки пребывания больных в стационаре, а также уменьшить количество осложнений от инвазивных методов обследования.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу неинвазивной диагностики развития тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС). Сущность способа состоит в том, что у пациентов с ФСГС исследуют мочу на масс-спектрографе, и при выявлении в моче белков TGF β₂ и/или цистатина B диагностируют развитие ТИФ. Использование заявленного способа позволяет эффективно диагностировать развитие ТИФ. 4 пр.

Способ неинвазивной диагностики развития тубулоинтерстициального фиброза (ТИФ) у пациентов с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС), включающий исследование протеомного паттерна мочи, отличающийся тем, что у пациентов с ФСГС исследуют мочу на масс-спектрографе, и при выявлении в моче белков TGF β₂ и/или цистатина В диагностируют развитие ТИФ.