СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕФРОСКЛЕРОЗА У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики степени склерозирования почечной ткани при хроническом гломерулонефрите у детей, и может быть использовано в нефрологии и педиатрии.

Нефросклероз - общий путь прогрессирования хронических заболеваний почек, ведущий к терминальной стадии повреждения их функционального состояния и формированию почечной недостаточности (Ратнер М.Я., Федорова Н.Д., Макуров А.И. Тубулоинтерстициальные изменения при различных клинических и морфологических типах хронического гломерулонефрита // Урология и нефрология. - 1997. - №2. - С.16-19; Muller G.A., Zeisberg M., Strutz F. The importance of tubulointerstitial damage in progressive renal disease. Nephrol. Dial. Transplant. - 2000. - Vol.15. - [Suppl.6]. - P.76-77).

Нефросклероз - (nephrosclerosis: нефро + склероз) - замещение паренхимы почек соединительной тканью, приводящее к их уплотнению, сморщиванию и нарушению функций (Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М., 1983. - Т.2. - С.236).

При выраженном диффузном склерозировании почечной ткани формируется резистентность к патогенетической терапии хронического гломерулонефрита и существенно ускоряется прогрессирование хронической почечной недостаточности, которое определяется по динамике клинических и гистологических нарушений ткани почек (Ратнер М.Я., Стенина И.И., Федорова Н.Д. Прогнозирование ускоренного прогрессирования хронического гломерулонефрита на основании клинических и гистоморфологических данных. - Тер. архив. - 1999. - №6. - С.27-30).

Диагностика нефросклероза основывается преимущественно на результатах гистоморфологического исследования почечной ткани (нефробиопсии) (Ратнер М.Я., Федорова Н.Д., Макуров А.И. Тубулоинтерстициальные изменения при различных клинических и морфологических типах хронического гломерулонефрита. - Урология и нефрология. - 1997. - №2. - С.16-19; Ратнер М.Я., Федорова Н.Д. Гистоморфологические Тубулоинтерстициальные изменения при прогрессировании хронического гломерулонефрита. - Урология. - 2000. - №1. - С.28-30). Указанный способ достаточно точен, однако, как любое инвазивное исследование, сопряжен с множеством технических трудностей, опасен и травматичен для больного.

Кроме нефробиопсии с целью диагностики нефросклероза используется изучение уровня фибронектина в моче (Козловская Л.В., Бобкова И.Н., Варшавский В.А., Проскурнева Е.П., Мирошниченко Н.Г., Чеботарева Н.В., Мухин Н.А. Фибронектин мочи как показатель процессов фиброзирования в почке при нефрите. - Тер. архив. - 1999. - №6. - С.34-38). Однако в последние годы было установлено, что указанный гликопротеид обнаруживается главным образом при диффузном нефросклерозе, тогда как при очаговом поражении почечной ткани выделяется лишь в 48% случаев, что существенно снижает его диагностическое значение (Сергеева Т.В., Алексеевских Ю.Г. и др. Характер и значение тубулоинтерстициальных изменений при первичном гломерулонефрите у детей. - Педиатрия. - 1997. - №2. - С.49-52).

Известен способ диагностики нефросклероза, основанный на рентгенологической оценке степени поражения функционирующей паренхимы почек. Для оценки структурного состояния почек внутривенно вводят рентгеноконтрастные йодсодержащие вещества. После чего производится серия рентгеновских снимков, по которым оценивают степень и распространенность нефросклероза (Рентгенодиагностика в медицине // Руководство для врачей в 2-х томах. Под ред. Босина В.Ф. и Филиппкина М.А. - М., Медицина, 1998, Т.2, С.13-46).

Известен также способ радиологической диагностики нефросклероза, заключающийся во внутривенном введении больному радиофармпрепарата (технемек), меченного радиоактивным технецием (99m-Тс) с последующим анализом распределения радиоактивности ткани почки гамма-камерой. На основании интенсивности и равномерности накопления радиофармпрепарата почкой судят о степени и распространенности склеротического поражения органа (Piepzs A. // Radionuclide studies in paediatric nephro-urology. - Europ. Journal of Radiol. - 2002, Vol.43: P.146-153).

Недостатками этих способов являются инвазивность и лучевая нагрузка на растущий организм ребенка. Указанные недостатки не позволяют использовать указанные диагностические процедуры для длительного динамического наблюдения за функциональным состоянием почек.

Известен способ диагностики нефросклероза путем ультразвукового сканирования почек с цветной допплерографией почечных сосудов. При нефросклерозе отмечается уменьшение размеров почек, фрагментарное истончение почечной паренхимы, нарушение кортико-медуллярной дифференцировки и деформация контура почки. Определяется неравномерное повышение эхогенности паренхимы, преимущественно в зоне ее истончения. В этих же местах выявляется обеднение интраренального сосудистого рисунка. Обнаруженные изменения почечной ткани расцениваются как нефросклероз.

Недостатком этого способа является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных и малая чувствительность метода у больных с большой массой тела, что существенно снижает точность диагностики нефросклероза у подростков и взрослых.

Вместе с тем известно, что тубулоинтерстициальные нарушения значительно быстрее приводят к недостаточности почечных функций, чем гломерулосклероз. Развитие интерстициального нефросклероза проходит несколько стадий: воспаление, пролиферацию интерстициальных фибробластов, распространение интерстициального внеклеточного матрикса, приводящее к фиброзу (Eddy A.A. Molecular basis of renal fibrosis. - Pediatr Nephrol. - 2000. - Vol.15, №3-4. - P.290-301). Инфильтрация гломерул и интерстиция мононуклеарами считается наиболее серьезным поражением почечной ткани и главным образом влияет на исход необратимых структурных изменений в почках. При этом установлено участие цитокинов в развитии воспаления почек и нефросклероза у детей (Rovin В. Chemokines as therapeutic targets in renal inflammation. - Am J Kidney Dis. - 1999: V.34(4). - P.761-767).

Цитокины представляют собой биологически активные соединения, способствующие возникновению воспалительной реакции и влияющие на процессы клеточной пролиферации в почечной ткани. Наиболее значимыми из них являются интерлейкины (ИЛ)-6, -10 и фактор некроза опухоли-α (ФНОα), который считается провоспалительным цитокином.

При этом ИЛ-10 относится к группе противовоспалительных факторов и может рассматриваться как антагонист некоторых цитокинов, так как подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-6 и ФНОα.

В настоящее время установлено, что в развитии гломерулосклероза основную функцию выполняют мезангиальные клетки. Выявлена тесная взаимосвязь между ангиотензином-2 (ANG-2) и таким цитокином, как трансформирующий фактор роста-β₁ (TGF-β₁), в регуляции накопления мезангия (Border WA, Noble NA. Interactions of transforming growth factor-β and angiotensin II in renal fibrosis. Hypertension. - 1998; V.31: P.181-188). При этом показано, что нарастание и фиброгенез мезангиального матрикса, в основном, регулируется TGF-β₁, который стимулирует пролиферацию фибробластов (Schnaper H.W., Hayashida Т., Hubchak S.C., Poncelet A.C. TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis. - Am. J Physiol. Renal Physiol. - 2003; Vol.284(2). - P.243-252).

Эти данные свидетельствуют о возможности определения цитокинов как локальных медиаторов, образованных непосредственно в почке, для диагностики степени нефросклероза. При этом для оценки выраженности нефросклероза и интенсивности процессов клеточной пролиферации в почках особую ценность представляют методы определения способности почек продуцировать противовоспалительные цитокины и факторы роста в мочу. Однако до настоящего времени не использовалось комплексное определение взаимосвязанных противовоспалительных цитокинов и факторов роста в динамике развития нефросклероза при гломерулонефрите у детей.

Известен способ ранней диагностики нефросклероза путем выявления рефлюкс-нефропатии у детей с хроническим пиелонефритом на фоне пузырно-мочеточникового рефлюкса, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание цитокинов, отличающийся тем, что определяют содержание интерлейкина-8 (ИЛ-8), интерлейкина-10 (ИЛ-10) и фактора некроза опухоли α (ФНО α) при первичном обследовании и через 6 месяцев, и при уменьшении содержания ИЛ-10 более чем в 1,3 раза и повышении содержания ФНО-α более чем в 1,4 раза по сравнению с первоначальными значениями, на фоне постоянной концентрации ИЛ-8 диагностируют рефлюкс-нефропатию у больных с пузырно-мочеточниковым рефлюксом (Патент РФ №2239838, зарегистрированный 10.11.2004 г. "Способ диагностики рефлюкс-нефропатии").

Этот способ диагностики избран нами в качестве прототипа.

Задачей данного изобретения является разработка неинвазивного информативного способа ранней диагностики нефросклероза у больных до появления рентгенологических, радиологических и эхографических признаков поражение почек.

Поставленная задача решается тем, что проводят иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание интерлейкина-10, затем определяют содержание трансформирующего фактора роста β₁ и рассчитывают просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста β₁ и интерлейкина-10 и при значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз.

Существенным отличием заявляемого способа от известных является то, что в качестве диагностического критерия нефросклероза рассчитывается просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста (TGF-β₁) и интерлейкина-10 (ИЛ-10), указывающих на развитие склеротических процессов в почечной паренхиме вследствие дисбаланса этих регуляторов.

В качестве исследуемого материала используют суточную мочу, в которой иммуноферментным методом определяют концентрации трансформирующего фактора роста β₁ и интерлейкина-10.

Способ не требует длительного наблюдения за больным, не сопряжен с осложнениями, связанными с инвазивными методами диагностики, и в то же время является высокоинформативным, так как отражает соотношение просклеротического и противовоспалительного (протективного в отношении ренальной ткани) факторов как локальных медиаторов, образованных непосредственно в почечной ткани.

Способ осуществляется следующим образом. У больных проводится сбор мочи на общем режиме в течение суток; затем осуществляется забор образцов для исследования, объемом 15 мл каждый, из общего объема суточной мочи после регистрации суточного диуреза. Образцы мочи до проведения анализа хранятся при -20°С.

Для измерения уровней изучаемых цитокинов используются коммерческие наборы: "CYTELISA-IL-10" (CYTIMMUNE, USA), "TGF-β₁ ELISA" (BCM DIAGNOSTIC, USA). Применение их основано на методе твердофазного энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay), принцип которого заключается в качественном и количественном определении изучаемого антигена путем его послойного связывания со специфичными к нему антителами. Моноклональные антитела, специфичные к исследуемому антигену, фиксированы на поверхности лунок 96-луночной планшетки. При добавлении к ним изучаемых образцов или стандартов исследуемый антиген связывается иммобилизованными антителами. После удаления методом отмывания не связавшихся протеинов, в лунки добавляются поликлональные антитела, связанные с энзимом. Они наслаиваются на иммобилизованный в ходе первой инкубации антиген по принципу "сэндвича". После этого их излишек отмывается и в лунки добавляется раствор хромогенного субстрата, который прореагировав с энзимом, дает характерное окрашивание. По интенсивности последнего оценивается содержание в пробе исследуемого антигена.

Примеры конкретного осуществления способа.

Для оценки диагностической значимости способа нами проведены клинические и лабораторные исследования у 20 детей в возрасте 7-14 лет, из них 15 больных с хроническим гломерулонефритом, находившихся в нефрологическом отделении НИИ педиатрии ГУ НЦЗД РАМН, и 10 практически здоровых детей референтной группы (контроль). При этом у здоровых детей содержание трансформирующего фактора роста-β₁ в суточной моче составило 23,86±3,27 пг/мл, а уровни интерлейкина-10 составили 19,48±5,58 пг/мл, соотношение концентраций указанных цитокинов составило 1,00±0,12. Эти данные использованы нами как референтные значения концентраций названных цитокинов в суточной моче.

Концентрации трансформирующего фактора роста-β₁ и интерлейкина-10 в суточной моче сопоставляли с гистологическими критериями степени формирования нефросклероза, которые определялись по данным пункционной нефробиопсии в соответствии с классификацией Ставской В.В. (Ставская В.В., Рябов С.И., Клемина И.К. О клиническом значении тубулоинтерстициальных изменений при хроническом гломерулонефрите. - Клин. мед. - 1987. - №10. - С.125-129).

При этом было обнаружено существенное повышение уровней ТФР-β₁ и снижение концентраций ИЛ-10 в суточной моче по мере возрастания степени повреждения почечной ткани, что сопровождалось изменениями коэффициента соотношений концентраций указанных цитокинов.

При вычислении соотношения уровней трансформирующего фактора роста-β₁ и интерлейкина-10 (просклеротического коэффициента) в моче у больных с различной степенью нефросклероза установлено, что при умеренно выраженном повреждении почечной ткани этот показатель не превышал 0,95, тогда как при выраженном нефросклерозе возрастал более 3,0.

Пример №1. Больная Н. 12 лет (история болезни 2111/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 6 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике проведена нефробиопсия, выявившая фокально-сегментарный гломерулосклероз с умеренными изменениями тубулоинтерстициальной ткани (умеренный нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-β₁ в моче составил 33,5 пг/мл, содержание интерлейкина-10 - 40,7 пг/мл, соотношение концентраций (просклеротический коэффициент) - 0,82. Таким образом, снижение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-β₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ИЛ-10 при неизменном по сравнению с контролем содержании ТФР-β₁ свидетельствует об умеренном развитии нефросклероза у этой больной, что было подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата, при котором были выявлены обратимые, преимущественно локальные изменения тубулоинтерстициальной ткани почек.

Пример №2. Больная Р. 11 лет (история болезни 2131/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 7 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике в возрасте 11 лет проведена нефробиопсия, выявившая фокально-сегментарный гломерулосклероз с выраженными изменениями тубулоинтерстициальной ткани и формированием склеротических изменений (выраженный нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-β₁ в моче составил 35,6 пг/мл, содержание интерлейкина-10 - 10,4 пг/мл, соотношение концентраций этих веществ (просклеротический коэффициент) - 3,4. В данном случае повышение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-β₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ТФР-β₁ и значимого уменьшения содержания ИЛ-10 по сравнению с контролем свидетельствует о формировании выраженного нефросклероза у этой больной, что подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата.

Пример №3. Больная Р. 14 лет (история болезни 2156/04) с диагнозом хронический гломерулонефрит, смешанная форма, активная стадия, ограничение функции почек по осмотическому концентрированию. Девочка больна в течение 9 лет. Заболевание проявляется стероидрезистентным нефротическим синдромом в сочетании с гематурией и артериальной гипертензией. В клинике в возрасте 14 лет проведена нефробиопсия, выявившая распространенный фокально-сегментарный гломерулосклероз с резко выраженными изменениями тубулоинтерстициальной ткани и обширным формированием склеротических изменений (выраженный необратимый нефросклероз). Уровень трансформирующего фактора роста-β₁ в моче составил 49,8 пг/мл, содержание интерлейкина-10 - 5,9 пг/мл, соотношение концентраций этих веществ (просклеротический коэффициент) - 8,3. В данном случае значительное повышение соотношения концентраций трансформирующего фактора роста-β₁ и интерлейкина-10 в суточной моче за счет существенного увеличения уровней ТФР-β₁ и значимого уменьшения содержания ИЛ-10 по сравнению с контролем свидетельствует о формировании выраженного необратимого нефросклероза у этой больной, что подтверждено данными гистологического исследования нефробиоптата.

Таким образом, выявленные изменения соотношений концентраций трансформирующего фактора роста-β₁ и противовоспалительного интерлейкина-10 как диагностического просклеротического коэффициента могут быть использованы в качестве информативного критерия степени выраженности нефросклероза у больных с хроническими формами патологии почек. Это обеспечит своевременную диагностику прогрессирования нефросклероза без использования биопсии почки.

Предложенный способ является неинвазивным и информативным и позволяет сократить сроки пребывания больных в стационаре, а также уменьшить количество осложнений от других методов обследования.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики степени склерозирования почечной ткани при хроническом гломерулонефрите у детей, и может быть использовано в нефрологии и педиатрии. Сущность способа: в суточной моче детей с хроническим гломерулонефритом иммуноферментным методом определяют содержание интерлейкина-10, дополнительно определяют содержание трансформирующего фактора роста β₁ и вычисляют просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста β₁ и интерлейкина-10. При значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при его значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз. Применение способа дает возможность ранней диагностики степени выраженности нефросклероза у больных с хроническими формами патологии почек, что обеспечивает своевременную диагностику прогрессирования нефросклероза без использования биопсии почки.

Способ диагностики нефросклероза у детей с хроническим гломерулонефритом, включающий иммуноферментный анализ суточной мочи на содержание интерлейкина-10, отличающийся тем, что дополнительно определяют содержание трансформирующего фактора роста β₁ и рассчитывают просклеротический коэффициент как соотношение концентраций трансформирующего фактора роста β₁ и интерлейкина-10 и при значении коэффициента меньше 0,95 диагностируют умеренный компенсированный нефросклероз, а при значении более 3,0 диагностируют выраженный необратимый нефросклероз.