ПТЕРОСТИЛЬБЕН (PTER) ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОФИЛАКТИКЕ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИИ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ПОВРЕЖДЕНИЙ ИЛИ ТРАВМ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/352 A61K31/05 A61P17/16 A61P17/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение может быть отнесено к области фармацевтической промышленности.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Потребление фруктов и овощей в большом количестве ассоциировано со здоровым образом жизни. Такая ассоциация связана с наличием в пище природных антиоксидантов, главным образом полифенольных соединений. Одним из полифенольных соединений, которое вызывает особый интерес в научном сообществе, является ресвератрол (3,4',5-тригидрокси-транс-стилбен; RESV), низкомолекулярный полифенол, в значительных количествах присутствующий в вине, к потенциально благотворным эффектам которого прибегают при различных хронических заболеваниях (в частности, при злокачественной опухоли, при сердечно-сосудистых заболеваниях, при диабете II типа и нейродегенеративных заболеваниях). Противоопухолевые свойства RESV были впервые высказаны Jang et al. (Jang M, Cai L, Udeani GO, Slowing KV, Thomas CF, Beecher CW, Fong HH, Farnsworth NR, Kinghorn AD, Mehta RG, Moon RC, Pezzuto JM. (1997) Science 275(5297): 218-20), с эффектами, проявляющимися на трех стадиях развития злокачественной опухоли (инициации, промоции и прогрессии). Противоопухолевые эффекты RESV очень ограничены в силу его низкой биодоступности (Asensi M, Medina I, Ortega A, Carretero J Bano MC, Obrador E, Estrela JM. (2002) Free adic Biol Med. 33(3): 387-98). Из-за указанного недостатка изучали возможности лечения злокачественных опухолей некоторыми другими полифенолами с улучшенной биодоступностью. Было показано, что сочетание PTER (3,5-диметокси-4'-гидрокси-транс-ресвератрола, PTER, производного RESV) и QUER (3,3', 4',5,6- пентагидроксифлавона; QUER), двух низкомолекулярных природных полифенолов, имеющих следующие формулы:

эффективно для ингибирования метастатического роста высокоагрессивной мышиной злокачественной меланомы {Ferrer P, Asensi M, Segarra R, Ortega A, Benlloch M, Obrador E, Varea MT, Asensio G, Jorda L, Estrela JM. (2005) Neoplasia. 7(l): 37-47). Кроме того, ассоциация PTER и QUER, усиливая противоопухолевые эффекты химиотерапии плюс радиотерапии, облегчает элиминацию резистентной человеческой колоректальной злокачественной опухоли, ксенотрансплантированной иммунодефицитным мышам (Priego S, Feddi F, Ferrer P, Mena S, Benlloch M, Ortega A, Carretero J Obrador E, Asensi M, Estrela JM. (2008) Mol Cancer Ther. 7(10): 3330-42). PTER и QUER вводили внутривенно и/или перорально. Современные эпидемиологические исследования показали, что свыше 90% всех разновидностей рака кожи вызвано воздействием солнца, особенно ультрафиолета B (УФ-B). Частота таких злокачественных поражений кожи, как меланомного, так и не-меланомного типа, заметно возрастает (количество случаев смерти от рака кожи за последние 20 лет удвоилось).

Следовательно, в данной области давно назрела необходимость в композициях, способных предотвращать и/или лечить кожные заболевания (включая рак кожи), повреждения или травмы, вызываемые длительным воздействием излучения, в особенности УФ-B (ультрафиолет B).

Однако кожные заболевания, повреждения или травмы могут быть вызваны не только воздействием излучения, но также и другими факторами, такими как иммунные факторы. Большинство кожных заболеваний, повреждений или травм сопровождается наличием воспалительных процессов, ассоциированных с кожной патологией. Более того, воздействие излучения на кожу или воспалительные процессы в коже, ассоциированные либо с указанным воздействием излучения, либо с другими причинами, такими как аутоиммунные заболевания кожи или аллергические кожные заболевания, такие как псориаз, аллергический контактный дерматит или атопический дерматит, также сопровождаются повышением окислительного стресса кожи в результате образования кислородных радикалов и других продуктов окисления, например, таких как окись азота (NO) или пероксинитрит.

Аномалии, ассоциированные с воспалением, включают в себя обширную группу независимых расстройств, которые лежат в основе разнообразных заболеваний человека. Однако цель настоящего изобретения сосредоточена не конкретно на профилактике/лечении воспаления, а на особым образом выбранной группе показаний, все из которых связаны с кожей, которую лечат путем нанесения местных композиций, более конкретно, с такими кожными заболеваниями, которые вызваны воздействием излучения. Более того, в предшествующем уровне техники описаны вводимые перорально лекарственные средства, которые могут быть использованы для лечения воспалительных заболеваний, однако лекарственные средства, вводимые перорально, никогда не окажут своих потенциальных терапевтических воздействий на такую отдаленную ткань-мишень как кожа.

Было обнаружено, что QUER (Rubia Casagrande, Sandra R. Georgetti, Waldiceu A. Verri Jr., Daniel J. Dorta, Antonio C. dos Santos, Maria J. V. Fonseca [2006]; J. Photochem Photobiol B: Biology 84: 21-27 and Alena Svobodovd, Jitka Psotovd, Daniela Walterovd [2003]; Biomed. Papers 147(2): 137-145) является эффективным в отношении профилактики вредных воздействий УФ-облучения на кожу. Однако в спектре поглощения QUER большинство пиков с максимумами расположено при длинах волн в области УФ-A (320-400 нм), а не в области УФ-B (290-320 нм), как раз там, где спектр PTER достигает своего максимума.

На предшествующем уровне в данной области для лечения кожи использовали сочетание некоторых членов химического семейства стилбена, необязательно PTER, с ретиноидами (WO01/43705 A2).

Настоящее изобретение открывает новую ступень по направлению к решению указанных выше проблем, развивая композиции, направленные на профилактику и/или лечение кожных заболеваний, повреждений или травм, на основе PTER как главного активного соединения, а точнее, в сочетании PTER с QUER. Более того, настоящее изобретение может быть использовано млекопитающим (человеком) для нанесения на кожу, например, под солнцезащитную композицию, композицию после загара, под средство от старения, средство от морщин, под композиции с фотозащитными свойствами, еще до того как проявится какое бы то ни было кожное заболевание, повреждение или травма.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение главным образом относится к применению PTER или любой его приемлемой соли, необязательно в сочетании с QUER или любой его приемлемой солью, для изготовления фармацевтических композиций для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. Терапевтические способы профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм включают в себя введение субъекту, в случае необходимости, эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного соединения PTER или любую его приемлемую соль, необязательно в сочетании с QUER или с любой его приемлемой солью. Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям как таковым, включающим в себя в качестве активного соединения PTER или любую его приемлемую соль, необязательно в сочетании с QUER, предпочтительно, в виде местных композиций, а более предпочтительно, в виде липосом; настоящее изобретение распространяется также и на способ получения таких липосомальных композиций.

QUER может быть заменен любым другим полифенолом, при условии, что такая комбинация с PTER будет оказывать синергический эффект.

Применительно к целям настоящего изобретения, полифенолы образуют группу химических веществ, которые можно обнаружить в растениях, но не только в них, характеризующихся наличием более чем одного фенольного элемента или строительного блока на молекулу. Полифенолы обычно делятся на гидролизуемые таннины (сложные эфиры галлиевой кислоты с глюкозой и другими сахарами) и фенилпропаноиды, такие как лигнины, флавоноиды и конденсированные таннины.

Действие PTER и, необязательно, также и его сочетания с QUER, может быть реализовано многими путями:

a) в качестве УФ-фильтра, в силу того, что оба полифенола имеют химическую структуру, которая позволяет поглощать излучение.

b) в качестве улавливателя свободных кислородных радикалов активных форм кислорода (ROS, Reactive Oxygen Species), продуцируемых в процессе излучения и/или во время протекания воспалительных процессов.

c) в качестве противовоспалительных и иммуномодулирующих средств.

В предпочтительном воплощении композиции согласно изобретению содержат комбинацию двух активных соединений, PTER и QUER, или любых их приемлемых солей. Следовательно, способы профилактики и/или лечения включают в себя введение субъекту, в случае необходимости, эффективного количества композиции, содержащей оба соединения, PTER и QUER, или любую их приемлемую соль.

В настоящем описании под термином "субъект" подразумевается млекопитающее, например, человек.

Воспалительные процессы, определяемые в настоящем изобретении, включают в себя процесс острого или хронического воспаления, инициированный клетками, уже присутствующими во всех тканях, главным образом резидентными макрофагами, дендритными клетками, гистиоцитами, купферовскими клетками и мастоцитами. При возникновении воспаления, ожога или других повреждений указанные виды клеток подвергаются активации и высвобождают медиаторы воспаления, ответственные за клинические признаки воспаления. Вазодилятация и связанный с нею повышенный ток крови вызывает покраснение и повышение температуры. Повышенная проницаемость кровеносных сосудов приводит к экссудации (утечке) белков и жидкости из плазмы в ткани (эдема), которая проявляется в виде отека. Некоторые из высвобождаемых медиаторов, такие как брадикинин, повышают болевую чувствительность (гипералгезия). Молекулы-медиаторы вызывают также изменения кровеносных сосудов, обеспечивая миграцию лейкоцитов, главным образом нейтрофилов, за пределы кровеносных сосудов (экстравазация) в ткани. Нейтрофилы мигрируют вдоль хемотаксического градиента, создаваемого локальными клетками, на участок повреждения. Возможно, потеря функции является результатом неврологической реакции в ответ на боль.

Помимо полученных из клеток медиаторов, несколько клеточных биохимических каскадных систем, состоящих из уже образованных белков плазмы, действует параллельно для инициации и распространения воспалительного процесса. Таковые включают в себя систему комплемента, активируемую бактериями, и коагуляционную систему фибринолиза, активируемую некрозом, например, ожогом или травмой. Острый воспалительный ответ требует для своего поддержания постоянной стимуляции. Медиаторы воспаления имеют короткие времена полужизни и в тканях подвергаются быстрой деградации. Следовательно, воспаление прекращается сразу же, как только устранен стимул. Композиции согласно изобретению могут включать в себя любую "приемлемую соль" рассматриваемых здесь активных соединений. Здесь указанная экспрессия означает те соли соединений согласно изобретению, которые являются безопасными и эффективными при их использовании в качестве фармацевтических средств для млекопитающих, которые обладают требуемой биологической активностью. Иллюстративные соли включают в себя, но не ограничены сульфатом, цитратом, ацетатом, оксалатом, хлоридом, бромидом, йодидом, нитратом, бисульфатом, фосфатом, кислым фосфатом, изоникотинатом, лактатом, салицилатом, кислой солью цитрата, тартратом, олеатом, таннатом, пантотенатом, битартратом, аскорбатом, сукцинатом, малеатом, гентизинатом, фумаратом, глюконатом, глюкаронатом, сахаратом, форматом, бензоатом, глутаматом, метансульфонатом, этансульфонатом, бензолсульфонатом, пара-толуолсульфонатом и пальмоатом. "Приемлемыми солями" согласно изобретению предпочтительно являются соли, полученные из полифенольных соединений, имеющих кислотообразующую функциональную группу, такую как функциональная группа карбоновой кислоты, и приемлемое неорганическое или органическое основание. Подходящие основания включают в себя, но не ограничены гидроксидами щелочных металлов, таких как натрий, калий и литий; гидроксидами щелочно-земельных металлов, таких как кальций и магний; гидроксидами других металлов, таких как алюминий и цинк; аммоний и органические амины, такие как незамещенные или гидрокси-замещенные моно-, ди- или три-алкиламины, дициклогексиламин; трибутиламин; пиридин; N-метил, N-этиламин; диэтиламин; триэтиламин; моно-, бис- или трис-(2-гидроки-замещенные низшие алкиламины), такие как моно-, бис- или трис-(2-гидроксиэтил)амин, 2-гидрокси-трет-бутиламин или трис- (гидроксиметил)метиламин, N,N-ди-низший алкил-N-(гидрокси низший алкил)амины, такие как N,N-диметил-N-(2-гидроксиэтил)амин или три-(2-гидроксиэтил)амин; N-метил-D-глюкамин; и аминокислоты, такие как аргинин, лизин и т.п. Термин "приемлемая соль" включает в себя также гидрат полифенольного соединения.

Эксципиент, как определено в настоящем описании, означает неактивное вещество, используемое в качестве носителя или наполнителя для активных соединений (PTER и/или QUER), содержащихся в композиции. Композиции согласно изобретению могут содержать любой эксципиент, предпочтительно, подходящий для его включения в состав местных композиций (то есть дерматологически приемлемый эксципиент). Следующие дополнительные средства, указанные ниже, могут независимо друг от друга присутствовать в композиции согласно изобретению: желатинизирующие средства, масла, воски, загустители, гидрофильные или гидрофобные полимеры, эмульгаторы, мягчительные средства, жирные кислоты, органические растворители, антиоксиданты, стабилизаторы, комплексообразующие соединения, средства, повышающие кислотность или основность, эмульсификаторы, мягчительные средства, поверхностно-активные вещества, пленкообразователи, биологические добавки для повышения функциональной эффективности и/или привлекательности для потребителя, такие как аминокислоты, белки, ваниль, экстракт алоэ или биофлавоноиды, забуферивающие средства, хелатообразующие вещества, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) или щавелевая кислота, окрашивающие вещества, красители, пропелленты, противовспенивающие вещества, увлажняющие вещества, витамины, стабилизаторы эмульсии, средства для доведения pH, загустители, ароматизирующие вещества, консерванты, опалесцирующие компоненты, вода и/или спирты. Указанные выше дополнительные средства для композиции согласно изобретению используются в известных количествах, обычно используемых в данной области.

Подходящие масла для композиций согласно изобретению выбирают из животных или растительных, или же синтетических масел. Особенно предпочтительные масла выбраны из группы, включающей в себя вазелиновое масло, парафиновое масло, летучие и нелетучие силиконовые масла, изопарафины, полиальфаолефины, фторированные и перфторированные масла.

Подходящие стабилизаторы для композиций согласно изобретению могут быть неионогенной, анионной, катионной и амфифильной природы. Предпочтительные стабилизаторы выбран из группы, включающей в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ) и его производные, твины, тритоны, спаны, полиглицерины, полиалкилглицериды, алкилсульфонаты, арилсульфонаты, алкилфосфаты, производные алкилбетаина и фосфатидилглицерина.

Эмульгирующие средства предпочтительно используются в композициях согласно изобретению в количествах, эффективных для обеспечения однородной гомогенизации ингредиентов указанных композиций. Подходящие эмульгирующие средства включают в себя анионные средства, такие как мыло жирной кислоты, например, стеарат калия, стеарат натрия, стеарат аммония и триэтаноламина стеарат; сложные моноэфиры жирных кислот полиолов, содержащие мыло жирной кислоты, например, глицеролмоностеарат, содержащий либо калиевую, либо натриевую соль; сложные сернокислые эфиры (натриевые соли), например, лаурилсульфат натрия и ацетилсульфат натрия; и сложные моноэфиры жирных кислот полиолов, содержащие сернокислые эфиры, например, глицерилмоностеарат, содержащий лаурилсульфат натрия; (ii) катионные хлориды, такие как N(стеароил-коламино-формилметил)пиридий; N-соя-N-этил-морфолин-этосульфат; алкил-диметил-бензил аммония хлорид; хлорид диизобутилфенокситеоксиэтилдиметилбензиламмония; и ацетил-пиридиум хлорид; и (iii) неионогенные, такие как полиоксиэтиленовые эфиры жирных спиртов, например, моностеарат; полиоксиэтиленовый лауриловый спирт; полиоксипропиленовые эфиры жирных спиртов, например, пропоксилированный олеиловый спирт; сложные эфиры полиоксиэтилена и жирных кислот, например, полиоксиэтиленстеарат; сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, например, моностеарат полиоксиэтиленсорбитана; сложные эфиры жирной кислоты и сорбитана, например, сорбитан сложные эфиры жирной кислоты и полиоксиэтиленгликоля, например, полиоксиэтиленгликоля моностеарат; и сложные эфиры жирных кислот и полиолов, например, глицерилмоностеарат и пропиленгликольмоностеарат; и этоксилированные ланолиновые производные, например, этоксилированные ланолины, этоксилированные ланолиновые спирты и/или этоксилированный холестерин.

Мягчительные средства также могут быть использованы в композициях согласно изобретению в таких количествах, чтобы предотвращать или уменьшать степень сухости. Подходящие мягчительные средства включают в себя, но не ограничены углеводородными маслами и восками; силиконовыми маслами; сложными триглицеридными эфирами; сложными ацетоглицеридными эфирами; этоксилированным глицеридом; сложными алкиловыми эфирами; сложными алкениловыми эфирами; жирными кислотами; жирными спиртами; эфирами жирных спиртов; сополимерами простых и сложных эфиров (etheresters); ланолином и производными; многоатомными спиртами (полиолы) и производными полиэфиров; сложными эфирами многоатомных спиртов (полиолов); сложными эфирами восков; сложными эфирами пчелиного воска; растительными восками; фосфолипидами; стеролами; и/или амидами.

В композициях согласно изобретению могут, кроме того, быть использованы также и поверхностно-активные вещества. Подходящими поверхностно-активными веществами являются, например, такие поверхностно-активные вещества, которые обычно выделяют в группы моющих средств, эмульгирующих веществ, пенообразователей, гидротропных веществ, солюбилизирующих веществ, суспендирующих веществ и не-сурфактантов, которые облегчают диспергирование твердых веществ в жидкостях.

Пленкообразователи, которые предпочтительно могут быть использованы в композициях согласно изобретению, призваны поддерживать смягчение и разглаживание композиции и даже... и предпочтительно, используются без ограничения. Подходящие пленкообразователи выбраны из группы, включающей в себя сополимер акриламида и акрилата натрия; сополимер аммонийакрилатов; бальзам Перу; целлюлозную камедь; сополимер этилена и малеинового ангидрида; гидроксиэтилцеллюлозу; гидроксипропилцеллюлозу; полиакриламид; полиэтилен; поливиниловый спирт; сополимер pvm/MA (сополимер винилметилового эфира и малеинового ангидрида); PVP (поливинилпирролидон); полимер малеинового ангидрида, сополимер поливинилпирролидона и гексадецена; сополимер акрилакрилатов и т.п. Вещества, регулирующие pH, также могут быть использованы в композициях согласно изобретению. Указанные регулирующие pH вещества предпочтительно выбирают из гидроокиси аммония, триэтаноламина или лимонной кислоты.

Загустители, используемые в композициях согласно изобретению, предпочтительно выбирают из канделильского, карнаубского и микрокристаллического восков, поперечно сшитых полимеров акриловой кислоты, карбомера, метилгидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы или гидроксиэтилцеллюлозы и полиэтиленовых загустителей.

Примеры предпочтительных органических растворителей для композиций согласно изобретению включают в себя низшие алифатические спирты и полиолы.

Подходящие антиоксиданты для композиций, используемых в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают из группы, включающей в себя аскорбиновую кислоту (витамин C), натрий-L-аскорбат, кальций-L-аскорбат, аскорбилпальмитат, бутилгидроксианизол, бутилгидрокситолуол, кальций-динатрий-ЭДТА, изоаскорбиновую кислоту, лецитин, молочную кислоту, полифосфат, токоферол (витамин E), такой как [альфа]-токоферол, [гамма]-токоферол, [дельта]-токоферол, пропилгаллат, октилгаллат, додецилгаллат, натрий-изоаскорбат, лимонную кислоту, цитрат натрия, цитрат калия и хлорид олова(II).

Желатинирующие средства, которые предпочтительно используются в композициях согласно изобретению, могут быть природными или синтетическими полимерами. Природные полимеры предпочтительно выбирают из группы агар-агара, альгината, пектина, карбомера, каррагенана, казеина, декстрина, желатина, гуммиарабика, кератина, камеди бобов рожкового дерева, ксантановой камеди и т.п. Предпочтительные синтетические полимеры, которые могут быть использованы в композициях согласно изобретению, выбирают из полимеров акриловой кислоты, полиакриловых амидов и полимеров алкиленоксидных полимеров.

Для введения субъекту композиции согласно изобретению может быть использован любой путь введения, при этом предпочтительными путями введения являются внутривенный, пероральный и местный пути введения. В предпочтительном воплощении композиция согласно изобретению является местной композицией, которая может быть составлена в жидкой или полутвердой форме, предпочтительно, в виде жидкости, раствора, пены, крема, геля, пасты, бальзама, спрея, мази, лосьона, кондиционера, тоника, молочка, мусса, эмульсии, сыворотки, масла, батончика, шампуня, желе, суспензии, дисперсии, глазури, румян, эликсира, капель или аэрозоля. В конкретном воплощении активные соединения согласно изобретению вводят местно в виде липосомального препарата. Используемая в настоящем изобретении "липосома" является искусственной частицей, которая состоит из одного или нескольких концентрических слоев и используется, в частности, для доставки веществ (то есть PTER и/или QUER) к клеткам организма.

Местное введение композиции согласно изобретению приводит к высокой биодоступности активных соединений PTER и/или QUER, уменьшая количество композиций согласно изобретению, которые вызывают терапевтический эффект у 50% субъектов, которым их вводят, то есть уменьшая эффективную дозировку (ED₅₀). В фармакологии биодоступность, или биологическую усвояемость, используют для описания части вводимой дозы неизменяемого лекарственного средства, которая достигает системного кровотока, это одно из принципиальных фармакокинетических свойств лекарственных средств. Следовательно, биодоступность является одним из основных инструментов в фармакокинетике, и она должна приниматься во внимание при расчете дозировок для невнутривенных путей введения.

Любое кожное заболевание, повреждение или травма, включая рак кожи, можно предотвращать и/или лечить композициями согласно изобретению. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения кожные заболевания, повреждения или травмы ассоциируются с воспалительными процессами. Следовательно, в предпочтительным воплощении настоящее изобретение сосредоточено на профилактике и/или лечении субъектов, предрасположенных к воспалительным дерматозам или пораженных ими, включающем в себя введение композиции согласно изобретению на пораженную область кожи (губы, лицо или вообще кожу) и/или введение каким-нибудь другим альтернативным путем. Термин "воспалительный дерматоз" включает в себя диапазон кожных нарушений, включая, но не ограничиваясь перечисленным, расстройства сальных желез, папулосквамозные дерматозы, аллергические дерматозы, зудящие дерматозы, васкулярные дерматозы, бактериальные дерматозы, вирусные дерматозы, грибковые кожные инфекции, гранулематозные дерматозы, паразитарные кожные дерматозы, эксфолиативный дерматит, буллезные дерматозы, пигментированные дерматозы, фоточувствительные дерматозы, дерматозы, вызванные коллагенозами, и дерматозы, обусловленные внутренними болезнями. Воспалительный дерматоз может быть ассоциирован также с аутоиммунным состоянием, и в этом случае он будет называться здесь "аутоиммунным дерматозом".

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения воспалительный дерматоз представляет собой расстройство сальных желез, например, угревидное расстройство, такое как обыкновенные угри, acne conglombata, гнойный гидраденит, розовые угри, себорея, себорейный дерматит, грам-отрицательный фолликулит, пиодермия лица, множественная стеатоцистома, гиперплазия сальных желез или ринофима. В более предпочтительном воплощении настоящего изобретения, композиция/состав, содержащий PTER или любую его приемлемую соль, необязательно в сочетании с QUER или любой его приемлемой солью, используется для лечения обыкновенных угрей. Как хорошо известно, обыкновенные угри являются хроническим состоянием кожи, характеризующимся угрями и папулами, и оно может быть достаточно тяжелым; в особо тяжелых случаях могут возникать пустулы, кисты и устойчивые рубцы.

Еще в одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения, воспалительным дерматозом, подвергаемым профилактике и/или лечению, является папулосквамозный дерматоз, такой, например, как псориаз, розовый питириаз, разноцветный лишай или красный плоский лишай. Способ и композиции согласно изобретению особенно полезны при лечении псориаза, аутоиммунного воспалительного расстройства, которое, как известно, трудно поддается лечению традиционно используемыми средствами.

Еще в одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения, воспалительным дерматозом, подвергаемым лечению, является аутоиммунный дерматоз, который может быть, например, атопическим дерматитом, мастоцитозом, буллезным пемфигоидом, обыкновенной пузырчаткой, некротизирующим васкулитом, дискоидной красной волчанкой, системной красной волчанкой или герпетиформным дерматитом. В других воплощениях примерами различных типов воспалительных дерматозов, в отношении которых способ и композиция согласно изобретению являются эффективными, являются следующие:

Аллергические дерматозы: контактный дерматит; фотоаллергический дерматит; промышленные дерматозы, вызванные воздействием разных соединений, используемых в промышленности, которые являются контактирующими раздражителями; атопическая экзема (детей и взрослых); и дерматозы, вызванные лекарственными средствами, и нумуллярная экзема.

Зудящие дерматозы: зимний, старческий и эссенциальный зуд; зуд заднего прохода; постоянный отит; зимний зуд; зуд наружных женских половых органов; и зуд мошонки.

Васкулярные дерматозы: мультиформная эритема; узловатая эритема; застойный дерматит; пурпурные дерматозы, такие как дерматозы, ассоциированные с тромбоцитопенической пурпурой, нетромбоцитопенической пурпурой, диспротеинемической пурпурой, фотохимической пурпурой, цинготной пурпурой и пурпурой Геноха; экхимозами; застойной пурпурой; первичной и вторичной телангиэктазиями.

Бактериальные дерматозы: пиодермия, такая как импетиго, эктима, фолликулит, фурункулы-чиреи, карбункулы, инфекции потовых желез, рожистое воспаление, эритразма, инфицированные язвы и инфицированный экзематозный дерматит; и бактериальные дерматозы, ассоциированные с системными бактериальными инфекциями, такими как скарлатина, паховая гранулема, шанкроид, туберкулез, проказа, гонорея, риккетсиоз, актиномикоз и сифилис.

Вирусные дерматозы: такие как дерматозы, вызванные вирусом простого герпеса, варицеллиформный пустулез Капоши, опоясывающий лишай, ветряная оспа, оспа, коровья оспа, контагиозный моллюск, венерическая лимфогранулема, экзантемы, такие как коревая краснуха, розеола и инфекционная эритема.

Грибковые кожные инфекции: дерматомикоз паховый (поверхностные грибковые инфекции кожи разных участков тела); эпидермофития стоп (дерматофитоз стопы, вызванный инфекцией грибком стригущего лишая); дерматомикоз ногтей (онихомикоз); споротрихоз; кокцидиоидомикоз; гистоплазмоз; и североамериканский бластомикоз.

Гранулематозные дерматозы: саркоидоз; анулярная гранулема; ретикулогистиоцитома; и гранулемы, вызванные диоксидом кремния.

Паразитарные кожные инфекции: чесотка, воспаление кожи; демодикоз; педикулез.

Пигментированные дерматозы: хлоазма (мелазма) и витилиго.

Коллагенозы: склеродермия и дерматомиозит.

Дерматозы, обусловленные внутренними болезнями: гангренозная приодермия, ассоциированная с язвенным колитом, и язвы, обусловленные диабетом.

Фоточувствительные дерматозы: экзогенного типа, такие как обусловленный действием лекарственного средства световой дерматит и контактный дерматит с фотоаллергическим компонентом; и эндогенного типа, такие как дерматозы, ассоциированные с порфириями и полиморфными фотодерматозами.

В предпочтительном воплощении кожные заболевания, повреждения или травмы вызваны воздействием излучения, острым или хроническим. Тогда заболевание выбирают из следующего: рака кожи, меланомы, полиморфных фотодерматозов, актинического кератоза, солнечной крапивницы, пигментной ксеродермы, фотостарения, хронического актинического дерматита или солнечного ожога. Термин "излучение" включает в себя излучение любого типа, которое способно вызвать повреждения или травмы в коже, например, рентгенотерапию, используемую для лечения злокачественной опухоли, или ультрафиолетового излучения (УФ), предпочтительно, УФ-B, излучаемого солнцем.

Используемый в настоящем изобретении термин "предотвращение", или "профилактика", означает избегание, полностью или частично, проявлений кожных патофизиологических процессов, ассоциированных с оксидативным стрессом, избыточным воздействием излучения, в особенности УФ-излучения, связанного с загоранием тела, в частности, с УФ-B-излучением, за счет которого относят солнечный загар, аллергию, иммунные реакции и воспалительные процессы.

Используемый в настоящем изобретении термин "фотопротекция", или "солнцезащитное действие", относится к введению композиции согласно изобретению до того как субъект будет подвергнут действию излучения, в основном УФ-B-излучения, снижающей или подавляющий риск получения повреждений. Следовательно, подразумевается, что в настоящем изобретении термин "фотопротекция" входит в понятие, охватываемое термином "профилактика".

С одной стороны, термин "лечение" связан с введением субъекту композиции согласно изобретению на стадии, когда субъект уже страдает симптомами кожного заболевания, повреждения или травмы. В порядке примера, термин "лечение" предпочтительно применим к введению любой из описанных в настоящем изобретении композиций индивиду, который подвергся излучению, прежде всего, УФ-B-излучению, в целях репарации пораженных частей кожи и восстановления ее исходной функции и целостности. Более того, термин "лечение" связан с введением композиции согласно изобретению субъекту, страдающему каким бы то ни было кожным заболеванием, имеющему повреждение или травму, ассоциированные с воспалительными процессами.

PTER, необязательно в сочетании с QUER или любой его приемлемой солью, может быть составлен в композицию, в сочетании с другими активными соединениями. Среди указанных других активных соединений предпочтительными являются обезболивающие средства, противовоспалительные средства, противоаллергические средства, иммуномодуляторы, заживляющие средства и фильтры излучения. В списке УФ-фильтров, подходящих для применения в качестве ингредиентов фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению, вводимых в них совместно с PTER и, необязательно, с QUER, или с любыми их приемлемыми солями, можно отметить УФ-абсорбирующие вещества (УФ-A и/или УФ-B), описанные в международной заявке WO 2008067928. Наиболее предпочтительные УФ-фильтры выбраны из следующих (Таблица 1):

Таблица 1 УФ-фильтр Другие наименования пара-аминобензойная кислота PABA Падимат O OD-PABA, октилдиметил-PABA, σ-PABA Фенилбензимидазол сульфоновая кислота Энсулизол, Эузолекс-232, PBSA,
Parsol HS Циноксат 2-этоксиэтил-пара-метоксициннамат Диоксибензон Бензофенон-8 Оксибензон Бензофенон-3, Эузолекс-4360,
Эскалол-567 Гомосалат Гомометилсалицилат, HMS Ментил-антранилат Мерадимат Октокрилен Eusolex OCR, 2-циано-3,3-дифенилакриловая кислота, сложный
2-этилгексиловый эфир Октил-метоксициннамат Октиноксат, EMC, OMC, этил-метоксициннамат, Эскалол-557, 2-этилгексил-пара-метоксициннамат,
Parsol МСХ Октил-салицилат Октисалат, 2-этилгексил-салицилат, Эскалол-587 Сулизобензон 2-гидрокси-4-метоксибензофенон-5- сульфоновая кислота, 3-бензоил-4-гидрокси-6-метокси-бензолсульфоновая кислота, бензофенон-4, Эскалол-577 Троламин-салицилат Триэтаноламина салицилат Авобензон 1-(4-метоксифенил)-3-(4-трет-бутилфенил)пропан-1,3-дион, Бутил-метокси-дибензоилметан, BMDBM,
Парсол-1789, Эузолекс-9020 Экамсул Mexoryl SX, Терефталилиден-дикамфоросульфоновая кислота Диоксид титана CI77891 Окись цинка   4-метилбензилиден-камфора Энзакамен, Parsol 5000,
Эузолекс-6300, MBC Тиносорб М Бисоктризол, Метилен-бис-бензотриазолил-тетраметилбутилфенол, МВВТ Тиносорб S Бис-этилгексилоксифенол-метоксифенил-триазин, Бемотризинол, ВЕМТ, анизотриазин Neo Heliopan AP Динатрий-бис-дисулизол, Динатрий-
фенил-дибензимидазол-тетрасульфонат,
бис-имидазилат, DPDT Мексорил XL Дрометризола трисилоксан Бензофенон-9 Uvinul DS 49, CAS 3121-60-6,
Дигидрокси-диметокси-
дисульфобензофенон натрия Uvinul Т 150 Октилтриазон, Этилгексил-триазон, ET Uvinul A Plus Диэтил-амино-гидрокси-бензоил-
гексил-бензоат Uvasorb HEB Искотризинол, Ди-этилгексил-бутамидотриазон, DBT Parsol SLX Dimethico-diethylbenzalmalonate, Полисиликон-15 Изопентенил-4-метоксициннамат  

В настоящем изобретении было использовано несколько технологий, таких как определение толщины кожной складки или эпидермиса, как до, так и после воздействия излучения, с тем, чтобы выяснить эффективность или действенность композиций согласно изобретению в профилактике и/или лечении кожных заболеваний, повреждений или травм. Все указанные технологии хорошо известны в данной области и относятся к общеизвестному уровню техники. Более того, обе технологии повседневно используются для тестирования способности различных соединений предотвращать или лечить кожные заболевания, повреждения или травмы. Чем меньше толщина или складка эпидермиса, тем более эффективным является лечение. Как это видно из примеров, активное соединение PTER или любая их приемлемая соль могут быть использованы для изготовления местной композиции для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. Более того, как будет объяснено ниже, в некоторых анализах комбинация активных соединений PTER и QUER или любых его приемлемых солей проявляет синергический эффект, усиливающий функцию каждого активного соединения, взятого в отдельности. Следовательно, термин "синергический", используемый в контексте настоящего изобретения, означает, что суммарный терапевтический эффект комбинации PTER и QUER или любой их приемлемой соли, при их использовании в качестве комбинированной терапии для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, вызванных воздействием излучения, выше, чем терапевтические эффекты указанных активных соединений, когда каждое из них вводят отдельно.

Как показано в примерах, определяли толщину кожной складки. На фигуре 1 показано, что комбинация PTER+QUER, а также отдельно используемый PTER являются более эффективными в качестве фотопротектора, когда их наносят до воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы: Vichy (VICHY Capital Soleil 50+ UVB+UVA), Heliocare (Heliocare ultra 90 UVB/UVA) и Isdin (ISDIN Extrem 40 high protection UVA and UVB), причем использование комбинации PTER + QUER приводит к несколько лучшим результатам. Указанные 3 коммерческих крема используются для сравнения эффектов на протяжении всего описания настоящей заявки. Кроме того, на протяжении всего описания настоящей заявки, для сравнения с эффектами PTER и PTER+QUER, в одних и тех же условиях анализа, используется также и RESV. RESV был описан ранее как хемопротективное средство от рака кожи (Moammir Hasan Aziz, Shannon Reagan-Shaw, Jianquiang Wu, B. Jack Longley and Nihal Ahmad; FASEB J. express article 10.1096 (2005): 1-18). На фигуре 1 показано, что отдельно используемый PTER, а также комбинация PTER + QUER являются более эффективными в их солнцезащитном действии на кожу, когда их наносят либо до, либо после воздействия УФ-B, чем RESV.

Следовательно, либо комбинация PTER + QUER, либо отдельно используемый PTER могут быть эффективно использованы для предотвращения кожных заболеваний, вызванных солнечным излучением. В особенности PTER, поглощающий УФ-B-компонент такого излучения, но также и QUER (см. фигуру 13), который также дополнительно имеет спектр поглощения в области длин волн, соответствующих компоненту УФ-A солнечного излучения, отчасти ответственны также и за [защиту от] канцерогенеза вследствие воздействия (солнечного) излучения. Поэтому синергический эффект комбинации PTER+QUER наблюдали и в некоторых из анализов, представленных в настоящем описании.

Кроме того, на фигуре 1 показано также, что комбинация PTER+QUER является более эффективной в лечении кожных заболеваний, повреждений и травм, вызванных излучением, когда ее наносят после воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin), а также чем при отдельном нанесении PTER. Следовательно, комбинация PTER+QUER может быть эффективна в лечении кожных заболеваний, повреждений и травм, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Как показано в примерах, производили измерение толщины эпидермиса перед облучением (24 часа). На фигуре 2 показано, что использование PTER, отдельно или в сочетании с QUER, является более эффективным в качестве фотопротектора, при его нанесении до воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin). Следовательно, PTER, отдельно или в сочетании с QUER, может быть эффективно использован в профилактике кожных заболеваний, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Более того, на фигуре 2 также показано, что комбинация PTER+QUER, или же отдельное использование PTER, при их нанесении после воздействия УФ-B, являются более эффективными в лечении кожных заболеваний, повреждений и травм, вызванных излучением, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin), при этом комбинация PTER+QUER дает несколько лучшие результаты. Следовательно, комбинация PTER+QUER, также как и отдельно PTER, могут быть эффективно использованы для лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, вызванных B-ультрафиолетовым излучением.

Как показано в примерах, производили измерение толщины эпидермиса перед облучением (1 неделя). На фигуре 3 показано, что отдельное применение PTER, когда его наносят до воздействия УФ-B, является более эффективным в качестве фотопротектора, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin). Следовательно, отдельное использование PTER может быть эффективным для профилактики кожных заболеваний, повреждений и травм, вызванных B-ультрафиолетовым излучением. Более того, на фигуре 3 также показано, что комбинация PTER+QUER и отдельное использование PTER, при их нанесении после воздействия УФ-B, являются более эффективными в лечении кожных заболеваний, повреждений и травм, вызванных излучением, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin), при этом комбинация PTER+QUER дает наилучшие результаты. Следовательно, комбинация PTER+QUER, также как и отдельно PTER, могут быть эффективно использованы при лечении кожных заболеваний, повреждений и травм, вызванных B-ультрафиолетовым излучением.

Следовательно, первое воплощение настоящего изобретения относится к PTER, необязательно в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с его использованием для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к PTER, необязательно в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, также и в связи с его использованием для профилактики и/или лечения рака кожи. Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с его использованием для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с его использованием для профилактики и/или лечения рака кожи. Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с его использованием для лечения кожных заболеваний, вызванных воздействием излучения. Другое предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с его использованием для профилактики и/или лечения дерматоза или псориаза. Указанное выше применение является предпочтительным при местном введении.

Второе воплощение настоящего изобретения относится к PTER, необязательно в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению PTER, необязательно в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения рака кожи. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения рака кожи. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для лечения кожных заболеваний, вызванных воздействием излучения. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к применению PTER в сочетании с QUER, или к любой его приемлемой соли, в связи с изготовлением фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения дерматоза или псориаза. Предпочтительными фармацевтическими композициями являются фармацевтические композиции, изготовленные для местного введения.

Третье воплощение настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для местного введения, содержащей PTER, и, более предпочтительно, изготовленной в виде липосом. В предпочтительном воплощении такая фармацевтическая композиция включает в себя PTER, составленный в сочетании с QUER. В предпочтительном воплощении такая фармацевтическая композиция составлена в виде композиций (крема или лосьона) для загара или после загара.

Четвертое воплощение настоящего изобретения относится к процессу изготовления липосомальных композиций, включающих в себя растворение активного соединения PTER или любой его приемлемой соли и лецитина в органическом растворителе, выпаривание растворителя, добавление буфера PBS, сбор образованных липосом и обработку их ультразвуком, растворение 1:1 стабилизатором эмульсий, предпочтительно, карбомером, а более предпочтительно, карбополом, необязательно с добавлением консерванта, предпочтительно, фенонипа. В предпочтительном воплощении процесс изготовления липосомальных композиций включает в себя также растворение на первой стадии QUER или любой его приемлемой соли, в сочетании с PTER. Карбопол является карбомером. Карбомер также является родовым наименованием синтетических полимеров акриловой кислоты, используемых в качестве стабилизаторов эмульсий или загустителей в фармацевтических и косметических продуктах. Они могут быть гомополимерами акриловой кислоты, поперечно сшитыми с простым аллиловым эфиром пентаэритритола, простым аллиловым эфиром сахарозы или простым аллиловым эфиром пропилена.

Фенонип представляет собой прозрачную жидкость консерванта, которая применяется и функционирует во многих областях. Он уникален тем, что он растворим в масле и диспергирует в воде. Указанный консервант особенно эффективен, когда он используется в сочетании с продуктами на основе масел, но при этом также исключительно эффективен и в водных растворах. Это означает, что он будет функционален также в продуктах наподобие бальзамов и мазей, которые содержат только масла. Фенонип способен, кроме того, выдерживать температуру в более широком интервале. Тесты показали, что он может быть нагрет до температуры стерилизации, не утрачивая при этом своих свойств в качестве консерванта. Он функционален в широких пределах pH, в интервале от 3 до 8. Норма его потребления варьирует от 1% до 3% общего веса композиции (в зависимости от назначения). Фенонип состоит из - и должен быть отнесен к классу - феноксиэтанола, метилпарабена, этилпарабена, бутилпарабена, пропилпарабена.

Пятое воплощение настоящего изобретения относится к способу профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, который включает в себя введение PTER, необязательно в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения рака кожи, который включает в себя введение PTER, необязательно в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, который включает в себя введение PTER в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, который включает в себя введение PTER в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения рака кожи, который включает в себя введение PTER в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения кожных заболеваний, вызванных воздействием излучения, который включает в себя введение PTER в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения дерматоза или псориаза, который включает в себя введение PTER в сочетании с QUER, или любой его приемлемой соли. Более предпочтительно, чтобы способ согласно изобретению был связан с местным нанесением.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Фигура 1. Приведена толщина кожной складки (%) мышей, обработанных разными композициями до (левая колонка) или после (правая колонка) воздействия УФ-B. Коммерческие кремы (Vichy, Heliocare -Helio- и Isdin). Контроль+УФВ= Контроль, облученный без какой-либо обработки; Контроль липосомы+УФВ= Облученный контроль, в котором используются одни только липосомы (не содержащие какого-либо активного соединения). RESV=Ресвератрол; P+Q=PTER+QUER.

Фигура 2. Приведена толщина (мкм) эпидермиса, обработанного разными композициями (за 24 часа) до (левая колонка) или (через 24 часа) после (правая колонка) воздействия облучением. Коммерческие кремы (Vichy, Heliocare -Helio- и Isdin). Контроль= Без облучения, без обработки; Контроль+УФВ=Контроль облученных без какой-либо обработки; Контроль липосомы +УФВ=Облученный контроль, в котором используются одни только липосомы (не содержащие какого-либо активного соединения). RESV=Ресвератрол; P+Q=PTER+QUER.

Фигура 3. Приведена толщина (мкм) эпидермиса, обработанного разными композициями до (левая колонка) или после (правая колонка) воздействия облучением (1 неделя). Коммерческие кремы (Vichy, Heliocare -Helio- и Isdin). Контроль липосомы +УФВ= Облученный контроль, в котором используются одни только липосомы (не содержащие какого-либо активного соединения). RESV= Ресвератрол; P+Q=PTER+QUER.

На всех фигурах 1-3 звездочки * на столбчатой гистограмме означают, что различия являются статистически значимыми (P < 0,05) по отношению к контрольным значениям.

Фигура 4. Показано увеличение толщины кожной складки по отношению к таковой в день 0 (через 1 неделю после предварительного воздействия TNCB и в начале длительного воздействия в другие дни), в испытании, связанном с индукцией экспериментального атопического дерматита под действием TNCB.

Фигура 5. Показана потеря трансдермальной жидкости через 24 часа после 4^го воздействия TNCB, в испытании, связанном с индукцией экспериментального атопического дерматита под действием TNCB.

Фигура 6. Показаны повреждения через 24 часа после 4^го воздействия TNCB, в испытании, связанном с индукцией экспериментального атопического дерматита под действием TNCB.

Фигура 7. Иллюстрация разработанного протокола испытания, связанного с индукцией экспериментального атопического дерматита под действием TNCB.

Фигура 8. Показано увеличение толщины кожной складки по отношению к таковой в день 0 обработки TPA [12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат], в испытании, связанном с индукцией экспериментального псориаза под действием TPA.

Фигура 9. Показана потеря трансдермальной жидкости (TEWL) через 24 часа после 7^го воздействия TPA, в испытании, связанном с индукцией экспериментального псориаза под действием TPA.

Фигура 10. Показано развитие повреждений при воздействии TPA, в испытании, связанном с индукцией экспериментального псориаза под действием TPA.

A. Изображение мыши через 24 часа после 3-дневных воздействий 2 нмолями TPA;

B. Изображение той же самой мыши через 24 часа после 6-дневных воздействий 2 нмолями TPA;

C. Изображение подлинного псориаза на пальце пациента (изображение, взятое из дерматологического атласа);

D. Изображение подлинного псориаза на колене пациента (изображение, взятое из дерматологического атласа).

Фигура 11. Показан разработанный протокол испытания, связанного с индукцией экспериментального псориаза под действием TPA.

Фигура 12. Показан разработанный протокол испытания, связанного с индукцией экспериментальной гиперчувствительности в результате контакта с оксазолоном.

Фигура 13. Показана абсорбция полифенолов, в частности, спектр поглощения разных 1 мМ растворов каждого из полифенолов (PTER, ресвератрол и QUER), в чистом этаноле, в испытании, связанном с оценкой механической фильтрующей способности полифенолов.

Фигура 14. Показано состояние мышей после хронического воздействия УФ-B, в испытании, связанном с оценкой фотопротекторной (или солнцезащитной) роли полифенолов. Представлена фотография различных экспериментальных групп через 25 недель хронического воздействия 180 мДж/см² (три раза в неделю). Ссылочные соединения и соединения, испытываемые в настоящем исследовании (10 мкмолей/мышь полифенолов или 200 мкл каждого из фотопротекторов), наносили на спину мышам за 20 минут до того, как их подвергали воздействию УФ-B.

Фигура 15. Показано развитие повреждений при воздействии TPA, в испытании, связанном с оценкой фотопротекторной роли полифенолов. Первые признаки предраковых поражений диаметром более чем 1 мм в различных экспериментальных группах через 30 недель после хронического воздействия 180 мДж/см² (три раза в неделю). Ссылочные соединения и соединения, испытываемые в настоящем исследовании (10 мкмолей/мышь полифенолов или 200 мкл каждого из фотопротекторов), наносили на спину мышам за 20 минут до того, как их подвергали воздействию УФ-B.

Фигура 16. Приведена патологоанатомическая картина исследования кожи после хронического воздействия УФ-B. Патологоанатомическая оценка гистологических срезов ткани мышей через 30 недель после хронического воздействия 180 мДж/см² (три раза в неделю). Ссылочные соединения и соединения, испытываемые в настоящем исследовании (10 мкмолей/мышь полифенолов или 200 мкл каждого из фотопротекторов), наносили на спину мышам за 20 минут до того, как их подвергали воздействию УФ-B.

Фигура 17. Представлена толщина кожной складки после продолжительного лечения, в испытании, связанном с оценкой влияния различных полифенолов на дерматит. Лечение состояло в ежедневном нанесении на одну треть поверхности спины мышей по 10 мкмолей/мышь полифенолов и 0,5 мкмолей/мышь дексаметазона в течение 6 дней подряд. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом. *p>0,001 по отношению к контролю. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 18. Представлены гистологические срезы, соответствующие различным условиям эксперимента в испытании, связанном с оценкой возможностей защиты от повреждающего воздействия излучения УФ-B. Обработку (10 мкмолей/мышь полифенолов или 200 мкл каждого из фотопротекторов) осуществляли за 20 минут до или после УФ-B-облучения мощностью 360 мДж/см². На данной фигуре показаны изменения в толщине эпидермиса.

Фигура 19. Показано увеличение толщины кожной складки через 24 часа после первого введения TNCB, в испытании, связанном с оценкой возможностей защиты в экспериментальной модели атопического дерматита, индуцированного под действием TNCB. Обработку (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмолей/мышь дексаметазона) осуществляли за 24 часа до (день 0) нанесения 1% TNCB мыши, предварительно сенсибилизированной 1% TNCB. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом. *p>0,05 по отношению к контролю. ⁺p>0,05 по отношению к контролю, обработанному TNCB. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 20. Представлены результаты оценки повреждений у мышиных моделей атопического дерматита, в испытании, связанном с макроскопической оценкой повреждений. Обработку (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмолей/мышь дексаметазона) осуществляли за 24 часа до нанесения 100 мкл 1% TNCB каждой мыши, предварительно сенсибилизированной 1% TNCB. Измерение потерь воды при эпидемическом переносе (TEWL) оценивали с помощью системы Tewameter system TM 210 (CK electronics, Германия). *p>0,05 по отношению к контролю. ⁺p>0,05 по отношению к контролю, обработанному пустыми липосомами. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 21. Оценка мышиных моделей атопического дерматита, в испытании, связанном с макроскопической оценкой повреждений. Обработку (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмолей/мышь дексаметазона) осуществляли за 24 часа до нанесения 100 мкл 1% TNCB каждые 2 часа каждой мыши, предварительно сенсибилизированной 1% TNCB, вплоть до 4 аппликаций TNCB.

Фигура 22. Показано увеличение толщины кожной складки через 24 часа после введения оксазолона, в испытании, связанном с оценкой возможностей защиты на модели контактной гиперчувствительности, индуцированной оксазолоном. Лечебные аппликации (1 мкмоль/мышь полифенолов, 20 мг дипрозона) осуществляли за 24 часа до (день 0) нанесения 20 мкл 2,5% оксазолона в этаноле на уши мышей, предварительно сенсибилизированных оксазолоном. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом, и рассчитывали увеличение толщины складки по отношению к таковой на день 0. *p>0,05 по отношению к контролю, обработанному оксазолоном; ⁺p>0,05 по отношению к контролю, обработанному дипрозоном перед аппликацией оксазолона. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 23. Приведена оценка увеличения толщины кожной складки в процессе эксперимента по отношению к таковой на день 0, в испытании, связанном с возможностью защиты против псориаза, индуцированного у мышиных моделей под действием TPA. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь. Такой порядок нанесения повторяли в течение 6 дней подряд. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом, и рассчитывали увеличение толщины складки по отношению к таковой на день 0.

Фигура 24. Продемонстрировано увеличение толщины кожной складки через 24 часа после первого нанесения TPA, в испытании, связанном с возможностью защиты против псориаза, индуцированного у мышиных моделей под действием TPA. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом, и рассчитывали увеличение толщины складки по отношению к таковой на день 0. *p>0,05 по отношению к контролю. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 25. Приведена толщина кожной складки через 24 часа после третьего введения TPA, в испытании, связанном с возможностью защиты против псориаза, индуцированного у мышиных моделей под действием TPA. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь. Толщину кожной складки измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом, и рассчитывали увеличение толщины складки по отношению к таковой на день 0. *p>0,05 по отношению к контролю; ⁺p>0,05 по отношению к группе TNCB. После ANOVA применяли критерий Тьюки.

Фигура 26. Приведена макроскопическая картина кожи мышиных моделей псориаза, в испытании, связанном с возможностью защиты против псориаза, индуцированного у мышиных моделей под действием TPA. Фотографии сделаны (A) через 24 часа после введения TPA и (B) через 24 часа после 7-дневного введения TPA. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь.

Фигура 27. Приведена оценка экскориации через 24 часа после семикратного введения TPA, в испытании, связанном с возможностью защиты против псориаза, индуцированного у мышиных моделей под действием TPA. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь. Количественную оценку экскориации кожи производили по шкале 0-3, согласно которой 0 означает ее отсутствие; 1 - слабую; 2 - умеренную; 3 - сильную. И средний показатель для каждой из групп указывал на степень воспаления.

Фигура 28. Гистологический анализ псориатического процесса. Лечебные аппликации (10 мкмолей/мышь полифенолов, 0,5 мкмоль/мышь дексаметазона) осуществляли за 30 минут до нанесения TPA в количестве 2 нмолей/мышь. Микроскопическая картина 5- микромолярного среза, с окрашиванием гематоксилином-эозином, кожи мышей через 24 часа (A.) и через 72 часа (В.) после 7-дневного введения 2 нмолей TPA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исследования по оценке способности композиций согласно изобретению предотвращать кожные заболевания (такие как рак кожи), вызванные В-ультрафиолетовым излучением, были выполнены в режиме острого облучения в дозе 360 мДж/см².

Протокол воздействия УФ-B-излучением.

Для реализации воздействия УФ-B-излучением использовали специально усовершенствованную камеру (сшиватель, оснащенный 5 лампами, 80% излучения которых составляет УФ-B, с максимумом испускания при 312 нм).

Протоколы острого воздействия УФ-B-излучением были следующими: мышей подвергали однократному излучению мощностью в 360 мДж/см². Исследование проводили через 24 часа после воздействия. Такой протокол использовали для оценки фотозащитного эффекта исследуемых соединений. В соответствии с тем же самым протоколом острой фазы, облучали мышей из всех групп. Впоследствии мышей на неделю оставляли на месте их прежнего содержания, чтобы проследить за развитием воспалительной реакции и эдемы.

Введение и дозировка исследуемых соединений.

Для исследования воздействия УФ-B (хронического или острого) осуществляли местное воздействие на область спины мышей. Коммерческие солнцезащитные фильтры (кремы или лосьоны от загара) наносили непосредственно на [спину] мыши. Полифенолы в данном исследовании вводили в составе препарата липосом, разбавленного 1:1 полимером карбополом, который для указанных липосом будет служить носителем. Каждая вводимая доза полифенола составляла 10 мкмолей/мышь, в виде свободной кислоты.

Параметры-показатели повреждения кожи.

1. Образование эдемы: толщину кожной складки определяли с помощью штангенциркуля через 24 часа после первого воздействия.

2. Изучение толщины эпидермиса после острого воздействия облучением (360 мДж/см² через 24 часа и через 7 дней после облучения).

3. Гистологические исследования: измерение на картине, полученной при гистологических срезах, толщины эпидермиса.

Гистологические исследования.

Для исследований острого воздействия образцы кожи брали со спины мышей. Полученные образцы фиксировали 4% параформальдегидом (24 часа) и погружали в парафин. В дальнейшем срезы образцов окрашивали гематоксилином и эозином.

Изучение спектра поглощения различных соединений.

1 мМ раствор каждого из полифенолов (PTER, ресвератрола и QUER) получали в абсолютном этиловом спирте (высококачественного, удовлетворяющего требованиям ВЭЖХ; Quima), и на установке Multiskan Spectrum (Thermo Scientific) изучали спектр поглощения в интервале от 200 до 800 нм.

Способ осуществления фотоканцерогенеза (хроническое воздействие излучения УФ-B).

Роль УФ-B-излучения в образовании опухолей хорошо известна. Продолжительное воздействие УФ-B вызывает окислительный/нитрозативный стресс, с изменениями в ДНК, белках и пр., которые активируют различные факторы транскрипции (помимо прочих, NF-KB и AP-1), увеличивают теломеразную активность, стресс и т.п., что, в свою очередь, вызывает канцерогенез.

Кроме того, воздействие УФ-B повышает экспрессию и уровни антиапоптотических белков, что коррелирует с повышением пролиферации и определенных маркеров воспаления.

Мышами, выбранными для данного исследования, были мыши SKH-1. У таких мышей повышен риск развития опухолей после хронического воздействия низкими дозами УФ-излучения (сравнимыми с воздействием, которое человек испытывает повседневно).

Использованным протоколом был стандартизированный протокол, в соответствии с которым нескольких мышей облучали три раза в неделю в дозе 180 мДж/см² в течение 24 недель; однако в процессе испытания протокол модифицировали, удлиняя время воздействия вплоть до 28 недель, чтобы получить более убедительный фотопротекторный эффект различных используемых здесь лечебных воздействий.

Доза воздействия составляла 180 мДж/см², поскольку в предшествующих испытаниях было определено, что для данного вида грызунов это является дозой, вызывающей минимальное покраснение кожи (MED, minimal erythemic dose).

В данное исследование был включен целый ряд различных коммерческих фотопротекторов:

- Vichy: Capital Soleil SPF-50+ (Vichy Laboratoires).

- Isdin: Фотопротектор Isdin Extrem (SPF-40 (Isdin SA)

- Heliocare: Heliocare gel Protection Ultra 90 (Difa Cooper S.P.A.)

Как ссылочные соединения, так и соединения согласно изобретению наносили на кожу спины мышей за 20 минут до того как их подвергали воздействию УФ-B.

Для данной оценки использовали следующие группы мышей, по 20 мышей в каждой:

- Не обработанные.

- Ссылочное соединение Vichy, до воздействия УФ-B: 200 мкл Vichy наносимых за 20 минут до облучения.

- Ссылочное соединение Isdin, до воздействия: 200 мкл Isdin, наносимых за 20 минут до облучения.

- Ссылочное соединение Heliocare, до воздействия: 200 мкл Heliocare, наносимых за 20 минут до облучения.

- Среда, до воздействия: 200 мкл вакуумированных липосом, наносимых за 20 минут до облучения.

- Ресвератрол, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих ресвератрол (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- PTER, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих PTER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- QUER, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих QUER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- PTER+QUER, до воздействия УФ-B: 200 мкл липосом, содержащих PTER+QUER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

УФ-B за короткое время вызывает эдему и покраснение (эритему). Такое воспаление является критичным для процесса гиперпролиферации. Клетки кожи, подвергнутые УФ, имеют более высокие уровни ядерного фактора транскрипции NF-κB, этот фактор, в числе прочих, контролирует выход COX-2 и iNOS, и именно поэтому УФ-B является очевидной причиной кожного воспаления.

С целью установления эффектов исследуемых фотопротективных соединений, самок мышей SKH-1 в возрасте от 6 до 8 недель подвергали однократному воздействию 360 мДж/см².

Для того, чтобы воздействовать B-ультрафиолетовым (УФ-B) облучением, использовали специальным образом устроенную камеру, имеющуюся в лаборатории авторов настоящего изобретения (Crosslinker; Bio-Link BLX 254), оборудованную 5 лампами, 80% излучения которых составляет УФ-B, с максимумом испускания при 312 нм).

Использовали два протокола воздействия УФ-B-излучением:

- Интенсивное воздействие в результате однократного облучения в 360 мДж/см². Исследование проводили через 24 часа после указанного воздействия. Такой протокол использовали для оценки фотозащитного эффекта исследуемых соединений.

- Интенсивное воздействие в результате однократного облучения в 360 мДж/см². Исследование проводили через 1 неделю после указанного воздействия. В течение недели мышей держали под навесом, изучая развитие процесса воспаления и эдематозной реакции.

Для сравнения было использовано несколько коммерческих солнцезащитных продуктов (Vichy, Isdin и Heliocare). Ссылочные соединения, также как и продукты согласно настоящему изобретению, наносили на кожу спины мышей через 20 минут после или за 20 минут до УФ-B-облучения, чтобы определить, обусловлена ли наблюдаемая реакция действием солнцезащитного фильтра.

Для такой оценки группами, по 5 мышей в группе, служили следующие:

- Не обработанные.

- Ссылочное соединение Vichy, до воздействия УФ-B: 200 мкл Vichy, наносимых за 20 минут до облучения.

- Ссылочное соединение Vichy, после воздействия УФ-B: 200 мкл Vichy, наносимых через 20 минут после облучения.

- Ссылочное соединение Isdin, до воздействия: 200 мкл Isdin, наносимых за 20 минут до облучения.

- Ссылочное соединение Isdin, после воздействия: 200 мкл Isdin, наносимых через 20 минут после облучения.

- Ссылочное соединение Heliocare, до воздействия: 200 мкл Heliocare, наносимых за 20 минут до облучения.

- Ссылочное соединение Heliocare, после воздействия: 200 мкл Heliocare, наносимых через 20 минут после облучения.

- Среда, до воздействия: 200 мкл вакуумированных липосом, наносимых за 20 минут до облучения.

- Среда, после воздействия: 200 мкл вакуумированных липосом, наносимых через 20 минут после облучения.

- Ресвератрол, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих ресвератрол (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- Ресвератрол, после воздействия: 200 мкл липосом, содержащих ресвератрол (всего 10 мкмолей), наносимых через 20 минут после облучения.

- PTER, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих PTER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- PTER, после воздействия: 200 мкл липосом, содержащих PTER (всего 10 мкмолей), наносимых через 20 минут после облучения.

- QUER, до воздействия: 200 мкл липосом, содержащих QUER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- QUER, после воздействия: 200 мкл липосом, содержащих QUER (всего 10 мкмолей), наносимых через 20 минут после облучения.

- PTER+QUER, до воздействия УФ-B: 200 мкл липосом, содержащих PTER+QUER (всего 10 мкмолей), наносимых за 20 минут до облучения.

- PTER+QUER, после воздействия УФ-B: 200 мкл липосом, содержащих PTER+QUER (всего 10 мкмолей), наносимых через 20 минут после облучения.

Через 24 часа или через 1 неделю после проведения различных обработок мышей забивали, и их кожу фиксировали, используя 4% PFA [формальдегид в PBS].

Толщина ушей.

Отек (эдему) рассчитывали в виде разницы между толщиной ушей до наступления реакции и их толщиной через 24 часа после воздействия, при этом указанную толщину измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом. Полученное изменение выражали в виде относительного прироста по сравнению с днем 0.

Макроскопическая оценка кожи.

Мышей осматривали ежедневно на предмет обнаружения каких бы то ни было изменений внешнего вида кожи или каких бы то ни было изменений общего порядка.

Кроме того, в определенные дни до забоя мышей их состояние оценивал ветеринарный врач, который изучал их на предмет выявления кожных повреждений, а также следующих изменений:

- Эритемы: покраснения кожи, обусловленного воспалением за счет избыточного прилива крови в результате расширения кровеносных сосудов.

- Экскориации, или раздражения кожи, с образованием чешуйчатости за счет усиленного сдирания ее при расчесывании, что может привести в результате к гиперкератозу.

- Глубины повреждения, которая может достичь дермы, вызывая отеки или язвы.

Каждую переменную оценивали по шкале 0-4, согласно которой 0 означает отсутствие [изменений]; 1 - слабые; 2 - умеренные; 3 - значительные, а 4 - очень сильные. Добавление трех показателей для каждой группы мышей указывало на степень воспаления.

В процессе фотоканцерогенеза отслеживали наличие различных опухолей, и в течение всего периода развития указанного процесса осуществляли их количественную оценку. Повреждением считалось любое повреждение размером более 1 мм в диаметре. Микроскопический анализ.

Для изучения на микроскопическом уровне кожных тканей при различных воздействиях были использованы гистохимические технологии.

Указанные ткани фиксировали в 4% формальдегиде в PBS в течение 24 ч. при 22°C. После того как ткани были зафиксированы, их подвергали дегидратации в больших количествах этанола и помещали в смесь гидрофобного вещества и ксилена, способствующую проникновению парафина в ткани, чтобы обеспечить консистенцию, необходимую для осуществления тонких срезов микротомом.

Парафинированные образцы обрабатывали микротомом, с получением тонких срезов толщиной в 5-10 мкм. Полученные образцы распределяли на поверхности капли желатина при 37°C и собирали в виде желатинизированных препаратов для микроскопии.

Другие процедуры требовали удаления парафина при температурах выше 60°C, с промыванием образцов ксиленом и регидратацией их этанолом.

Гематоксилин представляет собой катионное красящее вещество, тогда как эозин является катионным красящим веществом, относящимся к ксантенам. Следовательно, ядро окрашивается в голубой, а цитоплазма в розовый цвет.

Для окрашивания указанных образцов был использован следующий протокол:

1. Инкубация с гематоксилином Мейера в течение 10-15 минут.

2. Промывание в проточной воде до голубоватого оттенка.

3. Инкубация с эозином (1%) в течение 2-4 минут.

4. Удаление оставшегося эозина в 70° этаноле.

5. Дегидратация.

6. Ополаскивание в ксилоле в течение 3 минут.

7. Высушивание подносов с образцами в сушильной установке при 37°C.

Статистический анализ.

Результаты выражали в виде средних значений ± стандартное отклонение. Стандартное отклонение представляли в виде планок погрешностей, а в некоторых случаях, в целях упрощения графиков, представляли в виде полу-планок погрешностей. Полученные данные, в случае необходимости, анализировали на основе вариаций (ANOVA) одного или нескольких факторов или тестов. Однородность вариантов анализировали с помощью теста Левена. Нулевая гипотеза была принята для всех значений тестов, при которых значение F не являлось значимым при значениях p, превышающих 0,05. Данные, для которых значение оказалось значимым, подвергали анализу с использованием критерия Тьюки, со значением p, составляющим 0,05.

Используемыми компьютерными программами были программа Excel для осуществления расчетов и построения графиков, а для статистического анализа - SPSS-версия 14.0 для Windows (SPSS Inc), на использование которых Университет Валенсии имеет лицензию пользователя.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Экспериментальные модельные животные

В качестве экспериментальных животных использовали штамм мышей SKH-1, предоставленный компанией Charles River. Это безволосые иммунокомпетентные мыши. Экспериментальные группы были образованы из самок мышей в возрасте от 3 до 4 недель, как показано в таблице 2. Каждая экспериментальная группа фотопротекции состояла из 5-6 животных. В этих исследованиях каждая экспериментальная группа состояла из 20 мышей.

Таблица 2 ГРУППА НАЗВАНИЕ ОБРАБОТКА ВОЗДЕЙСТВИЕ УФ-B I Отрицательный
контроль Липосомальный
носитель Нет воздействия IIt УФ-Ba Липосомальный
носитель Через 20 мин после обработки IIa УФ-Bb Липосомальный
носитель За 20 мин до обработки IIIt RESa Липосомы RES Через 20 мин после
обработки IIIa RESb Липосомы RES За 20 мин до обработки IVt PTERa Липосомы PTE Через 20 мин после
обработки IVa PTERb Липосомы PTER За 20 мин до обработки Vt QUERa Липосомы QUER Через 20 мин после
обработки Va QUERb Липосомы QUER За 20 мин до обработки VIt (PTER+QUER)a Липосомы PTER+QUER Через 20 мин после
обработки VIa (PTER+QUER)b Липосомы PTER+QUER За 20 мин до обработки VIIt ISDINa   Через 20 мин после
обработки VIIa ISDINb   За 20 мин до обработки VIIIt HELICAREa   Через 20 мин после
обработки VIIIa HELIOCAREb   За 20 мин до обработки IXt VICHYa   Через 20 мин после
обработки IXa VICHYb   За 20 мин до обработки b означает "до"
a означает "после"

Более того, испытания in vivo были предприняты на 4-недельных голых самках мышей SKH1-E от компании Charles River или на 6-8-недельных мышах BALB/c. Исследования проводились в Университете Валенсии, при Центральной Службе Поддержки Экспериментальных Исследований (CSSER, Central Support Service of Experimental Research) в области экспериментов на животных из службы животноводческого производства, за исключением исследований, предпринятых Нидерландской Организацией TNO Quality of Life (Leiden, Netherlands), по гиперчувствительности к оксазолину.

Сразу же после акклиматизации животных в течение 2-недельного периода, эксперименты предпринимали в помещениях, экипированных защитными барьерами, в контролируемых условиях, при температурах 22±2°C, относительной влажности 65-80%, 12-кратных проветриваниях помещения/час и длиной светового и темнового периодов в 12/12 часов, в соответствии с принятым в настоящее время международным соглашением [Директива Совета Европейского Сообщества (86/609, OJ L 358. 1, 12 декабря 1987), Национального Института Здоровья (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publ. No. 85-23, 1985, USA)].

Животных забивали путем смещения шейных позвонков. Образцы для гистологического исследования брали из задней четверти туловища и фиксировали в 4% формальдегиде в течение ночи. Части образцов содержали в жидком N₂ для процедур интенсивного УФ-B-воздействия и для последующей оценки воспаления и окислительного/нитрозативного стресса. Впоследствии отбирали 20 мкл крови и добавляли их к 80 мкл N-этилмалеимида (NEM).

100 мкл 4%-й перхлорной кислоты (PCA) добавляли после инкубации, проводимой приблизительно в течение 10 минут. Образцы хранили во льду после интенсивного встряхивания. В конце все образцы центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут при 4^о C. Супернатанты собирали и хранили при -20^о C вплоть до момента определения отношения GSH (восстановленная форма глутатиона)/GSSG (окисленная форма глутатиона). Отношение GSH/GSSG является параметром, который отражает внутриклеточный окислительно-восстановительный статус, и, в частности, внутриклеточный статус тиолов. Следовательно, изменения в указанном отношении используются для оценки окислительного стресса.

Четыре образца кожи брали из задних четвертей туловища. Один для гистологического анализа (фиксировали в течение ночи в 4% формальдегиде), а 3 замораживали в жидком азоте для биохимических анализов.

Пример 2. Получение липосом

Вне зависимости от конкретного полифенола (полифенолов), всегда использовали следующую методологию получения липосом: соевый лецитин; дихлорметан в качестве органического растворителя в случае PTER и/или QUER и этиловый эфир в качестве органического растворителя в случае ресвератрола, в силу того что он не растворяется в дихлорметане. Выпаривание органического растворителя осуществляли с помощью роторного испарителя, соединенного с вакуумным [насосом], и при температуре 40°C. После удаления органического растворителя липосомы ресуспендировали в PBS, разбавленном до концентрации 1 мМ. В конечной концентрации липосом, до добавления карбопола, концентрация каждого из полифенолов, определяемая методами ВЭЖХ/ тандемной масс-спектрометрии, составляла 20 мкМ полифенолов.

Стадии получения липосом могут быть суммированы следующим образом:

1. Взвешивание полифенола и лецитина

2. Растворение полифенола и лецитина в 40 мл дихлорметана (в случае PTER и/или QUER) или 140 мл этилового эфира (в случае ресвератрола).

3. Внесение раствора в резервуар роторного испарителя и присоединение к устройству. Сразу же после испарения всего растворителя отключение вакуума и выжидание в течение 15 минут, чтобы удалить все остатки растворителя, которые могли возникнуть.

4. Добавление 20 мл разбавленного PBS (1 мМ) в резервуар роторного испарителя и повторное присоединение к устройству, но на этот раз без вакуума.

5. Сбор образовавшихся липосом в 50-мл трубку.

6. Обработка липосом ультразвуком (6 секунд, 25 циклов, с интервалом между циклами в 3 секунды; с высокой интенсивностью).

7. Разбавление 1:1 карбополом (конечная концентрация 10 мкмолей/200 мкл).

8. Во избежание возможного загрязнения, добавление фенонипа (6 мл фенонипа на 1000 мл препарата).

Контрольные липосомы получали таким же образом, что и липосомы, содержащие PTER и QUER, с той только разницей, что они содержали лецитин (2,376 г).

Процедуры получения липосом проводились в лабораториях авторов изобретения в кооперации с Отделом по изучению коллоидов (Отделение Химии и Физики; Университет Валенсии).

Липосомы можно заполнять различными активными веществами, такими как полифенолы. В силу их способности проникать через кожу, они могут переносить указанные активные вещества на большие расстояния внутри кожи и останавливаться на определенном участке. Это является причиной того, почему липосомы могут быть использованы в дерматологической лечебной практике. Есть много продуктов, которые содержат полифенолы, которые образуются в зеленом чае (Replenix; Kaplan cosmetic Surgery Centers), и ресвератрол, который образуется в винограде (Resveraderm; SesDERMA Laboratorios).

Для получения липосом использовали смесь соевого лецитина; это природная смесь приблизительно из 90% фосфатидилхолина и других жирных кислот. Соевый лецитин (99% чистоты) производится компанией GUINAMA S.L (Валенсия, Испания).

Для растворения были использованы полярные органические растворители, такие как дихлорметан (Sigma) в случае PTER (CML Europe BV) и QUER (Sigma), и эфир (Sigma) в случае ресвератрола (Sigma).

Идеальная смесь для получения липосом содержала

- 5,9 (вес/объем) лецитина, 1,28 (вес/объем) PTER и 1,69 (вес/объем) QUER, растворенных в дихлорметане.

- 1,69 (вес/объем) лецитина и 1,15 (вес/объем) ресвератрола, растворенных в эфире.

Микроскопическая упаковка различных полифенолов достигалась путем дегидратации соевого лецитина при 40°C в вакуумном роторном испарителе, с последующей гидратацией раствором 1 мМ фосфата при pH 7 и при 20°C, с получением конечной концентрации 0,1 мМ каждого соединения в конечной концентрации. Липосомы стандартизировали в отношении размера частиц путем визуального контролирования морфологии через микроскоп. Концентрацию полифенолов в суспензии липосом количественно определяли методами ВЭЖХ/тандемной масс-спектрометрии.

Раствор стабилизировали карбополом 940 (Guinama) до степени разведения 1:1, добавляли 0,6% (объем/объем) противомикробного консерванта фенонипа (Guinama), в присутствии которого получали раствор липосом в концентрации 10 микромолей на каждый полифенол/200 мкл.

Введение липосом осуществляли путем нанесения и разглаживания гомогенной пленки крема на кожу спины мышей с помощью автоматической микропипетки.

Соединения наносили в соответствии с протоколом введения, описанным для каждой процедуры, а именно:

- Пустые липосомы: липосомы без наполнения.

- Липосомы, содержащие PTER: 1 мкмоль/20 мкл крема.

- Липосомы, содержащие QUER: 1 мкмоль/20 мкл крема.

- Липосомы, содержащие PTER+QUER: 1 мкмоль каждого из соединений/20 мкл крема.

- Липосомы, содержащие ресвератрол: 1 мкмоль/20 мкл крема.

Пример 3. Измерение толщины кожной складки через 24 ч после облучения

Кожную складку измеряли, создавая складку на коже от задней части мышей, от подмышечной области до бедер; складку измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом.

Увеличение толщины складки вычисляли по разнице между исходными значениями, полученными до наступления реакции, и толщиной в каждой точке.

На фиг. 1 представлены результаты, полученные при измерении толщины кожной складки задней четверти туловища мышей (когда были использованы различные типы обработок). Результаты подвергали статистическому анализу с помощью ANOVA и сопоставляли с результатами теста Тьюки и группировали в соответствии со значимыми различиями. Стандартные отклонения включены в фиг. 1. Как показано на фигуре 1, комбинация PTER+QUER, а также отдельно PTER, являются более эффективными в качестве фотопротекторов, когда их наносят до воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin) и чем RESV. Следовательно, либо сочетание PTER+QUER, либо отдельно PTER могут быть эффективно использованы для предотвращения кожных заболеваний, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Более того, на фигуре 1 показано также, что сочетание PTER + QUER или отдельно PTER могут быть эффективны в лечении кожных заболеваний, повреждений или травм, обусловленных излучением, когда их наносят после воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin) и чем RESV. Следовательно, сочетание PTER+QUER может быть эффективно использовано для лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Пример 4. Измерение толщины эпидермиса после облучения (24 часа).

Для измерения толщины эпидермиса была использована компьютерная программа Image J для оценки возможной гиперплазии, откалиброванная с помощью камеры Ньюбауэра, которая позволяет осуществлять измерения эпидермиса. Полученные результаты подвергали статистическому анализу с помощью ANOVA и сопоставляли с результатами теста Тьюки и группировали в соответствии со значимыми различиями. Как показано на фигуре 2, отдельное использование PTER является более эффективным в качестве фотопротектора, когда его наносят до воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin). Следовательно, отдельно PTER может быть эффективно использован в профилактике кожных заболеваний, повреждений и травм, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением. Более того, на фигуре 2 показано также, что сочетание PTER+QUER также может быть эффективным для лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, обусловленных излучением, когда его наносят после воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin) и чем RESV. Следовательно, сочетание PTER+QUER может быть эффективно использовано для лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением. Контроль в этом эксперименте означает отсутствие облучения и отсутствие лечения (обработки).

Пример 5. Измерение толщины эпидермиса после облучения (1 неделя)

Оценку толщины кожи осуществляли с помощью компьютерного программного обеспечения (IMAGE J). Полученные результаты подвергали статистическому анализу с помощью ANOVA и сопоставляли с результатами теста Тьюки и группировали в соответствии со значимыми различиями. Как показано на фигуре 3, отдельное использование PTER является более эффективным в качестве фотопротектора, когда его наносят до воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin). Следовательно, отдельно PTER может быть эффективно использован для профилактики кожных заболеваний, повреждений или травм, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Более того, на фигуре 3 показано также, что сочетание PTER + QUER является также более эффективным для лечения кожных заболеваний, повреждений или травм, обусловленных излучением, когда его наносят после воздействия УФ-B, чем коммерческие кремы (Vichy, Heliocare и Isdin) и чем RESV. Следовательно, сочетание PTER+QUER, также как и отдельно PTER, могут быть эффективно использованы для лечения кожных заболеваний, вызываемых B-ультрафиолетовым излучением.

Пример 6. Индукция экспериментального атопического дерматита под действием TNCB

Что касается средства "2-хлор-1,3,5-тринитробензол, или 2,4,6-тринитрохлорбензол" (TNCB), также известного под названием пикрил-хлорид, оно является химическим веществом, которое вызывает аллергический процесс, сопровождающийся у мышей воспалением кожи. Кроме того, продолжительное нанесение мази TNCB повышало продукцию T-лимфоцитов, мастоцитов и IgE в сыворотке, что также наблюдается среди людей-пациентов с атопическим дерматитом.

Для воспроизведения повреждений, возникающих при атопическом дерматите, были использованы протоколы, описываемые Matsumoto, согласно которым на спину мышам SKH-1 наносили 100 мкл раствора 1% TNCB в ацетоне [3 аппликации по 33 мкл (с помощью дозатора автоматической микропипетки), с тем, чтобы предотвратить распространение отека, и для поддержания большей локализации области повреждения].

В отличие от протоколов, описываемых Matsumoto, согласно которым обработка TNCB длилась 32 дня после первого периода тестирования TNCB, здесь был использован протокол, состоящий в одном тестировании TNCB, а неделю спустя - в [применении] 4 доз, с последующей обработкой TNCB каждые 2 дня. Более короткие протоколы вызывали увеличение толщины кожной складки, как показано на фигуре 4, поскольку при потере трансэпидермальной жидкости, как показано на фигуре 5, указанные повреждения ясно видны при обследовании на микроскопическом уровне, как показано на фигуре 6.

Таким образом, протокол, использованный для данной процедуры, представлял собой протокол, представленный на фигуре 7. В качестве стандартной обработки был использован дексаметазон (25 мМ раствор в ацетоне, от компании Sigma). Введение тестируемых продуктов и стандартную обработку проводили в разные дни, начиная за 24 часа перед первым продолжительным нанесением TNCB и после того как мышей подвергали воздействию TNCB (за 1 неделю до этого).

Группами для данной оценки, по 5 мышей на группу, были следующие:

- Не обработанные.

- Ссылочное соединение: 0,5 мкмолей дексаметазона (20 мкл 25 мМ раствора одного из продуктов в ацетоне).

- Среда: 200 мкл вакуумированных липосом.

- Ресвератрол: 200 мкл липосом, содержащих ресвератрол (всего 10 мкмолей).

- PTER: 200 мкл липосом, содержащих PTER (всего 10 мкмолей).

- QUER: 200 мкл липосом, содержащих QUER (всего 10 мкмолей).

- PTER+QUER: 200 мкл липосом, содержащих PTER+QUER (всего 10 мкмолей).

Через 24 часа (9-й день) после последнего проведения различных обработок мышей забивали, и их кожу фиксировали, используя 4% PFA [формальдегид в PBS].

Пример 7. Экспериментальная индукция псориаза под действием ТРА

Для индукции псориаза было использовано средство "12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат" (TPA). Средство "12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат" (TPA), обычно называемое также "форбол-12-миристат-13-ацетатом" (PMA), представляет собой сложный диэфир форбола и является сильным опухолевым промотором, используемым обычно в биомедицинских исследованиях для активации передачи сигналов через фермент протеинкиназу C (PKC).

Что касается дозы TPA, необходимой для развития заболевания у безволосых мышей SKH-1, некоторые авторы использовали повышенные дозы в 10-17 нмолей/мышь, при этом достигаемое воспроизведение гиперплазии было сходным с тем, что возникает у предварительно побритых мышей Balb/C с псориазом, и такая модель широко использовалась при изучении псориаза. Однако указанные модели были использованы для оценки биохимических или молекулярных параметров только после одного введения TPA. Поскольку задачей данного исследования была оценка прогрессирования повреждений, вызванных псориазом, в сочетании с применением полифенолов, была использована модель продолжительного воздействия и более слабой концентрации TPA, с ежедневной дозой в 2 нмоля TPA в течение периода в одну неделю, что позволило наблюдать прогрессирование псориаза.

Индукцию вызывали воздействием 2 нмолей TPA/мышь, на область поверхности в 1 см², нанося 10 мкл 200-мкМ раствора в ацетоне. Такой протокол нанесения был выбран с учетом того, что когда наносили 20 мкл, как было рекомендовано для данной модели, значительно увеличивался объем, и это приводило к потере концентрации. Поэтому было решено сделать его более концентрированным.

Более короткие протоколы вызывали увеличение толщины кожной складки, как показано на фигуре 8, поскольку при потере трансэпидермальной жидкости (TEWL), как показано на фигуре 9, указанные повреждения ясно видны при обследовании на микроскопическом уровне, как показано на фигуре 10.

Таким образом, протокол, использованный для данной процедуры, представлял собой протокол, представленный на фигуре 11. В качестве стандартной обработки был использован дексаметазон (25 мМ раствор в ацетоне, от компании Sigma). Введение тестируемых продуктов и стандартную обработку проводили за 30 минут до нанесения TPA, начиная в один и тот же день.

Группами для данной оценки, по 6 мышей на группу, были следующие:

- Не обработанные.

- Ссылочное соединение: 0,5 мкмолей дексаметазона (20 мкл 25 мМ раствора одного из продуктов в ацетоне).

- Среда: 200 мкл вакуумированных липосом.

- Ресвератрол: 200 мкл липосом, содержащих ресвератрол (всего 10 мкмолей).

- PTER: 200 мкл липосом, содержащих PTER (всего 10 мкмолей).

- QUER: 200 мкл липосом, содержащих QUER (всего 10 мкмолей).

- PTER+QUER: 200 мкл липосом, содержащих PTER+QUER (всего 10 мкмолей).

Через 24 часа (7-й день) после последнего проведения различных обработок мышей забивали, и их кожу фиксировали, используя 4% PFA. Остальных мышей обрабатывали, не подвергая воздействию TPA, чтобы проверить, имеет ли место более быстрое восстановление кожи при обработке, чем само по себе. Через 24 часа (9-й день) после последнего проведения различных обработок мышей забивали, и их кожу фиксировали, используя 4% PFA.

Пример 8. Экспериментальная индукция гиперчувствительности в результате контактирования с оксазолоном

Нанесение оксазолона после сенсибилизации тому же самому субъекту вызывает в результате контакта реакцию гиперчувствительности, которая выглядит наподобие экзематозной реакции, с инфильтрацией лимфоцитов и макрофагов, с эдемой эпидермиса.

Мышей BALB/c сенсибилизировали на день 0 путем нанесения на выбритую область живота 100 мкл 1,5% оксазолона в ацетоне (вес/объем). Перед индукцией гиперчувствительности толщину кожной складки уха измеряли с помощью штангенциркуля с нониусом (Mitutoyo micrometer). Реакцию вызывали на 7-й день путем нанесения 20 мкл 2,5% оксазолона в этаноле (по 10 мкл с каждой стороны правого уха).

Таким образом, протокол, использованный в данной процедуре, представлял собой протокол, представленный на фигуре 12. В качестве контрольного измерения использовали левое ухо, на которое наносили 20 мкл этанола. А в качестве стандартной обработки был использован крем дипрозон^® (Schering Plough B.V., Utrecht, The Netherlands), который содержит 0,5 мг бетаметазона/г.

Группами для данной оценки, по 8 мышей на группу, были следующие:

- Не обработанные.

- Ссылочное соединение: 10 мкг крема дипрозона^®, наносимого с каждой стороны уха через 30 минут после нанесения оксазолона на 7-й день.

- Среда: 10 мкл пустых липосом, наносимых с каждой стороны уха за 30 минут до нанесения оксазолона на 7-й день.

- Ресвератрол, до воздействия: 10 мкл липосом, содержащих ресвератрол, наносимых с каждой стороны уха (всего 1 мкмоль) за 30 минут до нанесения оксазолона на 7-й день.

- Ресвератрол, после воздействия: 10 мкл липосом, содержащих ресвератрол, наносимых с каждой стороны уха (всего 1 мкмоль) через 3-4 часа после нанесения оксазолона на 7-й день.

- PTER, до воздействия: 10 мкл липосом, содержащих PTER, наносимых с каждой стороны уха (всего 1 мкмоль) за 30 минут до нанесения оксазолона на 7-й день.

- PTER, после воздействия: 10 мкл липосом, содержащих PTER (всего 1 мкмоль), наносимых через 3-4 часа после нанесения оксазолона на 7-й день.

- QUER, до воздействия: 10 мкл липосом, содержащих QUER, наносимых с каждой стороны уха (всего 1 мкмоль) за 30 минут до нанесения оксазолона на 7-й день.

- QUER, после воздействия: 10 мкл липосом, содержащих QUER, наносимых с каждой стороны уха (всего 1 мкмоль) через 3-4 часа после нанесения оксазолона на 7-й день.

- PTER+QUER, до воздействия: 10 мкл липосом, содержащих PTER+QUER, наносимых с каждой стороны уха (всего 10 мкмолей) за 30 минут до нанесения оксазолона на 7-й день.

- PTER+QUER, после воздействия: 10 мкл липосом, содержащих PTER+QUER, наносимых с каждой стороны уха (всего 10 мкмолей) через 3-4 часа после нанесения оксазолона на 7-й день.

Через 24 часа после нанесения оксазолона (день 1-й) мышей забивали, и оба уха фиксировали, используя 4% PFA.

Пример 9. Трансэпидермальная потеря воды

Некоторые состояния кожи характеризуются нарушением механических свойств кожи, таким как склеродермия и псориаз.

Тем не менее, объективная оценка указанных характеристик является сложной, и измерение потери трансэпидермальной воды (PTEA или TEWL), устанавливаемой посредством системы Tewameter^TM 210 (CK electronics, Германия), считается индикатором функций кожных "барьеров" (г/ч/см²). Физическое обоснование такого типа измерения основано на законе диффузии, установленном Адольфом Фиком в 1885:

где:

A = [площадь] поверхности в м²

m = перенос воды (в г)

t = время (ч)

D = константа диффузии (=0,0877 г/м·ч·мм Hg)

p = давление атмосферного пара (мм Hg)

x = расстояние от кожи до измеряемой точки (м)

Закон диффузии dm/dt означает, что масса на см², переносимая за промежуток времени, пропорциональна [площади] поверхности A и изменению концентрации от расстояния dc/dx. D представляет собой коэффициент диффузии водяного пара в воздухе. Этот закон справедлив только в пределах зоны гомогенной диффузии, которая приближенно имеет форму полого цилиндра. Результирующий градиент плотности регистрируется опосредованно, с помощью двух наборов детекторов (температуры и относительной влажности), анализируемых микропроцессором.

В зонде системы Tewameter^TM 210 детекторы температуры и влажности, также как и блок электронных схем для измерения и данные для калибровки, локализованы во внутренней части сенсора. Верхняя часть сенсора сделана в виде пустого и узкого цилиндра (диаметр=10 мм, длина=20 мм), и ее функция состоит в снижении турбулентности воздуха в сенсоре.

После иммобилизации мышей зонд помещали на их спину, в той же области, которую обрабатывали различными химическими средствами. Считывание TEWL производили непрерывно до тех пор, пока не наступала стабилизация количественных показателей, что может продолжаться 30-60 секунд считывания.

Пример 10. Фотопротектор и антиканцерогенный эффект в процессе хронического воздействия УФ-B-облучения.

Механическая фильтрующая способность полифенолов.

С целью изучения способности полифенолов, используемых в настоящем исследовании, было решено оценить поглощение света во всей области спектра ультрафиолетового света, как показано на фигуре 13.

Было подтверждено, что ресвератрол, также как и PTER, имеют пики или максимум поглощения в области ультрафиолета-B, в отличие от QUER, который в большей степени поглощает в области длин волн, соответствующих УФ-A.

Фотозащитная роль полифенолов.

Следующая фаза исследований была связана с оценкой фотозащитного компонента (добавление полифенолов до воздействия УФ-B) по сравнению с возможной репаративной способностью полифенолов против фотоканцерогенеза (добавление полифенолов после воздействия УФ-B).

С этой целью фотопротекторную способность оценивали после хронического воздействия УФ-B, как показано на фигуре 14. Мышей в течение 28 недель подвергали 3 воздействиям в неделю в дозе мДж/см² УФ-B при каждом воздействии. Такая схема воздействий вызывала неоплазии, которые начинали проявляться, начиная с двенадцатой недели. В процессе проведения указанной схемы воздействий определяли и количественно оценивали предраковые поражения, как показано на фигуре 15.

При сравнении эффектов, оказываемых обработкой различными средствами, в отношении признаков повреждений, было обнаружено, что в контрольной группе, также как и в группе, обрабатываемой пустыми липосомами, начиная с 12-й недели длительного воздействия УФ-B, свыше 50% мышей имели опухоли. В отличие от этого, обработка полифенолами отодвигала срок проявления опухолей приблизительно до 20-й недели, в случае Resv и QUER. Однако под действием Pter, как отдельно, так и в сочетании с Quer, даже через 30 недель хронического воздействия УФ-B только у 10% мышей были обнаружены поражения. Указанный защитный эффект превосходит таковые, оказываемые коммерческими фотопротекторами. Что же касается числа таких поражений на мышь, то обработка Pter, отдельно и в сочетании с Quer, обеспечивала наибольшую защиту, поскольку число поражений на мышь было нулевым по сравнению с любыми другими обработками. В таблице 3 ниже указано число поражений на мышь: первые признаки предраковых поражений диаметром более чем в 1 мм в различных экспериментальных группах после 30-недельного хронического воздействия в 180 мДж/см² (три раза в неделю). Как ссылочные соединения, так и соединения, испытываемые в настоящем исследовании (10 мкмолей/мышь полифенолов, или 200 мкл каждого фотопротектора), наносили на спину мышам за 20 минут до того, как их подвергали воздействию УФ-B. По 20 мышей в группах.

Таблица 3   Количество опухолей/мышь×
(среднее) группу Недели 20 24 30 Контроль 4,4 9,2 13,8 Пустые липосомы 5,7 8,2 12,9 PTER содержащие липосомы 0,0 0,1 0,0 QUER содержащие липосомы 0,3 2,2 4,6 Ресвератрол содержащие липосомы 0,3 1,2 3,8 Pter+Quer содержащие липосомы 0,0 0,1 0,1 Vichy: 0,0 0,3 0,7 Heliocare: 0,0 0,5 1,06 Isdin: 0,1 0,5 0,6

Патологоанатомические исследования.

В отношении гистопатологического исследования опухолей, индуцированных хроническим УФ-облученим у мышей SKH-1, было получено подтверждение, что обработка УФ-B вызывает сильный акантоз прежде всего в результате воспалительного процесса; это открывает дорогу первым проявлениям опухолей, в основном карциномного, а не меланомного, типа.

Подавляющее большинство злокачественных поражений кожи не-меланомного типа составляют два типа: базально-клеточная карцинома и чешуйчато-клеточная карцинома.

Использование коммерческих фотопротекторов обеспечивает защиту главным образом от воспаления, однако только продукты компании Vichy уменьшали возможность развития опухолей.

Применение полифенолов дает противовоспатительный и противоопухолевый эффекты; PTER является соединением с наибольшими преимуществами. Однако при сравнении с его эквивалентом ресвератролом наблюдалась большая разница на уровне противовоспатительного и противоопухолевого эффектов. Он дает более хорошие результаты также и при сравнении с различными коммерческими фотопротекторами.

Что касается комбинации PTER и QUER, не обнаружено никакой разницы между применением Pter, отдельно или в сочетании, в отношении его фотопротекторного действия, однако, как будет обсуждаться далее, выявлена разница в отношении его противовоспалительного действия. Как представлено на фигуре 16, в таблице 4 ниже приведены результаты патологоанатомического исследования кожи после хронического воздействия УФ-B, в частности, после 30 недель хронического воздействия 180 мДж/см² (три раза в неделю). Как ссылочные соединения, так и соединения, испытываемые в настоящем исследовании (10 мкмолей/мышь полифенолов, или 200 мкл каждого фотопротектора), наносили на кожу спины мышей за 20 минут до того, как их подвергали воздействию УФ-B. Среднее по группам из 20 мышей. Каждый параметр оценивали по степени тяжести: (+) легкая, (+++) тяжелая.

Пример 11. Влияние на дерматит.

Перед оценкой результатов различных обработок на разных моделях дерматита следует оценить возможные побочные воздействия длительного введения полифенолов на кожу мышей, как показано на фигуре 17. С этой целью для оценки эффекта ежедневного введения такую дозу водили в течение 6 дней подряд.

Как можно видеть, такая обработка сама по себе при хроническом введении не влияла на толщину кожной складки, однако хроническое введение кортикоидов (таких как дексаметазон) оказывало побочные влияния на структуру кожи.

Защита от острого воздействия УФ-B-излучения.

Выявив противовоспалительное свойство полифенолов в качестве защиты против фотоканцерогенеза, стали изучать их противовоспалительную роль после мощного воздействия УФ-B. Результаты измерения толщины кожной складки на всех четырех четвертях кожи спины мышей представлены на фигуре 1.

Полифенолы Pter и Resv, отдельно и в сочетании с Pter+Quer, оказывали благотворный эффект после воздействия УФ-B-облучением, поскольку способствовали уменьшению образования эдемы.

Указанное увеличение толщины кожи могло происходить за счет увеличения объема, вызванного прежде всего некоторым воспалительным процессом или повышенным уровнем пролиферации клеток эпидермиса. Следовательно, нужно было измерить толщину эпидермиса, как показано на фигуре 2.

Была обнаружена существенная разница в толщине эпидермиса мышей, обработанных полифенолами, по сравнению с группой, только облученной УФ-B. Фактически обработка PTER, отдельно или в сочетании с QUER, давала лучшие результаты, чем даже коммерческие фотопротекторы и ресвератрол.

Что касается времени проведения обработки, не обнаружено особых различий между тем, когда средства наносили до, с тем, когда их наносили после воздействия УФ-B, за исключением ресвератрола, при применении которого получили различные результаты, в зависимости от времени проведения обработки, в отношении его роли в качестве эффективного фотопротектора, но не в отношении его восстановительных свойств.

Кроме того, когда толщину эпидермиса изучали через неделю после УФ-B-облучения в 360 мДж/см², было отмечено, что мыши, обработанные полифенолами до УФ-B-воздействия, были защищены от повреждения в результате воздействия УФ-B, у них были те же самые результаты в отношении толщины эпидермиса, что и результаты, полученные через 24 часа после облучения, между ними не было никаких статистических различий. Если полифенолы наносили после облучения, получали точно такие же результаты, за исключением того, что QUER давал худшие результаты, когда его наносили после воздействия УФ-B, при этом результаты были сходны с результатами, полученным в случае применения коммерческих фотопротекторов, как показано на фигуре 3 и фигуре 18.

Защита в экспериментальной модели атопического дерматита, индуцированного TNCB.

Увеличение толщины кожных складок через 24 часа после первого введения TNCB изучали, как показано на фигуре 19. В данной модели было невозможно измерять кожную складку, поскольку повреждения происходили на всем протяжении процесса, что не позволяло осуществить корректное измерение толщины кожи. Однако было отмечено, что увеличение толщины кожной складки имело место через 24 часа после первого воздействия TNCB, через 1 неделю после предварительной сенсибилизации под действием TNCB. Как видно на указанной фигуре, дексаметазон, также как и PTER (отдельно или в сочетании с QUER), способствовал уменьшению воспалительного эффекта, обусловленного TNCB.

Следует отметить также, что пустые липосомы не влияли на толщину кожной складки, что свидетельствует о том, что сами по себе липосомы не выступают в качестве механических фильтров, препятствующих средству TNCB достичь его мишени, вызывая предполагаемые повреждения.

Макроскопическая оценка повреждений.

Повреждения оценивали с целью оценки различий между разными обработками, как показано на фигуре 20 и фигуре 21. Было отмечено, что с начала первого продолжительного нанесения TNCB имели место кожные изменения, это были изменения в уровне гидратации с начала первого воздействия TNCB и на протяжении всего процесса.

Вкратце, анализ значений TEWL показал, что при обработке под действием TNCBA, также как и при предварительной обработке дексаметазоном или пустыми липосомами, имело место статистически значимое увеличение гидратации эпидермиса по сравнению с базальными уровнями.

Однако анализ полученных результатов показал также, что в случае обработок полифенолами, особенно сочетанием Pter+Quer, не было статистически значимых различий по сравнению с необработанной кожей (базальным уровнем). Это свидетельствует о том, что полифенолы оказывают гидратирующее действие на эпидермис, даже большее, чем только вода, или защитное действие против вмешательства, оказываемого TNCB.

На этом этапе различия перестают быть статистически значимыми в том, что касается значений, полученных с применением TNCB, возможно, потому, что повреждения имели место во всех группах, включая группу, обработанную дексаметазоном.

Что касается повреждений, есть указания на то, что слабая степень повреждений связана с тем, что, в отличие от других моделей, протокол введения TNCB подразумевает более низкую дозу, которая продуцирует также минорные повреждения, но более схожие с реальными повреждениями. Наиболее важный факт, который следует отметить в связи с возможным предотвращением или излечением атопического дерматита, это то, что дексаметазон не оказывает какого бы то ни было благотворного эффекта в отношении степени повреждений или в отношении увеличения толщины кожной складки. PTER вызывал менее тяжелые повреждения, чем повреждения, образуемые при применении дексаметазона или без какой-либо обработки.

Защита против модели контактной гиперчувствительности, индуцированной оксазолоном.

Кожные расстройства, такие как контактная гиперчувствительность, атопический дерматит и псориаз, характеризуются гиперпролиферативными и воспалительными нарушениями кожи.

На современном этапе лечение кожных нарушений включает в себя применение противовоспалительных средств, таких как глюкокортикоиды и антипролиферативные средства. В настоящем исследовании утверждается, что применение природных полифенолов вызывает клиническое улучшение дерматита, как показано на фигуре 22. Эффекты PTER в отношении кожных расстройств были основаны на манипуляциях, предпринимаемых на животных, и была показана сходная контактная гиперчувствительность на уровне воспаления дермы, измеряемая на уровне предотвращения эдемы ушей с использованием оксазолона.

Результаты данного фармакологического испытания in vivo, которое моделирует связанные с иммунной системой кожные воспалительные расстройства, указывают на то, что полифенолы, в частности, PTER, наносимые на поврежденный участок (наносимые после введения оксазолона), могут предотвратить воспалительные изменения, происходящие в результате воспаления, вызванного оксазолоном. Сходные результаты можно наблюдать под действием дипрозона.

Пример 12. Влияние на псориаз, оказываемое TPA.

Исследование эдемы при псориазе

Поскольку нанесение TPA на кожу вызывает расширение кровеносных сосудов, инфильтрацию лейкоцитов и эдему, интересно измерять не только изменение толщины кожной складки в виде веса ткани, но и периметр кожного воспаления, как показано на фигуре 23.

Оценивая увеличение толщины кожной складки на протяжении периода проведения данной процедуры (6 последовательных дней), наблюдения проводили за 3 различными группами. Первая группа соответствовала контрольной группе и группе, обрабатываемой дексаметазоном (0,5 мкмолей/мышь, за 30 минут до введения TPA), и никаких различий между ними обнаружено не было, что указывает на то, что дексаметазон предотвращает развитие псориаза. Ко второй группе относилась группа, в которой воздействовали TPA, пустыми липосомами и Resv, при этом по меньшей мере в течение первой половины проводимой процедуры оценка была сходной, имело место возрастание эдемы.

И наконец, третью группу составляли группы Pter, Quer и Pter+Quer, где было отмечено существенное уменьшение возрастания толщины кожных складок под действием TPA, и оно значимо отличалось по меньшей мере через 24 часа после первого введения, как показано на фигуре 24. Как можно видеть по увеличению толщины кожных складок, нанесение TPA на кожу мышей вызывает эдему, значимо выраженное воспаление через 24 часа после введения. Нанесение ссылочного продукта, дексаметазона (0,5 мкмолей/мышь), за 30 минут до местного введения TPA существенное уменьшало возрастание толщины кожной складки.

В то же время обработка PTER, QUER и сочетанием двух указанных средств способствовало также значительному уменьшению проявлений эдемы. Важно отметить, что применение пустых (незаполненных) липосом никак не влияло на проявления эдемы, что указывает на то, что эффект, наблюдаемый под действием Pter, Quer или Pter+Quer, обусловлен не составом липосом, а вызван специфическим действием полифенолов. Указанный эффект был подтвержден путем сравнения с эффектом, оказываемым липосомами, заполненными представляющим здесь интерес полифенолом, ресвератролом; по сравнению с группой TPA, он не вызывает никакого возрастания толщины кожной складки.

На фигуре 25 приведено сравнение толщины кожной складки после 3 введений TPA, когда поражения на макроскопическом уровне становятся очевидными. Можно видеть, что на этом этапе применение Pter, Quer и их сочетания оказывает эффект уменьшения воспаления, вызываемого TPA.

Макроскопическая оценка повреждений

Повреждения оценивали с целью количественного описания различий между разными вариантами обработок, как показано на фигуре 26.

Повреждениям придавали числовое значение в соответствии с экскориацией повреждений через 24 часа после 7 введений TPA, поскольку это было единственным из отмеченных изменений, никаких указаний на покраснение или язвы отмечено не было.

Чешуйчатость кожи определяли по шкале 0-3, согласно которой 0 означает ее отсутствие; 1 - слабую; 2 - умеренную; 3 - сильную. И средний показатель для каждой из групп указывал на степень воспаления, как показано на фигуре 2.

Можно заметить, что только группы, обработанные PTER как таковым или в сочетании с QUER, были группами, в которых в наименьшей степени проявлялась экскориация, или сдирание кожи при расчесах.

Гистологический анализ повреждений.

Этот анализ проиллюстрирован на фигуре 28.

Гистологически имеет место удлинение rete ridge (эпидермальных гребней или выростов в толщу соединительной ткани), с утолщением нижней части (псориазиформная гиперплазия), удлинением и эдемой бугорков, надбугорковой атрофией эпидермиса со спонгиоформными пустулами (пустулы Когоя), отсутствием зернистого слоя или гипогранулезом, паракератозом, внутриэпидермальным микроабсцессом Мунро, расширенными и извилистыми сосочковидными капиллярами, околососудистой инфильтрацией лимфо-гистиоцитов и незначительным количеством эозинофилов и плазмоцитов.

Псориаз является хроническим воспалительным дерматозом, клинически характеризующимся поражениями в виде папул, или бугорков, и отшелушивающейся эритемы, с избыточным жемчужно-белым отслаиванием. Его течение достаточно замысловато, хотя, как правило, он развивается в хроническую форму, с периодами обострений и ремиссий. Существуют разные клинические описания, хотя обычно нет четких рамок, поскольку у одного и того же пациента могут наблюдаться вариации. Со многими из них можно столкнуться во время осмотра или в процессе развития разных стадий этого заболевания.

Уже многие годы известно, что гиперплазия эпидермиса при псориазе является вторичной на фоне гиперпролиферации кератиноцитов, которая характеризуется численностью зародышевых клеток, находящихся в пролиферативной стадии, и фрагментацией роста в эпидермисе. Зарегистрировано увеличение числа митозов и количества клеток в процессе развития клинической фазы.

Типичной гистопатологической характеристикой стабильного поражения при псориазе является "эпидермальная псориазиформная гиперплазия" (Lever's Histopathology of the Skin. 10th edition). Она характеризуется регулярным эпидермальным акантозом и rete ridges, широким у основания и узким в верхней части, где обычно имеет место осветление надбугоркового эпидермиса.

В настоящей модели индукции псориаза в группе с TPA наблюдали такой папилломатоз; однако сужения надбугоркового эпидермиса обнаружено не было.

Когда мышам, которые успели отойти от экспериментальных воздействий, делали надрезы, у них на макроскопическом уровне достоверных поражений обнаружено не было; следовательно, здесь не анализировали уровень экскориации, поскольку это может привести к ошибкам. Однако гистологический анализ показал, что кожа не является здоровой кожей. Следовательно, при тщательном ее анализе было получено подтверждение того, что когда псориатические поражения вступают в стадию инволюции, имеет место тенденция к восстановлению, паракератоз начинает исчезать, и эпидермис начинает утончаться. Исчезает также и папилломатоз, хотя морфология и не восстанавливается до уровня таковой нормальной кожи.

При сравнении разных групп обработки было обнаружено, что в группе, обрабатываемой дексаметазоном, у мышей был очень тонкий эпидермис, без папилломатоза или гиперкератоза. В некоторых точках с очевидностью встречались также поражения сальных желез.

В отношении группы, обрабатываемой PTER, наиболее важным отличием было то, что отсутствовали признаки папилломатоза, но имел место акантоз в силу массивной пролиферации. И если сравнивать с группой, обрабатываемой только TPA или пустыми липосомами, акантоз, также как и паракератоз, были менее выражены.

Этого не наблюдалось в группе, обрабатываемой ресвератролом, имеющим структуру, сходную со структурой PTER, поскольку в этой группе пролиферация и акантоз были менее выражены, чем в группе, обрабатываемой PTER. Кроме того, если сравнивать различные типы обработок, группа, обрабатываемая ресвератролом, имеет большее сходство с группой, обрабатываемой TPA, чем с группой, обрабатываемой PTER.

Кроме того, сочетание PTER с QUER давало фенотип, сходный с таковым, обнаруживаемым при обработке одним только PTER.

Группа изобретений относится к области фармацевтической промышленности, а именно к применению птеростильбена (PTER), или птеростильбена в сочетании с кверцетином (QUER), или любой их приемлемой соли для профилактики рака кожи или для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, выбранных из псориаза, атопического дерматита и аллергического дерматоза, путем местного введения. Группа изобретений обеспечивает эффективную профилактику и/или лечение кожного заболевания. 7 н. и 11 з.п. ф-лы, 28 ил., 4 табл., 12 пр.

1. Применение птеростильбена (PTER), или птеростильбена в сочетании с кверцетином (QUER), или любой их приемлемой соли для изготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, выбранных из псориаза, атопического дерматита и аллергического дерматоза, путем местного введения.

2. Применение птеростильбена, или птеростильбена в сочетании с кверцетином, или любой их приемлемой соли для изготовления фармацевтической композиции для профилактики рака кожи.

3. Применение птеростильбена, или птеростильбена в сочетании с кверцетином, или любой их приемлемой соли для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, выбранных из псориаза, атопического дерматита и аллергического дерматоза.

4. Применение птеростильбена, или птеростильбена в сочетании с кверцетином, или любой их приемлемой соли для профилактики рака кожи.

5. Фармацевтическая композиция для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, выбранных из псориаза, атопического дерматита и аллергического дерматоза, содержащая птеростильбен, или птеростильбен в сочетании с кверцетином, для местного введения.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, в которой птеростильбен составлен в сочетании с кверцетином.

7. Фармацевтическая композиция по п. 5, составленная в виде композиций от загара или после загара.

8. Фармацевтическая композиция по п. 5, составленная в виде липосом.

9. Фармацевтическая композиция для профилактики рака кожи, содержащая птеростильбен, или птеростильбен в сочетании с кверцетином, для местного введения.

10. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой птеростильбен составлен в сочетании с кверцетином.

11. Фармацевтическая композиция по п. 9, составленная в виде композиций от загара или после загара.

12. Фармацевтическая композиция по п. 9, составленная в виде липосом.

13. Способ изготовления липосомальных композиций, который включает
a) растворение активного соединения птеростильбена или любой его приемлемой соли и лецитина в органическом растворителе;
b) выпаривание растворителя;
c) добавление буфера PBS;
d) сбор образованных липосом и обработку их ультразвуком;
e) разведение 1:1 стабилизатором эмульсии.

14. Способ по п. 13, согласно которому кверцетин или любую его приемлемую соль также растворяют на стадии (а).

15. Способ по п. 13, согласно которому стабилизатором эмульсии является карбомер.

16. Способ по п. 15, согласно которому карбомером является карбопол.

17. Способ по п. 13, согласно которому способ дополнтельно включает стадию f) добавления консерванта.

18. Способ по п. 17, согласно которому консервант представляет собой фенонип.