ПЕПТИДЫ С ЗАЩИТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК И ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СОСТАВЫ Российский патент 2025 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61K8/14 A61K8/64 A61Q17/04 A61Q19/02 A61Q19/08 A61P17/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к пептидам, и композициям их содержащим, и к их применению для ограничения или коррекции повреждения клеток, вызванного внешними агентами, такими как солнечное облучение, экологический стресс и/или старение клеток эпидермиса.

Также описаны применение пептидов и их липосомальных составов для предотвращения и ограничения повреждения кожи, вызванного воздействием ультрафиолетовых лучей, в частности у субъектов, имеющих пигментную ксеродерму. Пептиды и их составы также находят применение в области косметики.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кожа является самой внешней тканью человеческого тела и, как таковая, является тканью, которая в наибольшей степени подвергается воздействию внешних факторов, таких как солнечная радиация, атмосферные агенты и загрязнение окружающей среды.

Ежедневное действие этих внешних агентов является не только ключевым фактором ускорения физиологического процесса старения кожи, но и способствует развитию кожных заболеваний и предраковых или раковых форм кожи. Недавние исследования показали, что последние в большинстве случаев связаны с повреждением клеточной ДНК, вызванным воздействием солнечного излучения, в частности, ультрафиолетового излучения.

Было показано, что фотооблучение вызывает повреждение клеточной ДНК, что приводит к образованию пиримидиновых фотопродуктов и циклобутанпиримидиновых димеров (CPD). Эти фотопродукты также могут образовываться, даже когда кожа подвергается воздействию УФ-излучения короткое время. По этой причине различные механизмы репарации, способные удалять поврежденную ДНК, играют решающую роль в правильном функционировании клетки.

При отсутствии или при снижении этих процессов мутационного контроля клетки эпителия могут легко поражаться новообразованиями, индуцированными УФ-излучением.

Существенные доказательства важности механизмов репарации ДНК получены из наблюдений за 30 больными пигментной ксеродермой (ХР).

XP является редким аутосомно-рецессивным генетическим заболеванием, отличающимся ферментативными дефектами на ранних стадиях сигнального пути для восстановления генетических повреждений, индуцированных облучением. Результатом является крайняя чувствительность к солнцу, что влечет за собой высокий риск солнечных ожогов, явлений гипо- и/или гиперпигментации, ранний актинический кератоз и множественные кожные новообразования. В первые годы жизни у больных наблюдается аномальная и выраженная эритематозная реакция на солнечный свет. К 20 годам около 90% людей с этим заболеванием имеют как минимум раковую форму кожи.

Более сорока лет назад Танака с коллегами продемонстрировали, что фермент эндонуклеаза T4 V, полипептид с молекулярной массой 16,5 кДа, выделенный из Escherichia coli, инфицированной бактериофагом Т4, способен усиливать восстановление клеток путем удаления нуклеотидов в клетках человека и инициировать удаление CPD. После этого ген denV, кодирующий фермент, был клонирован и секвенирован.

Исследования показали, что этот фермент сам по себе способен заменить мультиферментный комплекс, используемый для эксцизионной репарации нуклеотидов, как при его экспрессии в эукариотических клетках путем трансфекции гена denV, так и при внутриклеточном введении в качестве гетерологичного фермента, выделенного из E. coli. Исследования также показали результаты, как in vivo, так и in vitro, в отношении способности этого фермента эффективно восстанавливать повреждения клеток, вызванные УФ-облучением.

Эти наблюдения привели к разработке препаратов для местного применения фермента эндонуклеазы T4 V (T4N5), которые подходят для переноса фермента внутрь клеток. Несколько исследований продемонстрировали, что препарат с T4N5 для местного применения проникает через роговой слой и проникает в самые глубокие слои эпидермиса, накапливаясь в кератиноцитах и клетках Лангерганса.

В ходе клинических испытаний было продемонстрировано, что местное применение состава T4N5 способствует устранению CPD в месте нанесения, и была показана его эффективность в отношении предотвращения развития актинического кератоза и базальноклеточного рака у пациентов с XP.

Эндонуклеаза T4 V представляет собой единый компактный домен с двумя отдельными участками, имеющими каталитическую активность:

(i) сайт функционирует как гликозилаза пиримидинового димера, т. е. идентифицирует поврежденный участок ДНК и расщепляет димер, образованный УФ-излучением, удаляя мутированное основание;

(ii) второй сайт удаляет сахар и фосфат из этого гликозида.

Мутации, проведенные для идентификации остатков, необходимых для ферментативной активности, продемонстрировали, что карбоксиконцевая область последовательности необходима для распознавания и связывания CPD.

В настоящее время существует потребность в активных ингредиентах, действие которых заключается в восстановлении повреждений клетки, особенно, вызванных воздействием внешних факторов, как правило, ультрафиолетовым излучением.

Таким образом, одна из целей изобретения состоит в обеспечении активных ингредиентов с биологической активностью для терапевтического лечения кожных заболеваний, вызванных воздействием внешних агентов, в частности, ультрафиолетовым излучением.

Другой целью изобретения является создание активных ингредиентов с биологической активностью для косметического ухода за кожей и для замедления физиологического процесса старения кожи.

Другой целью настоящего изобретения является создание составов для местного применения, содержащих пептиды, обладающие способностью восстановления клеток в слоях кожи и внутри клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на идентификации избранных биологически активных пептидов, которые увеличивают скорость физиологических процессов/механизмов восстановления поврежденной ДНК в клетках млекопитающих и/или способствуют удалению циклобутанпиримидиновых димеров и/или пиримидиновых фотопродуктов на уровне клеточной ДНК.

Авторы также обнаружили, что биологически активные пептиды по изобретению проявляют свою активность даже при введении внутрь клетки.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему последовательность SEQ ID NO:1, его аналогам, производным или солям.

Пептид SEQ ID NO:1 имеет последовательность от N-конца до С-конца, представленную общей формулой (1):

(1) R1-Y-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10, где:

Xaa1: Trp, Phe или Tyr;

Xaa2: Trp, Phe или Tyr;

Xaa3: Lys;

Xaa4: Tyr, Trp или Phe;

Xaa5: Tyr, Trp или Phe;

Xaa6: Gly или Ala;

Xaa7: Lys;

Xaa8: Ala или Aib (α-аминоизомасляная кислота);

Xaa9: Ile, Leu или Ala;

Xaa10: Tyr;

Y, если присутствует, представляет собой Aib,

и где

R1, если присутствует, представляет собой H, CF (карбоксифлуоресцеин), пальмитоил(CH3(CH2)14CO-), олеил(CH3(CH2)7(CH)2(CH2)7 CO-), стеарил(CH3(CH2)16CO-), линолеил(CH3(CH2)4(CH)2CH2(CH)2(CH2)7CO-) или линоленил(CH3CH2(CH)2CH2(CH)2CH2(CH)2(CH2)7CO-).

Заместители Y и R1 являются необязательными.

Пептиды по настоящему изобретению имеют структуру, которая обеспечивает значительно большую простоту их получения, чем фермент эндонуклеаза T4 V, что делает молекулы подходящими для применения в качестве активных ингредиентов.

Кроме того, пептиды по изобретению проявляют значительную клеточную активность, но отличающуюся от активности фермента T4 V. Включение неприродных аминокислот, например, Aib, или липидных цепей, дополнительно повышает устойчивость к ферментативному расщеплению.

Эти свойства придают пептидам по изобретению высокую восстановительную активность в отношении клеток кожи, что позволяет использовать их как в медицинских, так и в косметических целях.

В соответствии с вариантом осуществления изобретения предложен пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, его аналоги, производные или соли, имеющие следующую аминокислотную последовательность:

H2N-Aib-Trp-Phe-Lys-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Ala-Ile-Tyr

Этот выбранный пептид обладает высокой способностью распознавать и связывать CPD.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления изобретения следующие предпочтительные пептиды (Ptd-1-7), их аналоги, производные или соли имеют следующие последовательности SEQ ID NO.2-8:

SEQ ID NO: Последовательность Обозначение 3 WFKYYGKAIY Ptd-1 4 CF-WFKYYGKAIY Ptd-2 5 Pal-WFKYYGKAIY Ptd-3 6 WFKYYGK-Aib-IY Ptd-4 7 Pal-WFKYYGK-Aib-IY Ptd-5 8 CF-WFKYYGK-Aib-IY Ptd-6 2 Aib-WFKYYGKAIY Ptd-7

В области медицины пептиды находят применение при лечении и защите клеток от повреждения, индуцированного агрессивными внешними агентами, в частности УФ-излучением, и для лечения кожных заболеваний, возникающих в результате воздействия УФ-лучей. В косметической области пептиды по изобретению используют при профилактике и/или лечении признаков старения кожи или дефектов кожи, возникающих в результате старения и/или действия внешних агентов, таких как ультрафиолетовое излучение.

Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что липосомы представляют собой подходящую систему для трансдермальной и внутриклеточной доставки пептидов по изобретению. В частности, включение пептидов внутри фосфолипидных везикул, таких как липосомы, позволяет пептидам проникать через слои кожи и внутрь клетки, где они проявляют свою активность.

Пептиды, переносимые липосомами или в составе с ними, проникают в наиболее глубокие слои эпидермиса, накапливаясь в кератиноцитах и в клетках Лангерганса.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пептиды с последовательностью SEQ ID NO: 1, к их аналогам, производным или солям и к носителю для транспортировки пептидов через слои кожи.

Предпочтительно, чтобы композиция для применения содержала пептид с SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, его аналоги, производные или соли и физиологически приемлемый носитель, предпочтительно, липосомы.

В одном варианте осуществления композиция содержит пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2-8, его аналоги, производные или соли, и липосомы, и физиологически приемлемый носитель, предпочтительно, липосомы.

Предпочтительно, чтобы композиция была предназначена для местного применения.

Авторы изобретения также заметили, что включение пептидов по изобретению внутри липосом выполняет двойную функцию транспорта через слои кожи и через клеточную мембрану клеток-мишеней, как правило, клеток Лангерена и кератиноцитов.

Использование липосом в качестве системы для трансдермального переноса активных пептидов по изобретению обеспечивает преимущества, такие как высокая способность транспортировки гидрофильных и липофильных молекул, высокая проникаемость в клетку за счет сродства и совместимости с биологическими мембранами, высокая безопасность использования в сочетании с увлажняющими и регенерирующими свойствами в отношении рогового слоя кожи.

Композиция по изобретению может представлять собой фармацевтическую композицию и косметическую композицию.

Также описано применение композиции, содержащей один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, описанными выше, и их производных или солей, в качестве лекарственного средства.

Пептиды и пептидные соединения активны в отношении профилактики и/или лечения заболеваний и патологических состояний, связанных с повреждением ДНК клеток, в частности кожной ткани, например, индуцированного воздействием УФ-лучей.

Дополнительный аспект изобретения относится к композиции, содержащей один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, их производных или солей, для применения в профилактике и/или лечении опухолей кожи.

Другой аспект относится к композиции, содержащей один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, их производных или солей, для применения в профилактике и/или лечении пигментной ксеродермы (XP).

Композиция, содержащая один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, их производных или солей, также используется для профилактики и лечения солнечных ожогов, эритемы, гипо-и/или гиперпигментации, раннего актинического кератоза и новообразований кожи.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к применению косметической композиции, содержащей один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, их производных или солей, для предотвращения и/или лечения признаков старения кожи или дефектов кожи, в частности, в результате старения кожи и/или воздействия на кожу внешних агентов, таких как ультрафиолетовое излучение.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к косметическому применению одного или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8, их производных или солей, или к косметической композиции для местного применения, которая содержит их, при лечении несовершенств кожи.

Косметическая композиция по изобретению в основном применяется при лечении пятен и/или гиперпигментации и/или дисхромии кожи.

Косметическая композиция также показана при профилактике и/или лечении признаков старения кожи, возникающих в результате воздействия УФ-лучей, таких как складки и морщины, в частности, на лице.

Предпочтительно, чтобы композиция, описанная в данном документе, действовала путем осветления пятен или дисхромии кожи, как продемонстрировано на прилагаемых фиг. 3 и 4 и в нижеследующем подробном описании изобретения.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к косметическому набору для лечения отметин на коже или кожной дисхромии или пятен на коже, содержащему композицию, описанную в настоящем документе.

В соответствии с вариантом осуществления набор для косметического лечения кожи содержит:

- косметическую композицию для пилинга кожи, предпочтительно содержащую α-гидроксикислоту, предпочтительно гликолевую кислоту, миндальную кислоту или койевую кислоту;

- композицию, содержащую один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1-8;

- композицию, предпочтительно в форме геля, содержащую липосомы и S-арбутин и липосомы; и необязательно

- буферную композицию для применения после пилинга, предпочтительно в форме раствора;

- композицию для защиты от УФ-излучения, предпочтительно, в форме крема.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее изобретение будет описано подробно и со ссылкой на следующие сопровождающие фигуры:

На фиг. 1 представлены результаты проточного цитометрического анализа флуоресцентного сигнала в клетках KB31, обработанных в течение 72 часов липосомными составами, описанными в примере 1. В показанных изображениях серая линия (более светлая) указывает на сигнал размножающихся клеток A Черная линия: клетки, обработанные XP-0 (липосомальная композиция, не содержащая пептидов, в соответствии с примером 1); В. Черная линия: клетки, обработанные XP-1 (липосомальная композиция в соответствии с примером 1); С. Черная линия: клетки, обработанные XP-T4V; D. Зеленым показаны клетки, обработанные XP-2 (липосомальный состав, содержащий пептид, функционализированный карбоксифлуоресцеиновым флуорофором в соответствии с примером 1). Светло-зеленый: XP-2 10-40 мкл/мл; темный зеленый: XP-2 50 мкл/мл.

На фиг. 2 представлена визуализация живых клеток с помощью конфокальной микроскопии. XPC-F обрабатывали составом XP-2 и облучали (300-800 нм, 360 Вт/м² в течение 7 минут) с использованием SunTest CPS⁺ (ATLAS, Urai, Italy). В конце облучения за образцами проводили наблюдения в течение 2 часов в контролируемых условиях (37°C, 5% CO₂) с использованием системы Cell-Observer (Zeiss). В качестве контролей использовали клетки, обработанные составом в отсутствие облучения (A-E). Фибробласты, обработанные составом XP-2 и облученные, показаны на фиг. F-J.

На фиг. 3 показаны репрезентативные изображения результатов, полученных на участках кожи индивидуума, получавшего лечение с использованием комплексного эксфолиирующего и депигментирующего косметического набора, описанного в примере 3.

На фиг. 4 показаны репрезентативные изображения результатов, полученных на коже индивидуума, обработанной с использованием комплексного эксфолиирующего и депигментирующего косметического набора, описанного в примере 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте изобретение основано на найденных и синтезированных пептидах, которые способствуют восстановлению ДНК эпидермальных клеток, в частности ДНК, поврежденной путем воздействия солнечного излучения.

Авторы наблюдали, как пептиды, описанные в настоящем документе, способствуют восстановлению ДНК, поврежденной путем воздействия солнечных лучей или канцерогенных веществ, с помощью механизма эксцизионной репарации нуклеотидов (NER).

В контексте настоящего изобретения акроним T4N5 обозначает ферментную эндонуклеазу T4 V.

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение, таким образом, относится к пептиду по п.1 формулы изобретения.

Предпочтительные пептиды среди тех, которые входят в общую формулу, приведены в п.2 формулы изобретения.

Дополнительный предпочтительный пептид приведен п.3 формулы изобретения.

В настоящем изобретении при использовании следующих определений:

- «Aib-» подразумевает содержание некодируемой природной аминокислоты: альфа-аминоизомасляной кислоты;

Все другие аминокислоты описаны с помощью их трехбуквенного кода, например Gly=глицин, Leu=лейцин, Ala=аланин.

Все хиральные аминокислоты имеют L-конфигурацию, если не указано иное.

Пептиды могут быть использованы отдельно или в комбинации и могут быть получены в виде композиции. Они могут быть приготовлены в виде водного раствора и могут быть растворены вместе с веществами, приспособленными для продления их времени жизни или адгезии к поверхностям.

Также описаны пептиды, в которых по меньшей мере один аминокислотный остаток удален и, предпочтительно, только один, а другой остаток вставлен на его место. Для подробного описания химии белка и структуры см. Schulz G.E. et al., 1979 (7) and Creighton T.E., 1984 (8). Замены, которые могут быть внесены в пептидную молекулу по настоящему изобретению, представляют собой консервативные замены и определены в настоящем документе как обмены в одной из следующих групп:

1 . Алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: Ala и Gly;

2. Положительно заряженные полярные остатки: Lys.

Существенные изменения функциональных свойств достигаются с использованием менее консервативных замен, из аминокислот, принадлежащих к отличным от указанных выше групп (или двух других аминокислотных групп, не показанных выше), а не среди аминокислот одной и той же группы, которые значительно отличаются по своему влиянию на поддержание (а) структуры остова пептида в области замещения (b) заряда или гидрофобности молекулы на целевом участке или (c) пространственной конфигурации боковых цепей. Большинство замен в соответствии с настоящим изобретением являются теми, которые не дают радикальных изменений характеристик пептидной молекулы. Даже когда трудно предсказать точный эффект замены перед ее получением, специалист в данной области техники будет принимать во внимание, что эффект может быть оценен с помощью обычных скрининговых методов анализа, предпочтительно, биологических тестов, описанных ниже. Модификации свойств пептида, включая окислительно-восстановительную или термостабильность, гидрофобность, восприимчивость к протеолитическому разложению, или тенденцию к агрегации с носителями или в мультимерах испытываются способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. «Химические производные» общей формулы (1) SEQ ID NO: 1 содержат дополнительные химические субъединицы, которые обычно не являются частью пептида. Ковалентные модификации пептида включены в объем настоящего изобретения. Такие модификации могут быть введены в молекулу путем взаимодействия подходящих аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками.

Другие примеры химических производных пептида приведены ниже.

N-концевой остаток лизина может быть дериватизирован с помощью янтарной кислоты или других ангидридов карбоновых кислот. Дериватизация с циклическим ангидридом карбоновой кислоты изменяет заряд остатков лизина на противоположный. Другие подходящие реагенты для дериватизации остатков, содержащих аминогруппы, включают имидоэфиры, такие как метилпиколинамидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфокислоту; О-метилизомочевину; 2,4-пентандион; и реакцию с глиоксилатом, катализируемую трансаминазой.

Карбоксильные, аспартильные или глутамильные боковые группы могут быть селективно модифицированы реакцией с карбодиимидами (RN=C=N-R'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азотония-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки могут быть превращены в аспарагинильные и глутаминаминильные остатки путем взаимодействия с аммиаком.

Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование аминогруппы лизина (Creighton, выше, страницы 79-86), ацетилирование N-концевого амина и амидирование С-концевых карбоксильных групп.

Также включены пептиды, в которых одна или более L-аминокислот замещены одной или более D-аминокислотами.

Также включены пептиды, в которых одна или более D-аминокислот замещены одной или более L-аминокислотами. Кроме того, могут использоваться модифицированные аминокислоты или химические производные аминокислот так что пептид содержит дополнительные химические компоненты или модифицированные аминокислоты, которые обычно не являются частью природного белка. Такие дериватизированные функции могут улучшить растворимость, абсорбцию, биологический период полужизни и т.п. Производные, способные опосредовать такие эффекты, представлены, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 1980 (9).

Включены пептиды с описанными последовательностями, в которых одна или более амидных функциональных групп N-метилированы.

Пептиды по изобретению могут быть получены общепринятым способом на основе твердофазного пептидного синтеза, предпочтительно, с использованием аминокислот, защищенных защитной группой Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильной).

Как правило, пептиды могут быть получены с помощью твердофазного пептидного синтеза, при этом твердый носитель, как правило, функционализирован для получения карбоновой кислоты на С-конце, например, с использованием кислотолабильных смол Wang или суперкислотолабильных смол Cl-Trt или Sasrin.

В случае использования смолы Cl-Trt первая аминокислота, Fmoc-Tyr(tBu)-OH растворяется в подходящем растворителе, обычно DMF, и связывается с смолой, предпочтительно, в присутствии DIPEA. За этим следует процедура кэппинга, предпочтительно, с использованием смеси DCM:MeOH:DIPEA, например, 80:15:5 в течение 10 минут.

Группы Fmoc для NН-защиты могут быть удалены обработкой пиперидином, обычно продолжительностью 7-9 минут, например, 20% в DMF, после чего следует вторая обработка тем же реагентом, например, в течение 8-12 минут.

Присоединение каждой аминокислоты получают взаимодействием 3 эквивалентов Fmoc-AA-OH относительно молей активных центров смолы. Предпочтительно, чтобы активацию карбоксильной функциональной группы проводили с 3-кратным избытком DIC и 3-кратным избытком Oxyma-Pure. Предпочтительно, чтобы реакцию связывания проводили с использованием карбодиимидов в качестве активаторов в присутствии HOBt/HOAt или солей урония, таких как TBTU, НATU, НBTU. Предпочтительно, чтобы реакцию сочетания проводили в растворе DMF, например, в течение 1 часа с последующей процедурой промывки, например, 6-кратной промывкой DMF. Снятие защиты с функциональной аминогруппы каждой Fmoc-AA-OH получают посредством двойной обработки 20%-ным раствором пиперидина в DMF с последующим удалением избытка реагентов путем фильтрации и промывки. Процесс повторяют для каждого нового остатка в пептидной цепи.

Можно проверить успех каждой реакции сочетания с помощью теста Кайзера. В конце синтеза всей последовательности пептидная смола может быть промыта DMF (×3), DCM (×4) и затем высушена, предпочтительно, в вакууме.

В соответствии с вариантом осуществления для отщепления от смолы и удаления защитных групп из пептидной цепи, смолу обрабатывают, например, в течение 3 часов при комнатной температуре с помощью отщепляющего коктейля (трифторуксусной кислоты/H₂O/триизопропилсилана=95/2,5/2,5 об./об., 3 мл/100 мг смолы). После реакции отщепления продукт можно осадить добавлением холодного эфира и затем оставить сушиваться под вакуумом при 50°С.

Неочищенный продукт очищали с помощью препаративной ОФ-ВЭЖХ, в присутствии 0,05%-0,1% TFA. Собранный элюат может быть лиофилизирован. Можно получить чистый продукт как в виде соли трифторацетата, так и в виде хлоридной соли после повторной лиофилизации из разбавленной HCl.

Полученные таким образом пептиды были охарактеризованы ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрией (ESI-TOF).

Название Последовательность SEQ ID NO: r.t.* Теоретическая MW^# MW^# [M+H+] Чистота Ptd-1 WFKYYGKAIY 3 5,4 1338,58 1338,79 99,9% Ptd-2 CF-WFKYYGKAIY 4 13,3/13,9 1696,09 1697,60 97,7% Ptd-3 Pal-WFKYYGKAIY 5 26,6 1576,96 1576,90 95,0% Ptd-4 WFKYYGK-Aib-IY 6 5,8 1352,59 1352,50 97,8% Ptd-5 Pal-WFKYYGK-Aib-IY 7 26,8 1591,91 1590,90 99,9% Ptd-6 CF-WFKYYGKAib-IY 8 13,5/14,1 1710,90 1710,70 83,1% Ptd-7 Aib-WFKYYGKAIY 2 7,2 1422,70 1423,70 96,1% Pal: пальмитоил; Aib: 2-аминоизомасляная кислота; CF: карбоксифлуоресцеин. *rt: время удерживания на колонке Phenomentex, Kinetex XB-C18 100Å 4,6×100 мм, поток 1 мл/мин; градиент 20-80% буфер B за 30 мин; буфер А: 0,1% TFA в H₂O; буфер B: 0,1% TFA в CH3CN. #MW: молекулярная масса.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композиции по пп.4-6 в прилагаемой формуле изобретения.

Композиция по изобретению содержит пептид, описанный в настоящем документе, и физиологически приемлемый носитель.

В контексте настоящего изобретения термин «носитель» относится к вспомогательному веществу, носителю, разбавителю или адъюванту, который может присутствовать, или все из них могут присутствовать в композиции по изобретению. Могут быть использованы любой носитель и/или вспомогательное вещество, в частности, если они подходят для местного введения композиции.

Предпочтительно, чтобы носитель являляся физиологически приемлемым, он облегчает пересечение кожного барьера и позволяет достичь самых глубоких слоев эпидермиса, где пептиды оказывают свое восстановительное действие.

В рамках изобретения предпочтительным носителем являются липосомы.

Обычно используемые липосомы основаны на везикулах, содержащих один или более липидных бислоев, которые заключают водную среду. Липосомальная мембрана, имитирующая клеточную мембрану, содержит смесь фосфолипидов, или фосфолипидов и холестерина, которые придают частицам преимущества биосовместимости и высокую способность проникновения через мембраны и физиологические барьеры.

Липосомы ведут себя как системы, инкапсулирующие пептиды, которые, таким образом, физически изолированы от окружающей среды и, следовательно, защищены от каких-либо химических или ферментативных процессов деградации до того, как они достигают целевой области. В описанной в настоящем документе композиции липосомы могут играть двойную роль носителя пептидов и биологически активных веществ. Например, в случае эритемы или сухости кожи липосомы могут взаимодействовать с липидами, белками и углеводами кожи, обеспечивая благотворное, увлажняющее и восстановительное действие на роговой слой.

Липосомы, присутствующие в составе композиции, переносят пептиды через эпидермис и нижележащие слои кожи до клеточного уровня, преодолевая клеточную мембрану. Липосомы сохраняют свои увлажняющие и регенеративные способности и способствуют повышению проникновения, растворимости или стабильности других веществ, изоляции их от окружающей среды и введению управляющего фактора в их фармакокинетику и фармакодинамику.

Предпочтительно, чтобы композиция по изобретению использовалась для местного применения путем ее нанесения на кожу лица и/или тела, нуждающегося в лечении.

Композиция может быть предназначена для косметического или фармацевтического применения.

Косметическая композиция может быть в твердой, полутвердой или жидкой форме.

Подходящие композиции в твердой форме включают кремы, гели, помады, пасты, мази.

Подходящие композиции в жидкой форме включают растворы, суспензии, лосьоны, сыворотку, эмульсии как масло в воде, так и воду в масле.

В предпочтительном варианте осуществления состав для местного применения представляет собой лосьон на основе липосом.

Композиции по изобретению могут содержать вспомогательные вещества, обычно используемые в составе препаратов для местного применения, такие как консерванты, бактерицидные агенты, стабилизаторы, антиоксиданты, эмульгаторы, буферы, увлажнители, красители и другие вспомогательные вещества, обычно используемые в фармацевтических или косметических методах изготовления, в количестве, согласующемся с тем, которое предусмотрено для обычных фармацевтических или косметических составов.

В случае составов в форме раствора, суспензии, лосьона, вода присутствует в качестве разбавителя или растворителя, необязательно смешанного с другими жидкостями, используемыми для составления косметических композиций, таких как, например, спирты и гликоли, такие как пропиленгликоль.

Предпочтительно, чтобы композиция могла содержать жировую основу, такую как, например, липосомы или жирные кислоты, используемые в косметических композициях.

Композиция по изобретению может содержать пептиды в количестве в диапазоне от 0,0001% до 10% по массе, исходя из химикофизических характеристик продукта, типа желаемой активности, типа и степени площади, подлежащей лечению, пола и возраста пользователя.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления косметическая композиция по изобретению дополнительно содержит одно или более активных веществ, таких как минералы, питательные микроэлементы, витамины и, необязательно, другие биологически активные вещества.

В качестве примера, композиция может включать один или более дополнительных компонентов, выбранных из аминокислот, таких как аргинин, пролин, глицин, лизин, полипептиды, гидроксикислот, таких как молочная, гликолевая, салициловая, винная, яблочная кислота и т.д., натуральных экстрактов или эфирных масел растений, витаминов, таких как токоферол, липоевая кислота, ретинол, пантенол, аскорбиновая кислота, флавоноиды и т.д., гликанов, таких как гиалуроновая кислота, хондроитина сульфата, гепариноидов и т.д., белков, таких как белки пшеницы, коллаген, силиконы, молекул различных типов, таких как аллантоин, кофеин, бисаболол, коэнзим Q10.

Композиция по изобретению находит применение в фармацевтической и/или косметической области.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к пептидам с общей формулой (1) для применения в качестве лекарственного средства.

В соответствии с одним аспектом изобретение относится к пептидам для целей применения по п.8.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления пептиды по изобретению и композиции, содержащие их, находят применение при лечении субъектов, пораженных Xeroderma Pigmentosum (XP), которые имеют генетическую мутацию, вызывающую нарушения в репарации ДНК, и высокий риск развития злокачественных опухолей. В ходе клинических испытаний композиция, описанная в настоящем документе при местном применении, продемонстрировала вклад в элиминацию CPD в месте применения и продемонстрировала эффективность в предотвращении развития актинического кератоза и карцином в базальных клетках у пациентов с ХР.

Композиция для местного применения, содержащая один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, с последовательностями SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3-8, их производные или солей, при нанесении на кожу пересекает роговой слой и проникает через наиболее глубокие слои эпидермиса, накапливаясь в кератиноцитах и в клетках Лангерганса. Эти свойства более заметны, когда пептиды композиции переносятся липосомами.

В соответствии с некоторыми аспектами настоящее изобретение относится к косметической композиции, содержащей по меньшей мере один пептид, описанный в настоящем документе, и косметически приемлемое вспомогательное вещество или носитель для предотвращения или уменьшения признаков старения кожи, в частности, в результате воздействия ультрафиолетового излучения.

В соответствии с другими аспектами настоящее изобретение относится к косметической композиции, содержащей по меньшей мере один пептид, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или носитель для вариантов применения, описанных в данном документе.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к косметическому набору для лечения кожи, в частности, для депигментации кожи по п.10 формулы изобретения.

В одном варианте осуществления депигментирующий косметический набор содержит:

- композицию для пилинга кожи, содержащую α-гидроксикислоту, такую как, например, гликолевая кислота, миндальная кислота и койевая кислота;

- буферный раствор после пилинга;

- липосомальный состав XP-1 (Ptd-1 (WFKYYGKAIY) 0,1% в липосомах, как, например, в примере 1)

- гель на основе S-арбутина и липосом;

- солнцезащитный крем для последующего применения.

Липосомальная композиция ХР-1 регенерирует поврежденные клетки кожи за счет репарирующей активности.

Кроме того, другими важными активными функциональными ингредиентами набора являются гликолевая кислота, миндальная кислота и койевая кислота (в составе раствора для пилинга) и S-арбутин (в составе отбеливающего состава).

Гликолевая кислота представляет собой α-гидроксикислоту, обычно используемую в качестве компонента дерматологических препаратов с отшелушивающим действием (для пилинга), благодаря своей продемонстрированной возможности ускорения оборота клеток в роговом слое.

Миндальная кислота также является α-гидроксикислотой, с проверенным антибактериальным, а также слущивающими свойствами, эффективными для улучшения текстуры кожи, акне, преждевременного старения кожи и гиперпигментации.

Койевая кислота (АС) представляет собой природный метаболит, продуцируемый грибами, который обладает способностью ингибировать активность тирозиназы в синтезе меланина. АС и ее производные используются в косметике в качестве антиоксидантов, антипролиферативных средств, противовоспалительных и осветляющих кожу агентов.

Кроме того, S-арбутин, благодаря его действию в качестве ингибитора фермента тирозиназы, представляет собой антимутагенное вещество, которое, таким образом, обладает осветляющим и депигментирующим действием.

Нижеследующие примеры вариантов осуществления настоящего изобретения приведены далее в качестве иллюстрации.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Терапевтическое применение пептидов у пациентов, страдающих от Xeroderma pigmentosum

Тесты на эффективность in vitro проводили с 7 выбранными липосомальными составами, каждый из которых содержит различный пептид:

- XP-1: Ptd-1 (WFKYYGKAIY) 0,1% в липосомах;

- XP-1: Ptd-2 (карбоксифлуоресцеин-WFKYYGKAIY) 0,1% в липосомах;

- XP-1: Ptd-3 (пальмитоил-WFKYYGKAIY) 0,1% в липосомах;

- XP-5: Ptd-5 (пальмитоил-WFKYYGK-Aib-IY) 0,1% в липосомах;

- XP-1: Ptd-6 (карбоксифлуоресцеин-WFKYYGK-Aib-IY) 0,1% в липосомах;

- XP-1: Ptd-7 (Aib-WFKYYGKAIY) 0,1% в липосомах;

- XP-1: Ptd-1 (WFKYYGKAIY) 0,01% в липосомах.

Липосомальные препараты применяли в тестах на эффективность на эпителиальных клетках KB-31 и первичных фибробластах, выделенных биопсией у пациентов, страдающих Xeroderma pigmentosum (XPC-F).

Проведенные тесты включают:

a) Тест на поглощение клетками на клеточной линии клеток KB-31 с помощью проточной цитометрии. Образец XP-1 сравнивали с липосомальным составом, не содержащим пептидов (XP-0), липосомальным составом, содержащим фермент эндонуклеазу T4V (XP-T4V) и липосомальным составом XP-2, содержащим тот же пептид, функционализированный карбоксифлуоресцеином (CF).

b) Оценку поглощения липосом клетками фибробластов XPC-F посредством визуализации живых клеток с использованием липосомального состава XP-2, содержащей пептид, функционализированный флуорофором карбоксифлуоресцеином (CF).

c) Оценку биологической активности липосомальных составов на:

- фибробластах XPC-F путем анализа уровней транскрипции, со сравнением между размножающимися клетками, клетками, облученными УФ-излучением и необработанными, облученными клетками, обработанными липосомальным составом XP-T4V, и облученными клетками, обработанными липосомальным составом XP-1;

- на эпителиальных клетках KB-31, для тестирования биологической активности липосомальных составов XP-1, XP-3, XP-5, XP-6, XP-7, XP-8, путем оценки уровней экспрессии генов.

d) Оценку биологической активности липосомальных составов на XPC-F путем исследования жизнеспособности клеток и исследования клеточного цикла, при сравнении между необлученными клетками, необработанными облученными клетками, облученными клетками, обработанными композицией XP-T4V, и клетками, облученными и обработанными липосомальными пептидами.

1.1 Результаты тестов in vitro

a) Тест поглощения на кератиноцитах KB-31.

Поглощение клетками составов XP-0, XP-1, XP-T4V и XP-2 контролировали проточной цитометрией. Для анализа клетки KB-31 обрабатывали композициями в концентрациях в диапазоне от 10 до 50 мкл/мл. Через 72 часа от начала обработки клетки анализировали с использованием проточного цитометра BD FACSCanto II. Анализ образцов, обработанных составом XP-2, показал значительное количество флуоресцирующих клеток (>90%), подтверждающих выраженное поглощение клетками пептида, меченного флуорофором. Также важно подчеркнуть, что через 72 часа от обработки флуоресцентный сигнал все еще может обнаруживаться.

b) Оценка поглощения клетками липосом на фибробластах XPC-F посредством визуализации живых клеток.

Для проверки поглощения клетками липосом, клетки XPC-F обрабатывали раствором (20 мкл/мл), содержащим состав XP-2 и немедленно подвергали УФ-облучению (300-800 нм), в дозе 360 Вт/м² в течение 7 минут с использованием солнечного симулятора [SunTest CPS+ (ATLAS, Urai, Italy)]. В качестве контролей использовали клетки XPC-F, обработанные таким же липосомным составом и необлученные. Через 10 минут после окончания облучения изображения клеток в динамике получали с помощью конфокальной цейтраферной микроскопии, используя систему Cell-Observer (Zeiss), снабженную инкубационной камерой, которая гарантирует контролируемые атмосферные условия (37°С, 5% СО₂). После введения флуоресцентного сигнала липосомы XP-2 отслеживали в течение 2 часов.

Было обнаружено, что XPC-F-клетки успешно поглощали липосомы XP-2 и сохраняли внутриклеточную флуоресценцию в течение 2-часовой инкубации.

Исследование подчеркивает, что клетки, которые были подвергнуты обработке и не облучались, способны интернализировать липосомы; однако только после облучения из-за изменений в клеточной среде, вызванной этим стрессом, липосомальная структура способна постепенно высвобождать пептид внутри ядра и цитоплазмы.

c) Оценка биологической активности липосомальных составов на фибробластах XPC-F и кератиноцитах KB-31 путем анализа уровней транскрипции.

Субконфлюэнтные культуры клеток XPC-F обрабатывали липосомальными составами XP-T4V и XP-1 (20 мкл/мл) и подвергали воздействию УФ-излучения (300-800 нм) в дозе 360 Вт/м² (SunTest CPS+ - ATLAS, Urai, Italy) в течение 7 минут.

Параллельно, субконфлюэнтные культуры эпителиальных клеток KB-31 обрабатывали липосомальными составами XP-1, XP-3, XP-5, XP-6, XP-7, XP-8 (20 мкл/мл) и облучали УФ-лучами (300-800 нм, дозой 360 Вт/м², 7 минут) с использованием SunTest CPS simulator+ - ATLAS, Urai, Italy.

В конце облучения клетки XPC-F и KB-31 выдерживали в культуре в течение 6 часов в растворе, содержащем липосомы. В качестве контроля каждого типа клеток использовали клетки, не обработанные каким-либо составом и необлученные, а также клетки, подвергнутые облучению в отсутствие обработки липосомальными составами.

Общую клеточную РНК экстрагировали через 6 часов с использованием раствора TRI Reagent (Zymo Research, USA), следуя протоколу, указанному производителем. После определения количества РНК с помощью NanoDrop 2000 (Thermo-Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) образцы анализировали с помощью одностадийной qRT-PCR с использованием набора qPCRBIO SYGREEN (Resnova, Italy), олигонуклеотидов (Invitrogen™ Life Technologies) и системы ПЦР в режиме реального времени Mic Real-time PCR (Bio Molecular Systems). Это исследование служило для оценки уровней транскрипции нескольких генов, участвующих в сигнальных путях, вовлеченных в стресс при облучении.

Проводили анализ следующих генов:

- BCL2 (B-клеточная лимфома/лейкоз-2): представляет собой антиапоптотический ген, который предотвращает или уменьшает клеточный апоптоз, активированный широким диапазоном стимулов, включая УФ-излучение.

- CCNB1 (циклин В1): представляет собой регуляторную субъединицу циклинзависимой киназы (CDK), необходимую для правильного механизма управления развитием клеточного цикла от фазы G2 до фазы M. Исследование этого гена проводили, поскольку по литературным данным известно, что УФ-излучение вызывает блокировку клеточного цикла в фазе G2.

- р53: представляет собой ген семейства белков, подавляющих опухоли, необходимый для стимуляции эффективной эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) после индуцированного УФ-лучами повреждения ДНК и вовлеченный в индукцию апоптоза клеток, неспособных к восстановлению повреждений, индуцированных УФ-облучением.

- p21: представляет собой регулятор клеточного цикла, который активируется на транскрипционном уровне белком р53. Этот белок индуцирует замедление клеточного цикла. Снижение экспрессии этого гена приводит к ускорению клеточного цикла.

- p27: представляет собой показатель геномной стабильности, который уменьшается в случае облучения.

- p66Shc: представляет собой показатель окислительного стресса, который активен на митохондриальном уровне; при активации p66Shc защищает клетку от активных форм кислорода (ROS).

- ErbB3 (HER3): кодирует EGF-рецептор 3. Потеря этих рецепторов приводит к возникновению отрицательного воздействия на кожу и регенеративные процессы в ней.

- TNFR1: представляет собой ген, кодирующий рецептор 1 фактора некроза опухоли-α (TNF-α), вовлеченный в поддержку воспалительного ответа через апоптоз.

- TNFR2: представляет собой ген, кодирующий рецептор 2 фактора некроза опухоли-α (TNF-α), вовлеченный в воспалительный ответ в качестве положительного регулятора выживаемости клеток.

- FGFR2: представляет собой ген, кодирующий рецептор 2 фактора роста фибробластов 7 (FGF7). Он действует в качестве медиатора действия FGF7 и, по-видимому, повышается в опухолях. Снижение его экспрессии подавляет рост опухоли.

Результаты, приведенные в нижеследующих таблицах, представляют собой сравнение уровней экспрессии маркеров в клетках, обработанных выбранными липосомальными составами, относительно клеток, не обработанных и подвергаемых воздействию УФ-облучения.

XPC-F XP-T4V XP-1 BCL2 НЭ НЭ CCNB1 НЭ Увелич. p53 Увелич. НЭ p21 Снижен. Снижен. p27 Снижен. Снижен. p66Shc Увелич. NE ErbB3 (HER3) Увелич./НЭ NE TNFR1 НЭ Снижен. TNFR2 НЭ Увелич. FGFR2 НЭ Снижен.

Увеличение экспрессии: Увелич.; Снижение экспрессии: Снижен.; Нет эффекта: НЭ.

KB-31 XP-1 XP-3 XP-5 XP-6 XP-7 XP-8 BCL2 Увелич. Увелич. Увелич. Увелич. Увелич. НЭ CCNB1 НЭ Увелич. Увелич. НЭ НЭ НЭ p53 НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ p21 Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. p27 Увелич. НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ p66Shc НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ ErbB3
(HER3) Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. Снижен. TNFR1 НЭ НЭ Увелич. НЭ НЭ НЭ TNFR2 НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ НЭ FGFR2 Н.Экспр. Н.Экспр. Н.Экспр. Н.Экспр. Н.Экспр. Н.Экспр.

Увеличение экспрессии: Увелич.; Снижение экспрессии: Снижен.; Нет эффекта: НЭ; Н.Экспр.: Нет экспрессии.

В итоге собранные данные показали, что УФ-облучение запускает панель клеточных механизмов, которые управляют апоптозом, клеточным циклом, регуляцией уровня окислительного стресса и восприимчивостью к факторам роста. Обработка клеток липосомными пептидами имеет явно выраженное влияние на уровни экспрессии для некоторых проанализированных генов.

Композиции XP-T4V и XP-1 имеют эффекты, которые отличаются в двух типах клеток, что подчеркивают, как фибробласты и эпителиальные клетки синергически играют различные роли в гомеостазе кожи.

В частности, анализ, проводимый на XPC-F, подчеркивает, как снижение экспрессии факторов, которые отрицательно регулируют прогресс клеточного цикла, а также пролиферацию (например, p21 и p27) уравновешивается путем повышения экспрессии опухолевых супрессоров, оказывающих защитный эффект в отношении начала рака, что подчеркивает безопасность используемых составов.

Исследование, проведенное на KB-31, показывает сходные эффекты, полученные на липосомальных составах, которые были более выражены у составов XP-3 и XP-5.

d) Оценка биологической активности липосомальных составов с помощью теста жизнеспособности клеток на XPC-F.

Субконфлюэнтные культуры XPC-F обрабатывали липосомальными составами XP-T4V, XP-1, XP-3, XP-5, XP-6, XP-7 и XP-8 (20 мкл/мл) и подвергали УФ-облучению (300-800 нм) в дозе 360 Вт/м² в течение 7 минут с использованием SunTest CPS simulator+ (ATLAS, Urai, Italy).

Фибробласты, поддерживаемые в культуре, с тем же временем без обработки/облучения и клетки, не обработанные липосомными составами, но облученные, использовали в качестве контроля.

В конце облучения клетки поддерживали в культуре в полной ростовой среде в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов, перед переходом к анализу жизнеспособности клеток.

Фибробласты, открепленные от планшета трипсином-EDTA, обрабатывали с использованием набора для определения жизнеспособности клеток BD Cell Viability kit (BD, New Jersey, USA): инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре с раствором тиазола оранжевого (TO) (42 мкмоль/л) и раствором пропидия йодида (PI) (4,3 ммоль/л). После этой процедуры образцы анализировали с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II.

Полученные результаты показаны ниже:

24 ч -ЛИПО/-УФ -ЛИПО/+УФ XP-T4V XP-1 XP-3 XP-5 XP-6 XP-7 XP-8 Живые клетки 80,0% 73,8% 73,6% 63,1% 59,4% 58,3% 46,6% 49,9% 73,6% Апоптотические клетки 18,1% 26,3% 23,2% 33,8% 38,9% 41,3% 50,2% 48,3% 26,2% 48 ч -ЛИПО/-УФ -ЛИПО/+УФ XP-T4V XP-1 XP-3 XP-5 XP-6 XP-7 XP-8 Живые клетки 86,7% 76,7% 71,0% 76,3% 72,2% 69,0% 57,9% 70,2% 67,5% Апоптотические клетки 10,9% 14,1% 15,1% 10,6% 15,5% 16,9% 20,7% 15,7% 17,6% 72 ч -ЛИПО/-УФ -ЛИПО/+УФ XP-T4V XP-1 XP-3 XP-5 XP-6 XP-7 XP-8 Живые клетки 62,5% 48,0% 47,3% 41,1% 39,9% 42,4% 46,4% 57,1% 45,6% Апоптотические клетки 33,9% 47,7% 47,8% 41,5% 56,2% 52,3% 47,3% 47,3% 44,7%

-ЛИПО/-УФ: отсутствие липосомальных составов/отсутствие облучения; -ЛИПО/+УФ: отсутствие липосомальных составов/присутствие облучения.

В этом исследовании клетки продемонстрировали снижение жизнеспособности клеток через 24 часа после УФ-облучения независимо от предварительной обработки липосомными составами, однако более низкий процент апоптотических клеток был получен с использованием составов XP-T4V, XP-1 и XP-8.

Через 48 ч от облучения было обнаружено, что количество клеток в апоптозе было ниже в культурах, обработанных липосомальными составами, особенно в случае ХР-1, по сравнению с клетками в облученном образце в отсутствие липосомальных составов. Наконец, через 72 часа после облучения фибробласты, которые подвергались предварительной обработке тестируемыми составами, показывают результаты, сопоставимые с результатами, полученными в облученных клетках в отсутствие составов.

Анализ клеточного цикла проводили с использованием субконфлюэнтных культур XPC-F, обработанных липосомными составами XP-T4V и XP-1 (20 мкл/мл). Затем клетки облучали, как описано выше. В качестве контролей использовали необработанные фибробласты с липосомальными/необлученными составами и клетки, не обработанные липосомальными составами/подвергнутые облучению.

После облучения клетки культивировали в ростовой среде в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов. В каждой временной точке оценку образца проводили с помощью проточного цитометра BD FACSCanto II.

Исследование клеточного цикла облученных фибробластов, через 24 часа после облучения, показывает, что оба состава (XP-T4V и XP-1) способны замедлять клеточный цикл у клеток, вероятно, чтобы способствовать прохождению процессов репарации ДНК. В частности, состав XP-1 индуцировал увеличение процента клеток на стадии G2. Через 48 часов после облучения более высокий процент клеток в фазе S и G2 появился в образцах, обработанных обоими липосомными составами, что позволяет предположить, что цикл клеток не блокируется. Те же эффекты, показанные в течение 48 часов, также появились через 72 часа после облучения. Таким образом, можно предположить, что функция пептидов на клеточном уровне специфично коррелирует с продлением фазы, предшествующей апоптозу, давая клетке более длинный интервал времени для восстановления повреждений с конечным эффектом предотвращения апоптоза.

Пример 2

1. Схема клинического исследования

Для оценки эффективности и переносимости косметического набора, описанного в примере 4, проводили его клиническое исследование на основе тестов оптической колориметрии, видеодерматоскопии и самооценки с помощью опросника у пациентов. Клиническое исследование проводили открытое, одноцентровое, под дерматологическим контролем в течение 4 недель. Было предусмотрено сравнение на одном субъекте (метод половины лица) между эфективностью процедуры пилинга (раствор для пилинга+буферный раствор после пилинга+солнцезащитный фильтр SPF 50+) с добавлением или без добавления обоих депигментирующих продуктов: XP-1 и липосомального геля с S-арбутином.

Исследование проводилось на 20 субъектах женского пола в возрасте 39-60 лет (средний возраст=50) с гиперпигментированными пятнами кожи на поверхности.

Поверхностный химический пилинг проводили билатерально на всей поверхности лица (за исключением век) субъектов, используя раствор для пилинга и соответствующую щетку. После появления эритемного и слабого отбеливающего эффекта на обрабатываемой коже, реакцию нейтрализовали с использованием буферного раствора после пилинга.

Дальнейшее лечение субъекты продолжали независимо в домашних условиях, нанося следующие продукты на одну сторону лица два раза в день (утром и вечером, предпочтительно, в одно и то же время):

- липосомальный состав XP-1 (непосредственно на точки гиперпигментации, выбранные дерматологом во время предварительного осмотра),

- липосомальный гель с S-арбутином (на всю поверхность той же половины лица).

Наконец, солнцезащитный фильтр (SPF 50+) наносили билатерально утром и вечером на всю поверхность лица в течение всего исследования. Для определения депигментирующей активности исследуемого лечения, измерение яркости кожи, а также цвет и размер (площадь и периметр) выбранных гиперпигментированных точек проводили билатерально, с помощью оптической колориметрии и анализа изображений в следующие моменты времени:

- базовая линия (первичный осмотр - Т0, перед процедурой пилинга)

- через 2 недели после пилинга (промежуточный осмотр - Т2)

- через 4 недели после пилинга (промежуточный осмотр - Т4).

В ходе испытаний два человека выбыли из исследования; испытуемые №№ 10 и 15 преждевременно прервали процесс по личным причинам. Статистический анализ проводили на 18 субъектах, которые завершили исследование по протоколу. Никаких других важных событий, которые могли бы исказить результаты испытаний, не происходило в течение периода исследования.

Эффективность депигменирующего набора в каждом временном интервале выражали в абсолютных значениях относительно базовой линии (Т0) и относительно контрольной стороны лица, подвергнутой только процедуре пилинга.

Обработку данных проводили следующим образом:

- Оценка относительно базовой линии (Т0)

Непараметрический тест (тест Фридмана), в случаях, когда гипотеза нормальности была отклонена с помощью теста нормальности Шапиро-Уилка (порог 5%); или параметрический тест (тест Anova для повторных измерений) в случаях, когда гипотеза нормальности была подтверждена; в случае статистически значимого результата после обоих тестов проводили скорректированный тест Холма-Сидака.

- Сравнение между двумя обработками (пиинг+депигментирование относительно пилинга) в T0, T2 и T4

Непараметрический тест (тест Уилкоксона), в случаях, когда гипотеза нормальности была отклонена с помощью теста нормальности Шапиро-Уилка (порог 5%); или параметрический тест (парный t-тест), в случаях, когда гипотеза нормальности была подтверждена.

2. Результаты клинического исследования: эффективность продукта

2.1. Оценка цвета кожи (оптическая колориметрия)

В следующих таблицах приведены проценты изменения параметров L*, a* и b*, которые представляют, соответственно, яркость кожи (L*), покраснение (a*) и пигментацию (b*), измеренные на негиперпигментированной коже (нормальной коже) и на гиперпигментированной коже (непосредственно на пятнах). (Фигура X и X)

Результаты после: пилинга+депигментирующей обработки Нормальная кожа Гиперпигментированная кожа (пятна) % изменения относительно базовой линии % изменения относительно базовой линии L* a* b* L* a* b* T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 1,4% (*)(#) 1,5% -3,4% -5,7% -5,8% -5,1% (*) -0,1% 0,4% 1,0% -4,3% -8,6% -8,7% (*) Результаты после: пилинга Нормальная кожа Гиперпигментированная кожа (пятна) % изменения относительно базовой линии % изменения относительно базовой линии L* a* b* L* a* b* T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 -0,4% 1,2% -0,4% -6,1% -3,5% -0,8% -0,1% -0,2% 5,8% -1,4% -6,9% -7,6% (*) (*) p<0,05 по скорректированному тесту Холма-Сидака в сравнении с Т0. (#) р<0,01 по тесту знаковых рангов Уилкоксона в сравнении с Т0.

На негиперпигментированной коже (нормальной коже), подвергнутой пилингу+депигментированию, были показаны, начиная с контрольной точки Т2, следующие эффекты:

- клинически/статистически значимое улучшение яркости кожи (L*), статистически большее, чем результат, полученный на стороне лица, где проводили только пилинг;

- уменьшение покраснения кожи (a*), не обнаруживаемое только при пилинге,

- важное снижение пигментации кожи (b*), клинически более выраженное, чем при применении только пилинга.

Эти результаты показывают, что комплексная обработка усиливает и улучшает эффект осветляющего пилинга.

В конце всего исследования внешний вид кожи с обеих сторон лица, как правило, был более ярким и более однородным.

В случае гиперпигментированной кожи (с пятнами), хотя не было обнаружено статистически значимого различия между двумя сторонами лица, депигментирующая активность была более выражена на стороне, обработанной XP-1 и липосомальным гелем с S-арбутином, по сравнению со стороной, обработанной пилингом, с заметным уменьшением окрашивания и видимости пятен/пигментации кожи (b*).

2.2. Анализ изображения кожных пятен (видеодерматоскопия)

В следующих таблицах приведены процентные значения уменьшения площади и периметра пятен, измеренных с помощью анализа изображений:

Результат: после пилинга+депигментационной обработки Результат: после пилинга % изменения относительно базовой линии % изменения относительно базовой линии Площадь Периметр Площадь Периметр T2 T4 T2 T4 T2 T4 T2 T4 -10,4%
(*) -14,7%
(*) -8,6%
(*) -7,2%
(*) -12,3%
(*) -12,2%
(*) -4,2% -5,6% (*) p<0,05 Скорректированный тест Холма-Сидака по сравнению с T0.

Полученные результаты показали для комплексного депигментирующего воздействия (раствор для пилинга+состав XP-1 и липосомальный гель с S-арбутином), начиная с контрольной точки T2:

- Статистически значимое уменьшение площади темных пятен относительно Т0 по сравнению с применением только пилинга.

- Более заметное и статистически значимое уменьшение периметра темных пятен относительно T0, что указывает на более равномерное уменьшение гиперпигментации пятен.

2.3. Результаты самостоятельного анкетирования субъектов-участников

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ

Для 66% субъектов пятна были менее выраженными (эффект: средний - 33%, выраженный - 22%, очень выраженный - 11%), и 55,5% отмечали уменьшение размера (эффект: средний - 38,8%, выраженный - 16,7%) на стороне, подвергнутой комплексному пилингу и осветлению, с более выраженным общим депигментирующим эффектом, чем на стороне лица, подвергавшейся только пилингу, в 44% случаев. Было найдено, что улучшение яркости кожи и сухости кожи было сравнимо между 2 типами воздействия.

ОЦЕНКА КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРИЕМЛЕМОСТИ

Косметическая приемлемость продуктов (XP-1, липосомальный гель с S-арбутином, постпроцедурное осветляющее солнцезащитное средство) в общем была хорошая. В частности, 100% добровольцев считали хорошими-превосходными:

- липосомальный гель с S-арбутином в отношении: цвета (94% субъектов), отдушки до и после нанесения (72% случаев), текстуры (78% субъектов), растекаемости (94% субъектов), абсорбции (61% добровольцев), воздействия на кожу (72% субъектов) и отсутствия остатков после нанесения (83% добровольцев).

- Состав XP-1 - в отношении: цвета (94,5% субъектов), отдушки до и после нанесения (77,8% и 72,2% случаев, соответственно), текстуры (89% субъектов), растекаемости (83% субъектов), абсорбции (78% добровольцев), воздействия на кожу (83% субъектов) и отсутствия остатков после нанесения (94,5% добровольцев).

- Постпроцедурное осветляющее солнцезащитное средство в отношении: цвета (94% субъектов), отдушки до и после нанесения (77,8% субъектов), текстуры (100% субъектов), растекаемости (83% субъектов), абсорбции (72% добровольцев), воздействия на кожу (77,8% субъектов) и отсутствия остатков после нанесения (83% добровольцев).

3. Оценка переносимости

Суждение исследователей и добровольцев о переносимости тестируемых продуктов являлось хорошим/превосходным в 100% случаев лечения; связанные с лечением побочные эффекты не возникали в ходе исследования 3.

4. Заключение о исследовании

Результаты этого исследования подтвердили превосходную эффективность комплексного депигментирующего набора, содержащего продукты XP-1 и липосомальный гель с S-арбутином в сравнении с одним пилингом, давая более высокой осветляющую и антипигментирующую эффективность.

Побочные эффекты или реакции не возникали в ходе исследования; исследователи характеризуют переносимость исследуемого метода лечения как хорошую/превосходную.

Пример 3

Составы, содержащие липосомы из примера 1.

Составы, приведенные в примере 1, получали, исходя из основной композиции фосфолипидов в воде, стабилизированной с использованием консервантов, содержащей пептиды SEQ ID NO: 1-8, заключенные внутри липосомальной системы.

Концентрация липидов в композиции составляет 100 мМ, концентрация инкапсулированного пептида составляет 1 мМ.

INCI состава: вода, лецитин, Полисорбат 20, этилгексилглицерин, 1,2-гександиол, каприлилгликоль, спирт денатурир., пептид SEQ ID NO.1-7, токоферол, трополон.

Пример 4

Депигментирующий косметический набор, содержащий 5 продуктов (компонентов) с специфической активностью.

Раствор для пилинга представляет собой препарат, предназначенный для отслоения кожи, он оказывает свое действие за счет содержания двух α-гидроксикислот в сочетании с койевой кислотой. INCI состава: вода, гликолевая кислота, миндальная кислота, койевая кислота, полисорбат 20, этилгексилглицерин, 1,2-гександиол, каприлилгликоль, трополон.

Буферный раствор после пилинга состоит из буфера и должен нейтрализовать раствора для пилинга после завершения обработки. INCI буферного раствора представляет собой: воду, пентиленгликоль, динатрийфосфат, фосфат натрия.

Депигментирующий косметический набор также содержит солнцезащитный продукт с высокой степенью защиты, солнцезащитный фильтр SPF 50+. Его эффективность при защите кожи от лучей УФ-A и УФ-B достигается с использованием 3 различных солнцезащитных фильтров в комбинации INCI солнцезащитного продукта:

вода, каприл/каприновый триглицерид, пентиленгликоль, этилгексилстеарат, этилгексилметоксициннамат, диоксид титана, метиленбисбензотриазолил тетраметилфенол, пропиленгликоль, арахидиловый спирт, изононилизононаноат, бутилметоксидибензоилметан, бегениловый спирт, гиалуронат натрия, арахидилглюкозид, полиакриламид, мочевина, диоксид кремния, С13-14 изопарафин, диметикон, хлорид натрия, лаурет-7.

Наконец, набор содержит два продукта с целевым депигментирующим действием. Первый, называемый депигментирующим составом XP-1, представленным в примере 3, помогает поврежденным клеткам на стадии восстановления повреждений, вызванных облучением. Второй продукт представляет собой липосомальный гель с S-арбутином, его осветляющее действие на кожу обеспечивается благодаря арбутину, известному ингибитору меланина.

INCI продукта представляет собой: вода, лецитин, арбутин, глицерин, Полисорбат 20, этилгексилглицерин, 1,2-гександиол, каприлилгликоль, спирт денатур., токоферол, трополон.

Пример 5

Композиция в форме лосьона для косметического использования

Липосомальный состав, содержащий пептид по формуле SEQ ID NO: 1, был включен в лосьон после загара, который оказывает тройное действие на кожу - успокаивающее, регенерирующее и противодействующее старению. В INCI этого продукта входят: вода, глицерин, цетеариловый спирт, масло авокадо, миндальное масло, цетеарет-25, полиизосорбат 20, ментол, экстракт календулы ђлекарственной, гиалуронат натрия, мочевина, пептид SEQ ID NO: 1.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> I.R.A. ISTITUTO RICERCHE APPLICATE S.P.A.

<120> ПЕПТИДЫ С ЗАЩИТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК И ЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СОСТАВЫ

<130> P021264WO-01

<150> IT102019000019667

<151> 2019-10-23

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 12

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> Если присутствует, представляет собой CF(карбоксифлуоресцеин), пальмитоил

(CH3(CH2)14CO-), олеил(CH3(CH2)7(CH)2(CH2)7 CO-), стеарил

(CH3(CH2)16CO-), линолеил(CH3(CH2)4(CH)2CH2(CH)2(CH2)7CO-) или

линоленил(CH3CH2(CH)2CH2(CH)2CH2(CH)2(CH2)7CO-)

<220>

<223> SEQ ID NO:1

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 2

<223> Если присутствует, представляет собой Aib

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 3

<223> Trp, Phe or Tyr

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 4

<223> Trp, Phe or Tyr

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 5

<223> Lys

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 6

<223> Tyr, Trp, or Phe

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 7

<223> Tyr, Trp, or Phe

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 8

<223> Gly or Ala

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 9

<223> Lys

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 10

<223> Ala, or Aib

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 11

<223> Ile, Leu or Ala

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 12

<223> Tyr

<400> 1

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> Aib

<220>

<223> SEQ ID NO:2

<400> 2

Xaa Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Ile Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:3

<400> 3

Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Ile Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> CF (карбоксифлуоресцеин)

<220>

<223> SEQ ID NO:4

<400> 4

Xaa Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Ile Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> пальмитоил(CH3(CH2)14CO-)

<220>

<223> SEQ ID NO:5

<400> 5

Xaa Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Ile Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID NO:6

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 8

<223> Aib

<400> 6

Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Xaa Ile Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> пальмитоил(CH3(CH2)14CO-)

<220>

<223> SEQ ID NO:7

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 9

<223> Aib

<400> 7

Xaa Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Xaa Ile Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 1

<223> CF (карбоксифлуоресцеин)

<220>

<223> SEQ ID NO:8

<220>

<221> Нестандартный остаток

<222> 9

<223> Aib

<400> 8

Xaa Trp Phe Lys Tyr Tyr Gly Lys Xaa Ile Tyr

1 5 10

<---

Изобретение относится к пептидам, которые восстанавливают с помощью эксцизионной репарации нуклеотидов (NER), клеточной ДНК, поврежденной воздействием внешних агентов, в частности УФ-лучей, и к их применению при лечении кожи. Изобретение также относится к композиции для местного применения, содержащей пептиды, предпочтительно находящиеся в липосомах, для предотвращения и лечения повреждения кожи, вызванного воздействием УФ-лучей, в частности у субъектов, пораженных пигментной ксеродермой. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 пр.

1. Пептид или его соль, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1:

R1-Y-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10, где:

Xaa1 представляет собой Trp, Phe или Tyr;

Xaa2 представляет собой Trp, Phe или Tyr;

Xaa3 представляет собой Lys;

Xaa4 представляет собой Tyr, Trp или Phe;

Xaa5 представляет собой Tyr, Trp или Phe;

Xaa6 представляет собой Gly или Ala;

Xaa7 представляет собой Lys;

Xaa8 представляет собой Ala или Aib;

Xaa9 представляет собой Ile, Leu или Ala;

Xaa10 представляет собой Tyr;

Y, если присутствует, представляет собой Aib,

и где

R1, если присутствует, представляет собой H, CF (карбоксифлуоресцеин), пальмитоил (CH₃(CH₂)₁₄CO-), олеил (CH₃(CH₂)₇(CH)₂(CH₂)₇CO-), стеарил (CH₃(CH₂)₁₆CO-), линолеил (CH₃(CH₂)₄(CH)₂CH₂(CH)₂(CH₂)₇CO-) или линоленил (CH₃CH₂(CH)₂CH₂(CH)₂CH₂(CH)₂(CH₂)₇CO-).

2. Пептид по п.1, выбранный из группы, состоящей из

SEQ ID NO: Sequence 3 WFKYYGKAIY 4 CF-WFKYYGKAIY 5 Pal-WFKYYGKAIY 6 WFKYYGK-Aib-IY 7 Pal-WFKYYGK-Aib-IY 8 CF-WFKYYGK-Aib-IY 2 Aib-WFKYYGKAIY

3. Пептид по п.1 или 2, имеющий аминокислотную последовательность от N-конца до С-конца, представленную SEQ ID NO: 3.

4. Композиция для лечения заболевания, вызванного повреждением ДНК УФ-облучением, содержащая один или более пептидов, одинаковых или различных относительно друг друга, по любому одному из пп.1-3, и физиологически приемлемый носитель.

5. Композиция по п.4, где носитель содержит липосомы в качестве носителя для местного применения.

6. Композиция по п.4 или 5 в форме лосьона для местного применения, в которой пептиды заключены в липосомы и/или переносятся липосомами.

7. Пептид по любому одному из пп.1-3 или композиция по любому одному из пп.4-6 для применения в качестве лекарственного средства.

8. Пептид по любому одному из пп.1-3 или композиция по любому одному из пп.4-6 для применения при лечении заболевания, вызванного повреждением ДНК УФ-облучением, в частности для лечения пигментной ксеродермы или злокачественных или предраковых состояний кожи.

9. Применение пептида по любому одному из пп.1-3 или композиции по любому одному из пп.4-6 для лечения косметического несовершенства кожи, в частности пятен на коже, или дисхромии, или морщин на лице.

10. Набор для косметического лечения кожи, содержащий депигментирующий косметический набор, включающий:

- косметическую композицию для пилинга кожи, предпочтительно, содержащую α-гидроксикислоту, предпочтительно, гликолевую кислоту, миндальную кислоту или койевую кислоту;

- композицию по любому одному из пп.4-6;

- композицию, предпочтительно, в гелевой форме, содержащую липосомы и S-арбутин и липосомы; и, необязательно,

- буферную композицию, применяемую после пилинга, предпочтительно, в виде раствора;

- композицию для защиты от УФ-излучения, предпочтительно, в форме крема.