СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДОВ КРЕАТИНА Российский патент 2016 года по МПК C07C277/08 C07C279/14 C07K5/06 

Изобретение относится к области фармацевтической химии, а именно к способам получения биологически активных веществ, в частности, проявляющих антиишемическую активность амидов креатина общей формулы NH=C(NH₂)-N(CH₃)-CH₂-CO-RY*X, где R - аминокислотный остаток аминокислоты; Y - OR¹, NR²R³, где R¹ - Н, CH₂Ph, алкил C₁-C₃, R², R³=Н, алкил С₁-С₄; X - низкомолекулярная С₁-С₄ органическая кислота, или минеральная кислота или вода.

Ишемическое поражение головного мозга и миокарда приводит к развитию патофизиологических изменений в тканях, сопровождающихся нарушением метаболических процессов, нарушением энергетического тканевого метаболизма [Reichelt K.L. Acta Anesthesiol. Scand. 1978], развитием ацидоза, разрушением астроцитов [Hertz L.J. Cereb. Blood Flow Metab. 2004; 24:1241-8], компрессии капилляров головного мозга [Ames A.I. et al. 1968; 52:437-53].

Известна многочисленная группа лекарственных препаратов - тромболитики, антиагреганты, ноотропы и т.п., повышающих устойчивость тканей, в частности, головного мозга, к ишемии (Goodman Е. Gilman's. The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11 ed, McGraw-Hill, Medical Publ. Division, New York 2006; RU 1746886, 1991; WO 96/08527, 1996).

Недостатками большинства известных препаратов является узкий спектр действия, значительное количество побочных эффектов и противопоказаний, невысокая нейропротективная активность, ограниченность применения при острой и хронической ишемии головного мозга и остром инфаркте миокарда [The Cochrane Library, Issue 4, 2002. Oxford].

Поэтому разработка лекарственных препаратов для лечения и профилактики ишемии является важной проблемой.

Перспективным направлением профилактики и лечения ишемии является использование амидов креатина и их производных (RU 2354645, 2009; US 8,350,077 В2).

Амиды креатина проявляют нейропротективную активность при ишемии головного мозга [Burov S.V et all. J. Pept. Sci. 2011. V. 17. N.9. P. 620-626], а также антитромботическую и антиагрегантную активность, способствующую восстановлению кровотока [Веселкина О.С. и др. Вестник службы крови России, №3, с. 31-37, 2010], однако технология их получения не позволяет получать целевой продукт с высоким выходом. К тому же спектр получаемых амидов ограничен и нуждается в расширении. В этой связи остается важной задачей разработка более эффективных способов синтеза амидов креатина.

Известен способ получения амидов креатина и алифатических, ароматических или гетероароматических аминокислот или их производных, заключающийся в первоначальном получении полупродуктов, а именно амидов саркозина и алифатических, ароматических или гетероароматических аминокислот или их производных, дальнейшем гуанидилировании полупродуктов в полярных органических растворителях при температуре не более 50°С и получении амидов креатина [RU 2354645, 2009].

Недостатками указанного способа являются низкий выход целевого продукта, необходимость использовать при синтезе дорогостоящие гуанидилирующие агенты - бензотриазол-1-карбоксамидина тозилат, N,N′-дибензилоксикарбонил-1-Н-бензотриазол-1-карбоксимидин, что в целом обуславливает высокую себестоимость амидов креатина.

Наиболее близким к заявляемому изобретению, является способ получения амидов креатина и аминокислот или их производных [RU 2428414, 2011] в виде солей, заключающийся в обработке креатина или креатина моногидрата пара-толуолсульфокислотой в органическом растворителе, последующей обработкой реакционной смеси сложноэфирными или амидными производными аминокислот, в присутствии последовательно вводимых конденсирующего агента и основания.

Недостатком указанного способа является низкий выход амидов креатина, не превышающий 32% и ограниченный спектр получаемых препаратов. Кроме того, указанный способ, используя в процессе синтеза пара-толуолсульфокислоту (п-ТСК) или толуолсульфонаты, не обеспечивают полноту их удаления в процессе выделения и очистки целевого продукта. Вместе с тем, п-ТСК не является фармакологически приемлемой кислотой, и при попадании в организм может образовывать продукты, обладающие токсичностью.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание способа синтеза амидов креатина общей формулы NH=C(NH₂)-N(CH₃)-CH₂-CO-RY*X, где R - аминокислотный остаток аминокислоты; Y - OR¹, NR²R³, где R¹ - Н, CH₂Ph, алкил С₁-С₃; R², R³=Н, алкил С₁-С₄; X - низкомолекулярная С₁-С₄ органическая кислота или минеральная кислота или вода, обеспечивающего более высокий выход целевого продукта и его чистоту в соответствии с современными фармакопейными требованиями к новым фармацевтическим субстанциям.

Технический результат достигался путем обработки креатина пара-толуолсульфоновой кислотой в диметилформамиде с последующим взаимодействием полученного комплекса с производными аминокислот, в присутствии конденсирующего агента и основания, причем в качестве конденсирующего агента используют хлорангидрид моноэфира муравьиной кислоты, а в качестве основания N-метилморфолин или триэтиламин. При этом конденсирующий агент и основание вводят в реакционную смесь, одновременно в отличие от аналога, где вначале вводят конденсирующий агент, а затем, после него, вводят основание. Далее к реакционной смеси прибавляют ацетат щелочных металлов, отгоняют не менее 80% диметилформамида, активное начало экстрагируют полярным апротонным растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон и ацетонитрил, и отгоняют не менее 80% растворителя. Активное начало экстрагируют из остатка полярным апротонным растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон и ацетонитрил, растворитель отгоняют, остаток растворяют в полярном протонном растворителе, содержащем не менее одного ингредиента из группы, в которую входят вода, этиловый и изопропиловый спирт, муравьиная и уксусная кислоты. Пара-толуолсульфоновую кислоту удаляют путем хроматографирования на анионообменном сорбенте, растворитель отгоняют в присутствии низкомолекулярной С₁-С₄ органической кислоты или минеральной кислоты и спирта при pH не более 4,5. Остаток обрабатывают растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат, активное начало экстрагируют растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят этиловый и метиловый спирты, далее отгоняют не менее 70% растворителя. Остаток после отгонки обрабатывают растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат.

Было установлено, что одновременное введение конденсирующего агента, такого как хлорангидрид моноэфира муравьиной кислоты, и основания, такого как N-метилморфолин, триэтиламин, позволяет существенно увеличить выход амидов креатина на стадии синтеза, а прибавление к маточному раствору, получаемому после стадии синтеза, ацетата щелочных металлов, позволяет добиться более полного удаления хлорид-ионов, образующихся в реакции конденсации комплекса креамида с п-ТСК с производными аминокислот, что приводит к оптимизации процесса хроматографирования на анионообменном сорбенте и обеспечивает высокий выход и необходимую чистоту целевого продукта - содержание основного вещества в синтезированных амидах креатина по данным ОФ ВЭЖХ было не менее 98%, содержание хлорид-ионов - следовое (на уровне погрешности измерения), а содержание п-ТСК не превышало нескольких р.р.м.

В ходе синтеза, для предотвращения способности молекул аминокислот (и креатина) вступать в реакцию друг с другом, одну из одну из функциональных групп защищают, чтобы сделать инертной [S. Chandrudu, Р. Simerska,* and I.Т. Chemical Methods for Peptide and Protein Production. Molecules 2013, 18, 4373-4388; doi:10.3390]. Получают комплекс креатина с пара-толуолсульфокислотой, что позволяет защитить гуанидиновую группу креатина, и производными аминокислот, содержащими заместители по карбоксильной группе молекулы. В качестве таких производных аминокислот используют эфирные, амидные или нитро производные протеиногенных α-аминокислот, эфирные или амидные производные β-аланина. Термин «протеиногенные α-аминокислоты» понимается в соответствии с международной номенклатурой (NOMENCLATURE AND SYMBOLISM FOR AMINO ACIDS AND PEPTIDES. Pure & Appi. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984). В частности, в качестве протеиногенных α-аминокислот могут быть использованы ациклические или ароматические α-аминокислоты, О-этилтирозин, О-изопропилтирозин, пролин или гистидин и т.п.

В качестве креатина при синтезе может быть использован безводный креатин или креатина моногидрат.

В качестве хлорангидрида моноэфира муравьиной кислоты могут быть использованы изобутилхлорформиат или этилхлорформиат и их аналоги, в качестве основания - N-метилморфолин, триэтиламин и т.п. В качестве ацетатов щелочных металлов могут быть использованы безводный ацетат натрия или калия, гидраты ацетатов натрия или калия.

В качестве анионообменного сорбента оптимально использовать смолы на основе сополимеров стирола или на основе акриловых сополимеров содержащие третичные или четвертичные аммонийные группы, например Dowex 1x8, Amberlite IRA-67. Как правило, в качестве элюента применяют водный раствор муравьиной или уксусной кислот или водно-спиртовый растворитель.

В качестве низкомолекулярной С₁-С₄ органической кислоты могут быть использованы метансульфоновая, уксусная, фумаровая или янтарная кислота и т.п., а в качестве минеральной кислоты могут быть использованы такие кислоты, как ортофосфорная, соляная и т.п.

Контроль за ходом реакции, а также оценка выхода и чистоты амидов креатина осуществлены с использованием метода ОФ ВЭЖХ на хроматографе Alliance (Waters), колонка Zorbax Eclipse С18, 3,5 мкм, 3*100 мм (Agilent Technologies), элюирование в режиме линейного градиента от 100% фазы А (смесь буферного раствора, содержащего 0.01 М натрия октансульфоната и 0,02 М натрия дигидрофосфата (рН=3,0) с ацетонитрилом в соотношении 95:5) до 100% фазы Б за 30 мин (смесь буферного раствора, содержащего 0.01 М натрия октансульфоната и 0,02 М натрия дигидрофосфата (рН=3,0) с ацетонитрилом в соотношении 70:30), или в режиме линейного градиента от 100% фазы А (0,05 М ортофосфорная кислота в смеси вода : ацетонитрил в соотношении 95:5) до 100% фазы Б 0,05 М ортофосфорная кислота в смеси вода : ацетонитрил в соотношении 50:50) за 30 мин; детектирование - при 210 нм. Содержание п-ТСК в амидах креатина определено методом ОФ ВЭЖХ на хроматографе Alliance (Waters), колонка Symmetry С18, (Waters, США), подвижная фаза - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в смеси вода : ацетонитрил (97:3), детектирование при 220 нм. Сульфатную золу в амидах креатина пределяли по ЕР 8.2, содержание хлорид-ионов - методом аргентометрического титрования.

Структура полученных соединений подтверждена данными ЯМР спектроскопии ¹Н и ¹³С.

Сущность и преимущества заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата

1.1. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок солей N-метилморфолина отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В объединенном растворе определяют выход креатинглицин этилового эфира тозилата и содержание хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата составляет 72% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 29,3 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,99 г, 29,3 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку, охлажденному до комнатной температуры, прибавляют 40 мл ацетона, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе снижается до 5,6 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл воды, получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют уксусную кислоту до рН 4,3, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч. Осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, не растворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из объединенного раствора отгоняют 130 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре, осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира ацетата C₈H₁₆N₄O₃*C₂H₄O₂ составляет 3,67 г (35%). Содержание основного вещества 98,6%, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%; сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,06 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,96, 25,98, 39,72, 44,09, 55,30, 65,34, 160,55, 172,69, 174,24, 184,09.

1.2. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 51% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 35,1 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают и экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из объединенного водного экстракта отгоняют растворитель до объема 50 мл при пониженном давлении и температуре 40°С. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата. Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту, из полученного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата этилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира ацетата C₈H₁₆N₄O₃*C₂H₄O₂ составляет 2,83 г (27%). Содержание основного вещества 97%, посторонние примеси: креатинин - 1,5%, креатин - 0,5%; максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,9%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - 0,5 мМЭкв/г, п-ТСК - 150 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 1,91 (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,06 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,95, 25,99, 39,72, 44,11, 55,30, 65,34, 160,55, 172,71, 174,24, 184,09.

Пример 2. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата

2.1 Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицина изопропилового эфира гидрохлорида (5,84 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно в течение 30 мин изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют выход креатинглицин изопропилового эфира тозилата и содержание хлорид-ионов. Выход креатилглицин изопропилового эфира тозилата 79% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 29,0 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,95 г, 29,0 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку при комнатной температуре прибавляют 40 мл ацетона, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 5 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,7 мМЭкв. Из объединенного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин изопропилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,5. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин изопропилового эфира ацетата C₉H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ составляет 5,08 г (46%). Содержание основного вещества 98,7%, сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%,. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (6Н, д, 6,22 Гц, СН(СН₃)₂), 1,90 с (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 с (3Н, с, NCH₃), 4,02 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,23 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,05 (1H, м, СН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,49, 25,96, 39,72, 44,36, 55,29, 73,65, 160,54, 172,63, 173,69, 184,06.

2.2 Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин изопропилового эфира гидрохлорида (5,84 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин изопропилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатилглицин изопропилового эфира тозилата 41% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 36,3 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из объединенного водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая систему Buchi «Sepacore», колонка размером 30×250 мм, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с pH=7 (pH воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 35 мл ацетонитрила при температуре (-) 10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата изопропилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин изопропилового эфира ацетата C₉H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ составляет 2,33 г (21%). Содержание основного вещества - 97,4%, посторонние примеси: креатинин - 1,5%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированнаяй примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,7%; сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - 0,4 мМЭкв /г, п-ТСК - 150 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,25 (6Н, д, 6,22 Гц, СН(СН₃)₂), 1,90 с (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 с (3Н, с, NCH₃), 4,00 (2H, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,23 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,05 (1Н, м, СН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,49, 25,96, 39,72, 44,38, 55,29, 73,63, 160,55, 172,63, 173,69, 184,06.

Пример 3. Получение креатилглицин бензилового эфира ацетата и креатилглицина гидрата

3.1 Получение креатилглицин бензилового эфира ацетата и креатилглицин гидрата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), раствор глицин бензилового эфира тозилата (12,82 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В объединенном растворе определяют содержание креатинглицин бензилового эфира тозилата. Выход креатилглицин бензилового эфира тозилата 60% мольн. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (2,10 г, 15,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл тетрагидрофурана при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл тетрагидрофурана, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл тетрагидрофурана. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 2,6 мМЭкв. Из объединенного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. К остатку прибавляют 75 мл бидистиллированной воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, растворяют остаток в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота: изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатинглицин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицина бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×230 мм, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатинглицин бензилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (75:25) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатинглицин бензилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона.

К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 125 мл (75%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицина бензилового эфира ацетата C₁₃H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ 5,40 г (42%). Содержание основного вещества 97,9%, сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,3%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,92 (3Н, с, СН₃СООН), 2,99 (3Н, с, NCH₃), 4,10 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,19 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,22 (2Н, с, CH₂Ph), 7,45 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 25,97, 39,62, 44,11, 55,26, 70,44, 131,08, 131,53, 137,80, 160,48, 172,63, 173,86, 184,09.

Стадия С. Получение креатилглицин гидрата.

5,40 г креатилглицин бензилового эфира ацетата, полученного на стадии Б, растворяют в 100 мл метанола и гидрируют над палладием на углероде - Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают и промывают 10 мл смеси вода : метанол 10:90. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из объединенного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С. Получают продукт в виде белого порошка. Выход креатилглицин гидрата C₆H₁₂N₄O₃*H₂O 2,67 г (37%). Содержание основного вещества 98,2%, посторонние примеси: креатинин - 0,8%, креатин - 0,3%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%; сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 2 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 3,06 (3Н, с, NCH₃), 3,81 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20 (2Н, с, NHCH₂CO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 39,75, 45,94, 55,47, 160,60, 171,94, 179,22.

3.2 Получение креатинглицин бензилового эфира ацетата и креатилглицин гидрата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин бензилового эфира тозилата (12,82 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин бензилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатинглицин бензилового эфира тозилата 42% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 18,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза - водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, к остатку прибавляют 60 мл смеси вода : изопропиловый спирт (50:50), перемешивают, получают раствор креатинглицин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицина бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS). Раствор креатинглицин бензилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 20% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,3 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 35 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатилглицин бензилового эфира ацетата C₁₃H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ 2,83 г (22%). Содержание основного вещества 97,5%, посторонние примеси: креатинин - 1,3%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%; сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 5 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,92 (3Н, с, СН₃СООН), 2,99 (3Н, с, NCH₃), 4,11 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,19 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,22 (2Н, с, CH₂Ph), 7,43 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 25,95, 39,62, 44,11, 55,26, 70,44, 131,10, 131,53, 137,80, 160,48, 172,62, 173,86, 184,09.

Стадия С. Получение креатилглицин гидрата.

2,83 г креатилглицин бензилового эфира ацетата, полученного на стадии Б, растворяют в 70 мл метанола и гидрируют над Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают и промывают 10 мл смеси вода : метанола 10:90. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Получают продукт в виде белого порошка.

Выход креатилглицин гидрата C₆H₁₂N₄O₃*H₂O 1,61 г (22%). Содержание основного вещества 97,5%, посторонние примеси: креатинин - 1,3%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%; сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв /г, п-ТСК - 5 ppm. Спектр ЯМР ¹H (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 3,07 (3Н, с, NCH₃), 3,81 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,21 (2Н, с, NHCH₂CO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 39,75, 45,94, 55,49, 160,60, 171,93, 179,22.

Пример 4. Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата

4.1 Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор α-аланин изопропилового эфира гидрохлорида (6,37 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и триэтиламин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют, в растворе определяют содержание креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата 44% мольн., количество хлорид-ионов 28,5 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,88 г, 28,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов 5,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,6 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют 5 М раствор уксусной кислоты (16 мл, 16 ммоль) до pH 4,5, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (79%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата C₁₀H₂₀N₄O₃*C₂H₄O₂ 4,32 г (37%). Содержание основного вещества 98,2%, посторонние примеси: креатинин - 0,8%, креатин - 0,3%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%; сульфатная зола - 0,01%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,25 (6Н, м, ОСН(СН₃)₂), 1,42 (3Н, д, 6,98 Гц, СН₃СНСО), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 3,05 (3Н, с, NCH₃), 4,20 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,37 (1Н, м, СН₃СНСО), 5,02 (1H, м, ОСН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 18,48, 23,42, 25,96, 39,69, 51,92, 55,06, 73,54, 160,49, 171,69, 176,75, 183,97.

4.2 Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор α-аланин изопропилового эфира гидрохлорида (6,37 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют триэтиламин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, температуру доводят до комнатной. Осадок солей триэтиламина отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата 36% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 33,5 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-α-аланин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с pH=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 5 мл уксусной кислоты, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата изопропилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатил-α-аланин изопропилового эфира ацетата C₁₀H₂₀N₄O₃*C₂H₄O₂ 2,64 г (23%). Содержание основного вещества 97,7%, посторонние примеси: креатинин - 1,3%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%; сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - 0,5 мМЭкв/г, п-ТСК - 152 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,27 (6Н, м, ОСН(СН₃)₂), 1,42 (3Н, д, 6,99 Гц, СН₃СНСО), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 3,06 (3Н, с, NCH₃), 4,20 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,38 (1Н, м, СН₃СНСО), 5,02 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 18,48, 23,42, 25,95, 39,69, 51,92, 55,06, 73,54, 160,47, 171,69, 176,75, 183,97.

Пример 5. Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината

5.1 Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор β-аланин изопропилового эфира гидрохлорида (6,37 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют, в растворе определяют содержание креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата 67% мольн., суммарное количество хлорид-ионов 29,5 мМЭкв. К раствору прибавляют безводный калия ацетат (2,90 г, 29,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, упаривают 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 5 г целита, промывают его 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатил-β-аланин изопропилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют янтарную кислоту (1,89 г, 16 ммоль), перемешивают 20 мин до полного растворения (pH раствора 4,4), отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл смеси ацетон: ацетонитрил 90:10, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл ацетонитрила, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают ацетонитрилом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината C₁₀H₂₀N₄O₃*C₄H₆O₄ 4,58 г (33%). Содержание основного вещества 98,3%, посторонние примеси: креатинин - 0,9%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%; сульфатная зола - 0,03%, п-ТСК - 3 ppm, хлорид-ионы - следы. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,24 (6Н, д, 6,27 Гц, ОСН(СН₃)₂), 2,56 (4Н, с, (СН₂СООН)₂), 2,59 (2Н, т, 6,44 Гц, СН₂СН₂СО), 3,03 (3Н, с, NCH₃), 3,51 (2Н, т, 6,44 Гц, СН₂СН₂СО), 4,11 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,99 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,53, 25,96, 36,69, 38,01, 39,63, 55,40, 72,58, 160,48, 171,69, 176,34, 181,85.

5.2 Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор β-аланин изопропилового эфира гидрохлорида (6,37 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение 10 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата 43% мольн., количество хлорид-ионов 36,3 мМЭкв. Из маточного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении при температуре 50°С, остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината.

Удаление п-ТСК кислоты и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-β-аланин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют янтарную кислоту (1,89 г, 16 ммоль), перемешивают до полного растворения, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатил-β-аланин изопропилового эфира сукцината C₁₀H₂₀N₄O₃*C₄H₆O₄ 3,38 г (24%). Содержание основного вещества 97,4%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,6 мМЭкв/г, п-ТСК - 140 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,7%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,6%, сумма неидентифицированных примесей - 0,9%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,24 (6Н, д, 6,27 Гц, ОСН(СН₃)₂), 2,57 (4Н, с, (СН₂СООН)₂), 2,59 (2Н, т, 6,44 Гц, СН₂СН₂СО), 3,03 (3Н, с, NCH₃), 3,51 (2Н, т, 6,44 Гц, СН₂СН₂СО), 4,11 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,98 (1H, м, ОСН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,53, 25,96, 36,69, 38,02, 39,63, 55,40, 72,58, 160,48, 171,68, 176,34, 181,85.

Пример 6. Получение креатиллейцин изопропиламида ацетата

6.1 Получение креатиллейцин изопропиламида ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатиллейцин изопропиламида тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцина изопропиламида гидрохлорида (7,93 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатиллейцин изопропиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатиллейцин изопропиламида тозилата 52% мольн., количество хлорид-ионов 29,3 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,99 г, 29,3 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (90,9%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в объединенном растворе 5,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатиллейцин изопропиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцин изопропиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическа система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатиллейцин изопропиламида тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатиллейцин изопропиламида ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из объединенного раствора отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С 130 мл (79%) этанола, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатиллейцин изопропиламида ацетата C₁₃H₂₇N₅O₂*C₂H₄O₂ 3,72 г (28%). Содержание основного вещества 98,4%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 2 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,2%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,92 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,13 (6Н, м, ОСН(СН₃)₂), 1,50-1,70 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,91 (3Н, с, СН₃СООН), 3,03 (3Н, с, NCH₃), 3,92 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂), 4,20 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,26 (1Н, м, NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,55, 23,90, 24,64, 25,85, 26,94, 39,70, 42,68, 44,49, 55,02, 55,59, 160,44, 171,66, 175,77, 183,75.

6.2 Получение креатиллейцин изопропиламида ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатиллейцин изопропиламида тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцин изопропиламида гидрохлорида (7,93 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение 10 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), далее, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатиллейцин изопропиламида тозилата. Выход креатиллейцин изопропиламида тозилата 40% мольн., количество хлорид-ионов 37,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл, 2 раза экстрагируют хлороформом. Из объединенного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатиллейцин изопропиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцин изопропиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатиллейцин изопропиламида тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 5 мл уксусной кислоты, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 35 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок креатиллейцин изопропиламида ацетата отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатиллейцин изопропиламида ацетата C₁₃H₂₇N₅O₂*C₂H₄O₂ составляет 2,77 г (21%). Содержание основного вещества 97,7%, сульфатная зола - 0,05%, хлорид-ионы - 0,4 мМЭкв/г, п-ТСК - 160 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,8%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,92 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,13 (6Н, м, ОСН(СН₃)₂), 1,50-1,70 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,91 (3Н, с, СН₃СООН), 3,03 (3Н, с, NCH₃), 3,92 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂), 4,20 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,26 (1Н, м, NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,55, 23,90, 24,64, 25,85, 26,94, 39,70, 42,68, 44,49, 55,02, 55,59, 160,44, 171,66, 175,77, 183,75.

Пример 7. Получение креатиллейцин бензилового эфира ацетата и креатиллейцина полугидрата

7.1 Получение креатиллейцин бензилового эфира ацетата и креатиллейцина полугидрата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатиллейцин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцин бензилового эфира тозилата (14,95 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатиллейцин бензилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатиллейцин бензилового эфира тозилата 60% мольн, количество хлорид-ионов 15,1 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (2,05 г, 15,1 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл метилэтилкетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл метилэтилкетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл метилэтилкетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 2,6 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. К остатку прибавляют 75 мл бидистиллированной воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, из объединенного органического экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, растворяют остаток в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатиллейцин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцина бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатиллейцин бензилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (75:25) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов анализа для получения креатиллейцин бензилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч. Осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (79%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатиллейцин бензилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₄O₃*C₂H₄O₂ составляет 6,00 г (40%). Содержание основного вещества 97,7%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,2%, креатин - 0,6%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹H (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,96 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,48-1,67 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 2,00 (3Н, с, СН₃СООН), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 4,24 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,57 (1Н, м, NHCHCO), 5,27 (2Н, м, CH₂Ph), 7,48 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 22,99, 24,31, 25,63, 26,69, 39,27, 41,42, 54,13, 54,75, 70,01, 130,66, 131,11, 137,52, 160,13, 171,60, 176,32, 183,72.

Стадия С. Получение креатиллейцин полугидрата.

6,0 г креатиллейцин бензилового эфира ацетата, полученного на стадии Б, растворяют в 120 мл метанола и гидрируют над Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают, промывают 10 мл смеси вода : метанол 10:90. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Получают продукт в виде белого порошка.

Выход креатиллейцин полугидрата C₁₀H₂₀N₄O₃*0,5H₂O 2,65 г (33%). Содержание основного вещества 98,0%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,91 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,61 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 4,12-4,26 (3Н, м, N(CH₃)CH₂CO и NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,32, 25,12, 27,35, 39,76, 43,21, 55,34, 56,79, 160,53, 171,32, 182,50.

7.2 Получение креатиллейцин бензилового эфира ацетата и креатиллейцина полугидрата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатиллейцин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцин бензилового эфира тозилата (14,95 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлор-формиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатиллейцин бензилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатиллейцин бензилового эфира тозилата 48% мольн., количество хлорид-ионов 17,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза - водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, остаток растворяют в 60 мл смеси вода : изопропиловый спирт (50:50), получают раствор креатиллейцин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцина бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом обращенно фазовой (ОФ) хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Наносят раствор креатиллейцин бензилового эфира тозилата на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 20% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,3 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом качественных реакций и ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатиллейцин бензилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₄O₃*C₂H₄O₂ 3,30 г (22%). Содержание основного вещества 97,3%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 5 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,6%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹H (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,96 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,48-1,67 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 2,00 (3Н, с, СН₃СООН), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 4,24 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,57 (1Н, м, NHCHCO), 5,27 (2Н, м, CH₂Ph), 7,48 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 22,99, 24,31, 25,63, 26,69, 39,27, 41,42, 54,13, 54,75, 70,01, 130,66, 131,11, 137,52, 160,13, 171,60, 176,32, 183,72.

Стадия С Получение креатиллейцин полугидрата.

3,3 г креатиллейцин бензилового эфира ацетата, полученого на стадии Б, растворяют в 90 мл метанола и гидрируют над Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают и промывают 10 мл смеси вода : метанол 10:90. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Получают продукт в виде белого порошка.

Выход креатиллейцин полугидрата C₁₀H₂₀N₄O₃*0,5H₂O 2,72 г (21%). Содержание основного вещества 97,4%, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,6%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%; сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 5 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,91 (6Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,61 (3Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 4,12-4,26 (3Н, м, N(CH₃)CH₂CO и NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,32, 25,12, 27,35, 39,76, 43,21, 55,34, 56,79, 160,53, 171,32, 182,50.

Пример 8. Получение креатилфенилаланин этилового эфира ацетата

8.1 Получение креатилфенилаланин этилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилфенилаланин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор фенилаланина этилового эфира гидрохлорида (8,73 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилфенилаланин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилфенилаланин этилового эфира тозилата 70% мольн., количество хлорид-ионов 27,6 мМЭкв. К раствору прибавляют калия ацетат (2,69 г, 27,6 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют при пониженном давлении и температуре 45°С 50 мл (91%) ДМФА. К остатку прибавляют 40 мл ацетонитрила при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетонитрила, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетонитрила. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 5,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. К остатку прибавляют 75 мл дистиллированной воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, растворяют остаток в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатилфенилаланин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилфенилаланин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (75:25) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование проводят при длине волны 280 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл смеси ацетон : ацетонитрил (80:20), перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором, отгоняют 130 мл (78%) растворителя при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилфенилаланин этилового эфира ацетата C₁₅H₂₂N₄O₃*C₂H₄O₂ 5,44 г (38%). Содержание основного вещества 98,8%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 0,7%, креатин - 0,2%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,25 (3Н, т, 7,15 Гц, ОСН₂СН₃), 1,94 (3Н, с, СН₃СООН), 2,90 (3Н, с, NCH₃), 3,03 (1Н, м, PhCH₂), 3,27 (1H, м, PhCH₂), 4,09 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,20 (2Н, кв, 7,15 Гц, ОСН₂СН₃), 4,78 (1Н, м, PhCH₂CH), 7,34 (5Н, м, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,85, 25,91, 39,24, 39,52, 54,98, 56,88, 65,37, 129,82, 131,35, 131,78, 138,94, 160,27, 171,44, 175,46, 183,89.

8.2 Получение креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилфенилаланин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор фенилаланина этилового эфира гидрохлорида (8,73 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатилфенилаланин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилфенилаланин этилового эфира тозилата 57% мольн., количество хлорид-ионов 37,4 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, остаток растворяют в 60 мл смеси вода : изопропиловый спирт (75:25). Получают раствор креатилфенилаланин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатинилфенилаланин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК кислоты и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатилфенилаланин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 20% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,4 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатилфенилаланин этилового эфира ацетата C₁₅H₂₂N₄O₃*C₂H₄O₂ 3,76 г (27%). Содержание основного вещества 97,7%, посторонние примеси: креатинин - 1,2%, креатин - 0,7%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%; сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 6 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,25 (3Н, т, 7,15 Гц, ОСН₂СН₃), 1,94 (3Н, с, СН₃СООН), 2,91 (3Н, с, NCH₃), 3,03 (1Н, м, PhCH₂), 3,27 (1Н, м, PhCH₂), 4,09 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,21 (2Н, кв, 7,15 Гц, ОСН₂СН₃), 4,78 (1Н, м, PhCH₂CH), 7,34 (5Н, м, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,85, 25,91, 39,24, 39,51, 54,98, 56,88, 65,37, 129,82, 131,35, 131,78, 138,94, 160,27, 171,44, 175,46, 183,89.

Пример 9. Получение креатинил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата и креатиларгинина ацетата

9.1 Получение креатинил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата и креатиларгинина ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатинил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата (18,30 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата 76% мольн., количество хлорид-ионов 16,5 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (2,24 г, 16,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 53 мл (92%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 5,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 75 мл дистиллированной воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия, из объединенного органического экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (75:25) со скоростью 0,55 см/мин. Детектирование проводят при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют для получения креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,5. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (78,7%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₈O₅*C₂H₄O₂ 7,33 г (40%). Содержание основного вещества 98,3%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 5 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%;. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,61 (2Н, м, СН₂), 1,74-1,89 (2Н, м, СН₂), 1,93 (3Н, с, СН₃СООН), 2,99 (3Н, с, NCH₃), 3,25 (2Н, м, CH₂NHC(NH)NHNO₂), 4,20 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,50 (1Н, м, NHCHCO), 5,22 (2Н, м, CH₂Ph), 7,43 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 25,9, 30,3, 39,7, 43,0, 55,1, 55,5, 70,5, 131,2, 131,5, 137,8, 160,5, 161,5, 172,1, 175,7, 184,0.

Стадия С. Получение креатиларгинин ацетата.

7,33 г креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата, полученного на стадии Б, растворяют в 130 мл метанола и гидрируют над Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают, промывают 10 мл метанола. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из объединенного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С. Получают продукт в виде белого порошка.

Выход креатиларгинин ацетата C₁₀H₂₁N₇O₃*C₂H₄O₂ 4,96 г (28%). Содержание основного вещества 98,5%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,60-1,93 (4Н, м, СН₂СН₂), 1,93 (3Н, с, СН₃СООН), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 3,20 (2Н, м, NHCH₂), 4,14-4,26 (3Н, м, N(CH₃)CH₂CO и NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,28, 25,10, 29,11, 37,57, 41,10, 53,12, 55,45, 157,25, 158,33, 169,22, 178,90, 181,10.

9.2 Получение креатинил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата и креатиларгинина ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатинил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата (18,30 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (5,25 г, 45,8 ммоль), затем в течение 30 мин, по каплям прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата 60% мольн., количество хлорид-ионов 20,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза - водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, остаток растворяют в 60 мл смеси воды с изопропиловым спиртом (50:50). Получают раствор креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от смеси 0,05 М уксусной кислоты с изопропиловым спиртом (80:20) до смеси 0,05 М уксусной кислоты с изопропиловым спиртом (50:50) со скоростью 0,3 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом качественных реакций и ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 30 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₈O₅*C₂H₄O₂ 3,67 (20%). Содержание основного вещества 97,4%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 7 ppm посторонние примеси: креатинин - 1,2%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,61 (2Н, м, СН₂), 1,74-1,89 (2Н, м, СН₂), 1,92 (3Н, с, СН₃СООН), 2,99 (3Н, с, NCH₃), 3,24 (2Н, м, CH₂NHC(NH)NHNO₂), 4,20 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,50 (1Н, м, NHCHCO), 5,22 (2Н, м, CH₂Ph), 7,43 (5Н, м, CH₂Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 25,9, 30,3, 39,7, 43,1, 55,1, 55,6, 70,5, 131,2, 131,5, 137,8, 160,5, 161,6, 172,1, 175,7, 184,0.

Стадия С. Получение креатиларгинин ацетата.

3,67 г полученного креатил-ω-нитроаргинин бензилового эфира ацетата, полученного на стадии Б, растворяют в 80 мл метанола и гидрируют над Pd/C в течение 3 ч. Полноту удаления бензильной группы контролируют с помощью ТСХ в системе ацетонитрил : вода : уксусная кислота 6:1:1. Катализатор отфильтровывают и промывают 10 мл метанола. Маточный раствор и промывные жидкости объединяют, из объединенного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С. Получают продукт в виде белого порошка.

Выход креатиларгинина ацетата C₁₀H₂₁N₇O₃*C₂H₄O₂ 1,93 г (18%). Содержание основного вещества 97,8%, сульфатная зола 0,04%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 7 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,2%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%;. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,60-1,93 (4Н, м, СН₂СН₂), 1,93 (3Н, с, СН₃СООН), 3,03 (3Н, с, NCH₃), 3,21 (2Н, м, NHCH₂), 4,14-4,26 (3Н, м, N(CH₃)CH₂CO и NHCHCO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,28, 25,10, 29,11, 37,57, 41,10, 53,12, 55,44, 157,25, 158,33, 169,22, 178,92, 181,10.

Пример 10. Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата

10.1 Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор О-изопропилтирозина метилового эфира гидрохлорида (10,40 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,0 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют выход содержание креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата, количество хлорид-ионов. Выход креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата 65% мольн., количество хлорид-ионов 28,0 мМЭкв. К раствору прибавляют калия ацетат (2,75 г, 28,0 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, суммарное содержание хлорид-ионов снижается до 3,1 мМЭкв. Отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл тетрагидрофурана при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл тетрагидрофурана, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл тетрагидрофурана. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,6 ммоль. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 75 мл воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия, из объединенного органического экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислоты с этиловым спиртом (60:40). Получают раствор креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : этиловый спирт (75:25) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 280 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов анализа для получения креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл н-бутилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором, отгоняют 130 мл (78,7%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₄O₄*C₂H₄O₂ 7,03 г (37%). Содержание основного вещества 98%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,22 (6Н, д, 6,11 Гц, СН(СН₃)₂), 1,83 (3Н, с, СН₃СООН), 2,78 (3Н, с, NCH₃), 2,79-2,88 (1Н, м, CH₂PhOiPr), 3,12-3,17 м (1H, м, CH₂PhOiPr), 3,68 (3Н, с, ОСН₃), 3,90-4,07 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,50-4,60 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂), 4,65-4,67 (1Н, м, NHCHCO), 6,87 (2Н, д, 8,65 Гц, Ph), 7,11 (2Н, д, 8,61 Гц, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 21,08, 23,26, 35,84, 36,82, 52,42, 53,00, 54,16, 71,81, 116,68, 129,38, 130,48, 155,84, 157,75, 168,85, 173,34, 181,37.

10.2 Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор О-изопропилтирозина метилового эфира гидрохлорида (10,40 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, последовательно прибавляют изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В растворе определяют содержание креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата 45% мольн., количество хлорид-ионов 37,1 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислоты с этиловым спиртом (60:40). Получают раствор креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 30% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,3 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатил-О-изопропилтирозин метилового эфира ацетата C₁₇H₂₆N₄O₄*C₂H₄O₂ 3,33 г (21%). Содержание основного вещества 97,5%, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,6%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%; сульфатная зола - 0,05%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 5 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,22 (6Н, д, 6,11 Гц, СН(СН₃)₂), 1,83 (3Н, с, СН₃СООН), 2,79 (3Н, с, NCH₃), 2,79-2,88 (1Н, м, CH₂PhOiPr), 3,12-3,17 м (1H, м, CH₂PhOiPr), 3,67 (3Н, с, ОСН₃), 3,90-4,07 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,50-4,60 (1Н, м, ОСН(СН₃)₂), 4,65-4,67 (1H, м, NHCHCO), 6,87 (2Н, д, 8,65 Гц, Ph), 7,11 (2Н, д, 8,61 Гц, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 21,08, 23,25, 35,84, 36,82, 52,42, 53,01, 54,16, 71,81, 116,68, 129,38, 130,48, 155,84, 157,75, 168,84, 173,34, 181,37.

Пример 11. Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата

11.1 Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор О-этилтирозина изобутиламида гидрохлорида (12,04 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют, определяют содержание креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата 62% мольн., количество хлорид-ионов 26,5 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,61 г, 26,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении, прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 5,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 75 мл дистиллированной воды, экстрагируют 3×100 мл хлористого метилена. Органические экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида натрия, из органического экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (80:20) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование проводят при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, к остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, не растворившийся остаток отфильтровывают, промывают на фильтре этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором, отгоняют 130 мл (79%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этил ацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата C₁₉H₃₁N₅O₃*C₂H₄O₂ 6,29 г (38%). Содержание основного вещества 98,4%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 0,9%, креатин - 0,9%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,63 (6Н, м, СН(СН₃)₂), 1,28 (3Н, т, 7,02 Гц, СН₂СН₃), 1,42-1,53 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,83 (3Н, с, СН₃СООН), 2,70-2,75 (1Н, м, CH₂PhOEt), 2,85 (3Н, с, NCH₃), 2,97-2,99 (3Н, м, CH₂PhOEt и СН₂СН(СН₃)₂), 3,98-4,11 (4Н, м, СН₂СН₃ и N(CH₃)CH₂CO), 4,44 (1Н, м, NHCHCO), 6,87 (2Н, д, 8,69 Гц, Ph), 7,13 (2Н, д, 8,67 Гц, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 13,90, 19,15, 23,23, 27,73, 36,48, 36,92, 46,75, 52,39, 55,72, 64,45, 115,00, 128,84, 130,44, 157,05, 157,75, 168,79, 172,54, 181,37.

11.2 Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают, прибавляют раствор О-этилтирозина изобутиламида гидрохлорида (12,04 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлор-формиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточнике определяют содержание креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата 51% мольн., количество хлорид-ионов 39,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза водой. Органическую фазу упаривают при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатил-О-этилтирозин изобутиламида тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 30% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,4 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 45 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатил-О-этилтирозин изобутиламида ацетата C₁₉H₃₁N₅O₃*C₂H₄O₂ 4,21 г (25%). Содержание основного вещества 97,0%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,15 мМЭкв/г, п-ТСК - 7 ppm посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 1,0%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,3%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,63 (6Н, м, СН(СН₃)₂), 1,28 (3Н, т, 7,02 Гц, СН₂СН₃), 1,42-1,53 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,84 (3Н, с, СН₃СООН), 2,70-2,75 (1Н, м, CH₂PhOEt), 2,83 (3Н, с, NCH₃), 2,97-2,99 (3Н, м, CH₂PhOEt и СН₂СН(СН₃)₂), 3,98-4,11 (4Н, м, СН₂СН₃ и N(CH₃)CH₂CO), 4,44 (1Н, м, NHCHCO), 6,87 (2Н, д, 8,69 Гц, Ph), 7,13 (2Н, д, 8,67 Гц, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 13,91, 19,15, 23,23, 27,73, 36,48, 36,92, 46,75, 52,39, 55,72, 64,45, 115,01, 128,84, 130,44, 157,04, 157,75, 168,79, 172,54, 181,37.

Пример 12. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

12.1 Получение креатилглицин этилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, этилхлорформиат (4,97 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 67% мольн., количество хлорид-ионов 29,2 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,97 г, 29,2 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, элюат утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов 5,6 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическа система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,035 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование проводят при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, не растворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из объединенного раствора отгоняют 130 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл смеси этилацетат : тетрагидрофуран 80:20, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира ацетата C₈H₁₆N₄O₃*C₂H₄O₂ 3,94 г (38%). Содержание основного вещества 98,4%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 0,9%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,07 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,96, 25,99, 39,72, 44,09, 55,30, 65,34, 160,55, 172,69, 174,24, 184,09.

12.2 Получение креатилглицин этилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно этилхлорформиат (4,97 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 55% мольн., количество хлорид-ионов 36,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении при температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом. Из объединенного водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата этилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира ацетата C₈H₁₆N₄O₃*C₂H₄O₂ 2,30 г (22%). Содержание основного вещества 97%, п-ТСК - 150 ppm, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - 0,5 мМЭкв/г, посторонние примеси: креатинин - 1,5%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,9%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 1,91 (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,07 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4H, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,95, 25,99, 39,72, 44,11, 55,30, 65,32, 160,55, 172,71, 174,24, 184,09.

Пример 13. Получение креатилтриптофан метилового эфира ацетата

13.1 Получение креатилтриптофан метилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилтриптофан метилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор триптофан метиловый эфир гидрохлорида (9,82 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилтриптофан метилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилтриптофан метилового эфира тозилата 67% мольн., количество хлорид-ионов 29,5 мМЭкв. К объединенному раствору прибавляют калия ацетат (2,92 г, 29,7 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 44 мл (80%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл метилэтилкетона при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают его 40 мл метилэтилкетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл метилэтилкетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют 200 мл хлористого метилена, раствор промывают 4 раза по 100 мл водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, растворяют остаток в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатилтриптофан метилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилтриптофан метилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×230 мм, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилтриптофан метилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (80:20) со скоростью 0,45 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилтриптофан метилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл н-бутилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл этилацетата, перемешивают 3 ч. Осадок отделяют фильтрацией, промывают этилацетатом (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 116 мл (70%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилтриптофан метилового эфира ацетата C₁₆H₂₁N₅O₃*C₂H₄O₂ 7,8 г (52%). Содержание основного вещества 98,0%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,8%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹H (DMSO-d⁶), δ, м.д. (J, Гц): 1,67 (3Н, с, СН ₃СООН), 2,74 (3Н, с, ОСН ₃) 3,05-3,20 (2Н, м, Ind-CH ₂), 3,59 (3Н, с, NCH ₃), 4,02 (2Н, м, N(CH₃)CH ₂CO), 4,57 (1H, т, 5,87 Гц, COCHNH

CO), 6,99 (1Н, м, ArH), 7,07 (1H, м, ArH), 7,19 (1Н, с, ArH), 7,34 (1Н, д, 8,31 Гц, ArH), 7,50 (1Н, д, 7,82 Гц, ArH). Спектр ЯМР ¹³С (DMSO-d⁶), δ, м.д.: 1,18, 19,26, 19,32, 28,43, 29,12, 29,28, 75,69, 80,30, 80,40, 105,24, 107,69, 141,40, 145,79, 150,31, 152,43, 174,74

13.2 Получение креатилтриптофан метилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилтриптофан метилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор триптофан метилового эфира гидрохлорида 9,82 г (38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В растворе определяют содержание креатилтриптофан метилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилтриптофан метилового эфира тозилата 50% мольн., количество хлорид-ионов 37,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза - водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусной кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатилтриптофан метилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилтриптофан метилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатилтриптофан метилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 20% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,3 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,5, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 40 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатилтриптофан метилового эфира ацетата C₁₆H₂₁N₅O₃*C₂H₄O₂ 5.1 г (34%). Содержание основного вещества 97,3%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - 0,1 мМЭкв/г, п-ТСК - 7 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,4%, креатин - 0,8%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,67 (3Н, с, CH ₃COOH), 2,74 (3Н, с, ОСН ₃) 3,05-3,20 (2Н, м, Ind-CH ₂), 3,59 (3Н, с, NCH ₃), 4.02 (2Н, м, N(CH₃)CH ₂CO), 4,57 (1Н, т, 5,87 Гц, COCHNHCO), 6,99 (1Н, м, ArH), 7,07 (1Н, м, ArH), 7,19 (1H, с, ArH), 7,34 (1Н, д, 8,31 Гц, ArH), 7,50 (1H, д, 7,82 Гц, ArH). Спектр ЯМР ¹³С (DMSO-d⁶), δ, м.д.: 1,18, 19,26, 19,32, 28,43, 29,12, 29,28, 75,69, 80,30, 80,40, 105,24, 107,69, 141,40, 145,79, 150,31, 152,43, 174,74

Пример 14. Получение креатиллейцин диэтиламида ацетата

14.1 Получение креатиллейцин диэтиламида ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатиллейцин диэтиламида тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцин диэтиламида гидрохлорида 8,47 г (38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатиллейцин диэтиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатиллейцин диэтиламида тозилата 60% мольн., количество хлорид-ионов 27,5 мМЭкв. К раствору прибавляют калия ацетат (2,70 г, 27,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетонитрила при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетонитрила, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетонитрила. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,7 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С. Остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатиллейцин диэтиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцин диэтиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка 49×200 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатиллейцин диэтиламида тозилата наносят на колонку, элюируют смесью 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (80:20) со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов ВЭЖХ анализа для получения креатиллейцин диэтиламида ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл этилацетата, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают этилацетатом (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (79%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатиллейцин диэтиламида ацетата C₁₄H₂₉N₅O₂*C₂H₄O₂ 5,39 г (40%). Содержание основного вещества 98,0%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин -1,0%, креатин - 0,7%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,85 (3Н, д, 3,02 Гц, СН(СН₃)₂), 0,87 (3Н, д, 2,52 Гц, СН(СН₃)₂), 1,06 (3Н, т, 7,05 Гц, СН₂СН₃), 1,25 (3Н, т, 7,05 Гц, СН₂СН₃), 1,43 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,65 (2Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,88 (3Н, с, СН₃СООН), 2,96 (3Н, с, NCH₃), 3,07-3,58 (4Н, м, СН₂СН₃), 4,18 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,70 (1Н, м, COCHNHCO, под сигналом остаточной воды). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 11,96, 13,23, 20,30, 22,48, 24,48, 37, 08, 41,28, 42,63, 49,01, 52,36, 157,77, 168,97, 173,05, 181,25. Спектр ЯМР ¹Н (DMSO-d⁶), δ, м.д. (J, Гц): 0,89 (3Н, д, 4,16 Гц, СН(СН₃)₂), 0,907 (3Н, д, 4,40 Гц, СН(СН₃)₂), 1,01 (3Н, т, 7,09 Гц, СН₂СН₃), 1,18 (3Н, т, 7,09 Гц, СН₂СН₃), 1,32 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,66 (2Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,69 (3Н, с, СН₃СООН), 2,85 (3Н, с, NCH₃), 3,07-3,50 (4Н, м, СН₂СН₃), 4,03 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,74 (1Н, м, COCHNHCO), 7,0-9,5 (5Н, COCHNHCO и NH₂(NH)C*AcOH).

14.2 Получение креатиллейцин диэтиламида ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатиллейцин диэтиламида тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), суспензию перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор лейцин диэтиламида гидрохлорида 8,47 г (38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатиллейцин диэтиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатиллейцин диэтиламида тозилата 41% мольн., количество хлорид-ионов 38,2 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона, остаток растворяют в 300 мл н-бутилового спирта, 4 раза промывают 5% раствором NaHCO₃, 2 раза водой. Из органической фазы отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл смеси 0,05 М уксусная кислота : изопропиловый спирт (50:50). Получают раствор креатиллейцина диэтиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатиллейцин диэтиламида ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ОФ хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 22,5×150 мм, заполненная сорбентом YMC*Gel ODS в 0,05 М уксусной кислоте). Раствор креатиллейцин диэтиламида тозилата наносят на колонку, элюируют в режиме линейного градиента от 0,05 М уксусной кислоты до 20% изопропилового спирта в 0,05 М уксусной кислоте со скоростью 0,35 см/мин. Фракции собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонитрила, отделяют фильтрованием и высушивают.

Выход креатиллейцин диэтиламида ацетата C₁₄H₂₉N₅O₂*C₂H₄O₂ 3,31 г (24%). Содержание основного вещества 97,2%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - 0,15 мМЭкв/г, п-ТСК - 8 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,1%, креатин - 0,8%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,85 (3Н, д, 3,02 Гц, СН(СН₃)₂), 0,87 (3Н, д, 2,52 Гц, СН(СН₃)₂), 1,06 (3Н, т, 7,05 Гц, СН₂СН₃), 1,25 (3Н, т, 7,05 Гц, СН₂СН₃), 1,43 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,65 (2Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,88 (3Н, с, СН₃СООН), 2,96 (3Н, с, NCH₃), 3,07-3,58 (4Н, м, СН₂СН₃), 4,18 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,70 (1Н, м, COCHNHCO, под сигналом остаточной воды). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 11,96, 13,23, 20,30, 22,48, 24,48, 37,08, 41,28, 42,63, 49,01, 52,36, 157,77, 168,97, 173,05, 181,25. Спектр ЯМР ¹Н (DMSO-d⁶), δ, м.д. (J, Гц): 0,89 (3Н, д, 4,16 Гц, СН(СН₃)₂), 0,907 (3Н, д, 4,40 Гц, СН(СН₃)₂), 1,01 (3Н, т, 7,09 Гц, СН₂СН₃), 1,18 (3Н, т, 7,09 Гц, СН₂СН₃), 1,32 (1Н, м, СН(СН₃)₂), 1,66 (2Н, м, СН₂СН(СН₃)₂), 1,69 (3Н, с, СН₃СООН), 2,85 (3Н, с, NCH₃), 3,07-3,50 (4Н, м, СН₂СН₃), 4,03 (2Н, м, N(CH₃)CH₂CO), 4,74 (1Н, м, COCHNHCO), 7,0-9,5 (5Н, COCHNHCO и NH₂(NH)C*AcOH).

Пример 15. Получение креатилпролин н-бутиламида ацетата

15.1 Получение креатилпролин н-бутиламид ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилпролин н-бутиламид тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,7 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор пролин н-бутиламида (6,49 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре ДМФА (2×5 мл), охлажденным до температуры 0°С. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилпролин н-бутиламида тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилпролин н-бутиламида тозилата 52% мольн., количество хлорид-ионов 28,0 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,8 г, 28,0 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 53 мл (93%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 8 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 3,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатилпролин н-бутиламида тозилата.

Стадия Б. Получение креатилпролин н-бутиламид ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту проводят методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилпролин н-бутиламида тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,7 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин изопропилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,3. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С до окончания погона, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 134 мл (79%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилпролин н-бутиламида ацетата C₁₃H₂₅N₅O₂*C₂H₄O₂ 3,78 г (29%). Содержание основного вещества 97,1%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатин - 0,5%, креатинин - 1,0%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,7%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 0,88 (3Н, м, СН₂СН₂СН₂СН₃), 1,30 (2Н, м, СН₂СН₂СН₂СН₃), 1,47 (2Н, м, СН₂СН₂СН₂СН₃), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 1,91 (1Н, м, Pro), 2,01 (2H, м, Pro), 2,26 (1Н, м, Pro), 3,04 (3Н, с, NCH₃), 3,19 (2Н, м, СН₂СН₂СН₂СН₃), 3,58 (2Н, м, Pro), 4,36 (3Н, м, Pro и N(CH₃)CH₂CO). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,62, 21,97, 25,98, 27,05, 32,25, 33,11, 39,91, 41,71, 49,45, 55,12, 63,70, 160,34, 170,08, 176,54, 183,97.

15.2 Получение креатилпролин н-бутиламида ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилпролин н-бутиламид тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор пролина н-бутиламида (6,49 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатилпролин н-бутиламида тозилата. Выход креатилпролин н-бутиламида тозилата составляет 2,7% мольн. Реакция практически не идет.

Пример 16. Получение креатилгистидин метилового эфира диацетата

16.1 Получение креатилгистидин метилового эфира диацетата по заявляемому способу

Стадия А. Получение креатилгистидин метилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (7,62 г, 40 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют суспензию дигидрохлорида метилового эфира гистидина (9,22 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, по каплям, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (12,33 г, 121,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилгистидин метилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатилгистидин метилового эфира тозилата 33% мольн., количество хлорид-ионов 29,9 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,98 г, 29,9 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 53 мл (92%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона, перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 7 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 4,9 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М уксусной кислоты. Получают раствор креатилгистидин метилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилгистидин метилового эфира диацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×230 мм, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилгистидин метилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,035 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилгистидин метилового эфира диацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,3. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл н-бутилового спирта, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 127 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилгистидин метилового эфира диацетата C₁₁H₁₈N₆O₃*2C₂H₄O₂ 3,03 г (23%). Содержание основного вещества 98,1%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4 максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 2,14 (3Н, с, CH₃CO₂H), 2,89 (3Н, с, NCH₃), 3,00-3,20 (2Н, м, имидазол-CH ₂CHNHCO₂CH₃), 3,69 (3Н, с, имидазол-CH₂CHNHCO₂CH ₃), 4,00-4,15 (2Н, м, NHCH₂CO), 8,43 (1Н, с, HCO₂H) 4,70 (1H, м, имидазол-CH₂CHNHCO₂CH₃, под сигналом остаточной воды), 6,98 (1Н, с, Н в положении 2 имидазольного кольца), 7,82 (1Н, с, Н в положении 5 имидазольного кольца). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 28,85, 31,79, 38,47, 54,16, 54,72, 55,44, 118,40, 136,61, 137,44, 158,67, 170,69, 174,21, 176,13.

16.2 Получение креатилгистидин метилового эфира диацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилгистидин метилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5,0 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют суспензию дигидрохлорида метилового эфира гистидина (9,22 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Смесь охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатилгистидин метилового эфира тозилата. Выход креатилгистидин метилового эфира тозилата - 8% мольн.

В силу низкого выхода тозилата амида креатина дальнейшая процедура не проводилась.

Пример 17. Получение креатилглутамин диметилового эфира ацетата

17.1 Получение креатилглутамин диметилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглутамин диметилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (7,62 г, 40 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют суспензию гидрохлорида диметилового эфира глутаминовой кислоты (8,04 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилглутамин диметилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглутамин диметилового эфира тозилата 44% мольн., количество хлорид-ионов 28,5 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,72 г, 28,5 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона при комнатной температуре, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 7 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Количество хлорид-ионов в растворе 5,0 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С, остаток растворяют в 20 мл 0,05 М уксусной кислоты. Получают раствор креатилглутамин диметилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилгюлтамин диметилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США), заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглутамин диметилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглутамин диметилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,3. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл н-бутилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 125 мл этанола (75%) при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглутамин диметилового эфира ацетата C₁₁H₂₀N₄O₅*C₂H₄O₂ 3,62 г (33%). Содержание основного вещества 98,1%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,7%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,84 (3Н, с, CH₃CO₂H), 1,90-2,25 (2Н, м, CH₃O₂CCH₂CH ₂CHNHCO₂CH₃), 2,98 (3Н, с, NCH₃), 2,44 (2Н, т, 6,85 Гц, CH₃O₂CCH ₂CH₂CHNHCO₂CH₃), 3,63 (3Н, с, CH ₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH₃), 4,15 (2Н, м, NHCH₂CO), 3,69 (3Н, с, CH₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH ₃), 4,45 (1Н, м, 3,63 (3Н, с, CH₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 26,05, 28,47, 32,81, 39,98, 55,10, 55,27, 55,40, 56,01, 160,79, 172,38, 176,38, 178,52, 184,06. 17.2 Получение креатилглутамин диметилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилгюлтамин диметилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают безводный креатин (5 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор гидрохлорида диметилового эфира глутаминовой кислоты (8,04 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатилглутамин диметилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглутамин диметилового эфира тозилата составляет 29% мольн., количество хлорид-ионов 39,9 мМЭкв. Из маточного раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С, раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом. Из водный экстракт упаривают при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглутамин диметилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилгюлтамин диметилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглутамин диметилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 50 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата диметилового эфира креатилглутамина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилгглутамин диметилового эфира ацетата C₁₁H₂₀N₄O₅*C₂H₄O₂ 2,39 г (22%). Содержание основного вещества 96,4%, сульфатная зола - 0,05%, хлорид-ионы - 0,5 ммоль/г, п-ТСК - 156 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,7%, креатин - 0,9%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,4%, сумма неидентифицированных примесей - 0,8%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 2,99 (3Н, с, NCH₃), 1,85 (3Н, с, CH₃CO₂H), 1,90-2,25 (2Н, м, CH₃O₂CCH₂CH ₂CHNHCO₂CH₃), 2,44 (2Н, т, 6,85 Гц, (CH₃O₂CCH ₂CH₂CHNHCO₂CH₃), 3,63 (3Н, с, CH ₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH₃), 3,69 (3Н, с, CH₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH ₃), 4,15 (2Н, м, NHCH₂CO), 4,45 (1Н, м, 3,63 (3Н, с, CH₃O₂CCH₂CH₂CHNHCO₂CH₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 26,06, 28,47, 32,81, 39,98, 55,10, 55,26, 55,40, 56,01, 160,79, 172,37, 176,38, 178,52, 184,06.

Пример 18. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата

18.1. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют, определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 71% мольн., количество хлорид-ионов 29,4 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (4 г, 29,4 ммоль), суспензию перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл ДМФА (91%) при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку при комнатной температуре прибавляют 40 мл ацетона, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 8 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,6 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона, остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,8 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют фумаровую кислоту (1,86 г, 16 ммоль), перемешивают 20 мин до полного растворения (рН 4,0), отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают (3×25 мл) ацетоном, высушивают в вакууме при температуре 40°С. К осадку прибавляют 125 мл абсолютного этанола, перемешивают в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают (2×20 мл) абсолютным этанолом на фильтре, промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 130 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 35°С, прибавляют 50 мл этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают (2×20 мл) этилацетатом, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира фумарата C₈H₁₆N₄O₃*C₄H₄O₄ 4,99 г (40%). Содержание основного вещества 98,3%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 2 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,2%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,2%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,16 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,96 (3Н, с, NCH₃), 3,96 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃), 6,85 (2Н, с, HO₂CCH=CHCO₂H). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 13,23, 37,00, 41,37, 52,59, 62,64, 134,71, 157,82, 170,00, 171,52, 171,69.

18.2. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлор-формиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и с хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 50% мольн., количество хлорид-ионов 35,2 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,7 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют фумаровую кислоту (1,86 г, 16 ммоль), перемешивают до полного растворения, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 80 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок, этилового эфира креатилглицина фумурат, отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира фумарата C₈H₁₆N₄O₃*C₄H₄O₄ 3,01 г (24%). Содержание основного вещества 97,7%, сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,45 мМЭкв/г, п-ТСК - 140 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4%; максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,9%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,15 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,96 (3Н, с, NCH₃), 3,96 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃), 6,85 (2Н, с, HO₂CCH=CHCO₂H). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 13,24, 37,00, 41,37, 52,59, 62,64, 134,71, 157,82, 170,00, 171,52, 171,69.

Пример 19. Получение креатилглицин этилового эфира сукцината

19.1. Получение креатилглицин этилового эфира сукцината по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают в течение 5 мин, охлаждают (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 73% мольн., количество хлорид-ионов 29 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,94 г, 29 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку при комнатной температуре прибавляют 40 мл ацетона, суспензию перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 8 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 2,6 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира сукцината.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,5 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют янтарную кислоту (1,89 г, 16 ммоль), перемешивают 20 мин до полного растворения (pH 4,3), отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл метилэтилкетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают 3 раза по 25 мл метилэтилкетона, высушивают в вакууме при температуре 40°С. К осадку прибавляют 20 мл абсолютного метанола, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 40 мл абсолютного этанола, т.о. растворяют креатилглицин этилового эфира сукцинат в смеси метилового и этилового спирта (20:40), нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом на фильтре (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 80 мл (80%) растворителя при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 30 мл ацетона, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают (2×20 мл) ацетоном, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира сукцината C₈H₁₆N₄O₃*C₄H₆O₄ 5,34 г (38%). Содержание основного вещества 98%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,27 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,56 (4Н, с, (СН₂СООН)₂), 3,08 (3Н, с, NCH₃), 4,07 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,90, 33,56, 39,67, 44,09, 55,325, 65,29, 160,50, 172,58, 174,17, 181,85.

19.2. Получение креатилглицин этилового эфира сукцината по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают от реакционной смеси. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 51% мольн., количество хлорид-ионов 35,1 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира сукцината.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 30×250 мм, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с pH=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют янтарную кислоту (1,89 г, 16 ммоль), перемешивают до полного растворения, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 85 мл ацетонитрила, содержащего 0,5% воды, при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок сукцината этилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира сукцината C₈H₁₆N₄O₃*C₄H₆O₄ 3,36 г (26%). Содержание основного вещества 97,5%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - 0,4 мМЭкв/г, п-ТСК - 145 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,8%, креатин - 0,4%; максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,4%, сумма неидентифицированных примесей - 0,8%. Спектр ЯМР ¹H (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,27 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,56 (4Н, с, (СН₂СООН)₂), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,07 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,90, 33,56, 39,66, 44,09, 55,325, 65,29,160,51, 172,58, 174,17, 181,85.

Пример 20. Получение креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата

20.1 Получение креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 70% мольн., количество хлорид-ионов 29,7 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (4,04 г, 29,7 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 40 мл ацетона, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, суспензию перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты, скорость элюирования - 0,55 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют 85% ортофосфорную кислоту (1,84 г, 16 ммоль) до pH 4,0, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл тетрагидрофурана, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают 3 раза по 25 мл тетрагидрофурана, высушивают в вакууме при температуре 40°С. К осадку прибавляют 40 мл метанола, перемешивают в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают метанолом на фильтре (2×5 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из объединенного маточного раствора отгоняют 40 мл (80%) метанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 30 мл метилэтилкетона, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре (2×20 мл) метилэтилкетоном, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата C₈H₁₆N₄O₃*H₃PO₄ 4,40 г (35%). Содержание основного вещества 98%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 2 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,3%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%;. Спектр ЯМР ^lH (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,29 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 3,09 (3Н, с, NCH₃), 4,08 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,92, 39,69, 44,07, 55,27, 65,30, 160,51, 172,64, 174,20.

20.2 Получение креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлор-формиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 56% мольн., количество хлорид-ионов 35,5 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют со скоростью 0,3 см/мин водой, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 85% ортофосфорную кислоту (1,84 г, 16 ммоль), перемешивают, из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 80 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок креатилглицина этилового эфира дигидрофосфата отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира дигидрофосфата C₈H₁₆N₄O₃*H₃PO₄ 3,20 г (27%). Содержание основного вещества 97,3%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - 0,5 мМЭкв/г, п-ТСК - 148 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,3%, креатин - 0,6%; максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,4%, сумма неидентифицированных примесей - 0,8%;. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,29 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 3,09 (3Н, с, NCH₃), 4,08 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4H, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³C (D₂O), δ, м.д.: 15,92, 39,69, 44,07, 55,27, 65,30, 160,51, 172,64, 174,20.

Пример 21. Получение креатилглицин этилового эфира гидрохлорида

21.1 Получение креатилглицин этилового эфира гидрохлорида по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль), перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной смеси, промывают на фильтре охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 72% мольн., количество хлорид-ионов 29,2 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (3,97 г, 29,2 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 53 мл (92%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку при комнатной температуре прибавляют 40 мл ацетона, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 10 г целита, промывают 40 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,8 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира гидрохлорида.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты, скорость элюирования - 0,7 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют 1 М раствор соляной кислоты (16 мл, 16 ммоль) до рН 3,6, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетонитрила, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают 3 раза по 25 мл ацетонитрила, высушивают в вакууме при температуре 40°С. К осадку прибавляют 140 мл абсолютного этанола, перемешивают в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом на фильтре (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 128 мл (78%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 30 мл тетрагидрофурана, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре (2×20 мл) тетрагидрофураном, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира гидрохлорида C₈H₁₆N₄O₃*HCl 3,14 г (34%). Содержание основного вещества 98,1%, сульфатная зола - 0,03%, п-ТСК - 4 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,2%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,27 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 3,09 (3Н, с, NCH₃), 4,08 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,91, 39,70, 44,08, 55,27, 65,30, 160,51, 172,64, 174,20.

21.2 Получение креатилглицин этилового эфира гидрохлорида по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл), перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (5,32 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют N-метилморфолин (8,48 г, 83,9 ммоль). Смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин этилового эфира тозилата и хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 52% мольн., количество хлорид-ионов 35,2 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира гидрохлорида.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Dowex 1x8 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,55 см/мин, контролируя рН элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют 1 М раствор соляной кислоты (16 мл, 16 ммоль), из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 55 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок креатилглицин этилового эфира гидрохлорида отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин этилового эфира гидрохлорида C₈H₁₆N₄O₃*HCl 2,31 г (25%). Содержание основного вещества 97,1%, сульфатная зола - 0,04%, п-ТСК - 152 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,3%, креатин - 0,7%; максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,4%, сумма неидентифицированных примесей - 0,8%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,27 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 3,09 (3Н, с, NCH₃), 4,09 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,91, 39,71, 44,08, 55,27, 65,30, 160,51, 172,64, 174,20.

Пример 22. Получение креатилглицин этилового эфира метансульфоната

22.1. Получение креатилглицин этилового эфира метансульфоната по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

Процесс проводят, как описано в Примере 1.1 до Стадии Б.

Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 79% мольн., количество хлорид-ионов 3,3 мМЭкв.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира метансульфоната.

Удаление п-ТСК и ее замену на муравьиную кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии, используя хроматографическую систему Buchi «Sepacore», колонку размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненную сорбентом Dowex 1x8 в формиатной форме. Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,025 М раствором муравьиной кислоты со скоростью 0,35 см/мин. Детектирование осуществляют спектрофотометрически, при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира метансульфоната с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют метансульфоновую кислоту (1,92 г мл, 20 ммоль) до рН 3,5. Отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, ацетоновый слой декантируют, прибавляют этилацетат, перемешивают 2 ч, слой этилацетата декантируют, остаток высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, отгоняя при этом 130 мл этанола, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира метансульфоната C₈H₁₆N₄O₃*CH₃SO₃H 4,75 г (40%). Содержание основного вещества 98,3%, сульфатная зола 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 5 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,3%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,3%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,79 (3Н, с, CH₃SO₃H), 3,06 (3Н, с, NCH₃), 4,06 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,95, 39,73, 41,13, 44,08, 55,30, 65,33, 160,51, 172,65, 174,21. 22.2.

Получение креатилглицин этилового эфира метансульфоната по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011].

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

Процесс проводят, как описано в Примере 1.2 до Стадии Б.

Выход креатилглицин этилового эфира тозилата составляет 52% мольн., суммарное количество хлорид-ионов - 23,0 мМЭкв.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира метансульфоната.

Удаление п-ТСК и ее замену на метансульфовую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии, используют хроматографическую систему Buchi «Sepacore», колонку размером 30×250 мм, заполненную сорбентом Dowex 1x8 в формиатной форме. Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с рН=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира метансульфоната с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют метансульфокислоту (1,92 г мл, 20 ммоль). Отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, растворитель отгоняют при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 3 ч, ацетоновый слой декантируют, прибавляют этилацетат, перемешивают 2 ч, слой этилацетата декантируют, остаток высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С, отгоняя при этом 130 мл этанола, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира метансульфоната C₈H₁₆N₄O₃*CH₃SO₃H 2,85 г (40%). Содержание основного вещества 97,9%, сульфатная зола - 0,05%, хлорид-ионы - 0,19 мМЭкв/г, п-ТСК - 55 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,5%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%;. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,79 (3Н, с, CH₃SO₃H), 3,06 (3Н, с, NCH₃), 4,06 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,95, 39,73, 41,13, 44,08, 55,30, 65,33, 160,51, 172,65, 174,21.

Пример 23. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата

23.1 Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата по заявляемому способу.

Стадия А. Получение креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл). Суспензию перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицина изопропилового эфира гидрохлорида (5,84 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин, после чего охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 30 мин, изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль) и триэтиламин (8,48 г, 83,9 ммоль), смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×5 мл). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание основного вещества, количество хлорид-ионов. Выход креатилглицин изопропилового эфира тозилата 75% мольн., количество хлорид-ионов 30,1 мМЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (4,1 г, 29,0 ммоль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 50 мл (91%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку при комнатной температуре прибавляют 40 мл ацетона, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 4 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 5 г целита, промывают 20 мл ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 25 мл ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 5,7 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С до окончания погона. Остаток растворяют в 20 мл 0,05 М раствора уксусной кислоты, получают раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Amberlite IRA-67 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,3 см/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 220 нм. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, фракции объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин изопропилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до pH 4,4. Из объединенных фракций отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 100 мл изопропилового спирта, из суспензии отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 50 мл ацетона, перемешивают 2 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают ацетоном (3×25 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С, растворяют в 125 мл абсолютного этанола при перемешивании в течение 20 мин, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают на фильтре абсолютным этанолом (2×20 мл), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 135 мл (80%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 50 мл этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом (2×50 мл), высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин изопропилового эфира ацетата C₉H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ 4,86 г (44%). Содержание основного вещества 98,1%, посторонние примеси: креатинин - 0,7%, креатин - 0,5%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%; сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК -5 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (6Н, д, 6,22 Гц, СН(СН₃)₂), 1,90 с (3Н, с, СН₃СООН), 3,08 с (3Н, с, NCH₃), 4,02 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,24 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,05 (1Н, м, СН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,49, 25,96, 39,72, 44,36, 55,29, 73,64, 160,54, 172,62, 173,69, 184,06.

23.2 Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата по способу, приведенному в прототипе [RU 2428414, 2011]

Стадия А. Получение креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

В трехгорлую колбу на 100 мл, снабженную термометром, двумя капельными воронками, воздушным холодильником с хлоркальциевой трубкой, установленную на магнитной мешалке, помещают креатина моногидрат (5,69 г, 38 ммоль), п-ТСК (15,23 г, 80 ммоль) и ДМФА (30 мл). Смесь перемешивают в течение 10 мин, прибавляют раствор глицин изопропилового эфира гидрохлорида (5,84 г, 38 ммоль) в 15 мл ДМФА, перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, охлаждают баней (смесь лед-соль) до температуры (-)15°С, прибавляют последовательно изобутилхлорформиат (6,25 г, 45,8 ммоль), затем, в течение 30 мин, по каплям, прибавляют триэтиламин (8,48 г, 83,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1 ч, доводят температуру до комнатной. Осадок отфильтровывают. В маточном растворе определяют содержание креатинглицин изопропилового эфира тозилата и с хлорид-ионов. Выход креатилглицин изопропилового эфира тозилата 45% мольн., количество хлорид-ионов 37,1 мМЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении при температуре 50°С до окончания погона. Остаток растворяют в 160 мл хлороформа, оставляют на 10 ч при температуре (-)10°С. Раствор отфильтровывают, экстрагируют водой 3 раза по 100 мл. Водные экстракты объединяют, 2 раза экстрагируют хлороформом, из водного экстракта отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до объема 50 мл. Получают раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин изопропилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии (хроматографическая система Buchi «Sepacore», колонка размером 49×210 мм (General Electric, США, заполненная сорбентом Amberlite IRA-67 в ацетатной форме). Раствор креатилглицин изопропилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют водой со скоростью 0,3 см/мин, контролируя pH элюата. Фракции с pH=7 (рН воды 5) собирают, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют, прибавляют уксусную кислоту, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. Остаток кристаллизуют из 20 мл ацетонитрила при температуре (-)10°С в течение 20 ч. Осадок ацетата изопропилового эфира креатилглицина отфильтровывают, промывают холодным ацетонитрилом, диэтиловым эфиром и высушивают.

Выход креатилглицин изопропилового эфира ацетата C₉H₁₈N₄O₃*C₂H₄O₂ 2,22 г (20%). Содержание основного вещества 97,3%, посторонние примеси: креатинин - 1,5%, креатин - 0,4%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,2%, сумма неидентифицированных примесей - 0,5%; сульфатная зола - 0,04%, хлорид-ионы - 0,45 мМЭкв/г, п-ТСК - 155 ppm. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,25 (6Н, д, 6,22 Гц, СН(СН₃)₂), 1,90 с (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 с (3Н, с, NCH₃), 4,01 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,23 (2Н, с, NHCH₂CO), 5,05 (1Н, м, СН(СН₃)₂). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 23,49, 25,96, 39,72, 44,38, 55,29, 73,63, 160,55, 172,62, 173,69, 184,06.

Пример 24. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата по заявляемому способу (промышленный процесс)

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В реактор объемом 25 л, снабженный термопарой, механической мешалкой, системой охлаждения и двумя капельными воронками, помещают безводный креатин (944,1 г, 7,2 моль), п-ТСК (2881,8 г, 15,15 моль) и ДМФА (5,7 л). Суспензию перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре до практически полного растворения веществ, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (1005,0 г, 7,2 моль) в 3,9 л ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, охлаждают до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 1 ч, по каплям, изобутилхлорформиат (1184,1 г, 8,67 моль) и N-метилморфолин (1608,3 г, 15,90 моль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×0,75 л). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют целевой продукт - содержание креатилглицин этилового эфира тозилата, содержание хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата составляет 75% мольн., суммарное количество хлорид-ионов - 4,5 МЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (612,3 г, 4,5 моль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 29,7 л (89%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С. К остатку прибавляют 7,5 л ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 300 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 1050 г целита, промывают 4,5 л ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок на фильтре промывают 3 л ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 0,87 МЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С. Остаток растворяют в 7,5 л 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира ацетата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии, используя хроматографическую платформу Bio Rad - Skid 00, колонну с диаметром 448 мми высотой слоя сорбента Dowex 1x8 в ацетатной форме 400 мм. Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,2 см/мин. Детектирование осуществляют спектрофотометрически при 220 нм и кондуктометрически. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%, прибавляют уксусную кислоту до рН 4,3. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 3 л изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 5 л ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают 2 раза по 2 л ацетона, высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 20 л абсолютного этанола, нерастворившийся остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом на фильтре (1 л), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 15,4 л (73%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 5 л этилацетата, смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 3 л этилацетата, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира ацетата C₈H₁₆N₄O₃*C₂H₄O₂ 740,3 г (37%). Содержание основного вещества 98,0%, сульфатная зола - 0,02%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,2%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,3%, сумма неидентифицированных примесей - 0,7%. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,26 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 1,90 (3Н, с, СН₃СООН), 3,07 (3Н, с, NCH₃), 4,06 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 15,96, 25,98, 39,72, 44,09, 55,30, 65,34, 160,55, 172,69, 174,24, 184,09.

Пример 25. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата по заявляемому способу (промышленный процесс)

Стадия А. Получение креатилглицин этилового эфира тозилата.

В реактор объемом 25 л, снабженный термопарой, механической мешалкой, системой охлаждения и двумя капельными воронками, помещают безводный креатин (944,1 г, 7,2 моль), п-ТСК (2881,8 г, 15,15 моль) и ДМФА (5,7 л). Суспензию перемешивают в течение 20 мин до практически полного растворения веществ, прибавляют раствор глицин этилового эфира гидрохлорида (1005,0 г, 7,2 моль) в 3,9 л ДМФА. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, охлаждают до температуры (-)15°С, прибавляют одновременно, в течение 1 ч, изобутилхлорформиат (1184,1 г, 8,67 моль) и N-метилморфолин (1608,3 г, 15,90 моль). Реакционную смесь перемешивают при температуре (-)10°С в течение 1,5 ч. Осадок отфильтровывают от охлажденной реакционной смеси, промывают охлажденным до температуры 0°С ДМФА (2×0,75 л). Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. В растворе определяют содержание креатилглицин этилового эфира тозилата, хлорид-ионов. Выход креатилглицин этилового эфира тозилата 74% мольн., количество хлорид-ионов 4,44 МЭкв. К раствору прибавляют натрия ацетат тригидрат (603,9 г, 4,44 моль), перемешивают в течение 1 ч, отгоняют 29,7 л (89%) ДМФА при пониженном давлении и температуре 45°С, к остатку прибавляют 7,5 л ацетона при комнатной температуре, перемешивают в течение 20 мин, прибавляют 300 г целита, перемешивают в течение 20 мин. На фильтр помещают 1050 г целита, промывают 4,5 л ацетона, промывную жидкость утилизируют. Суспензию фильтруют через целит, осадок промывают 3 л ацетона. Промывные жидкости и маточный раствор объединяют. Содержание хлорид-ионов в растворе 0,84 МЭкв. Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 45°С, остаток растворяют в 7,5 л 0,05 М раствора уксусной кислоты. Получают раствор креатилглицин этилового эфира тозилата.

Стадия Б. Получение креатилглицин этилового эфира фумарата.

Удаление п-ТСК и ее замену на фармацевтически приемлемую кислоту осуществляют методом ионообменной хроматографии, используя хроматографическую платформу Bio Rad - Skid 00, колонну с диаметром 448 мм и высотой слоя сорбента Dowex 1x8 в ацетатной форме 400 мм. Раствор креатилглицин этилового эфира тозилата наносят на колонку, элюируют 0,05 М раствором уксусной кислоты со скоростью 0,2 см/мин. Детектирование осуществляют спектрофотометрически при 220 нм и кондуктометрически. Отбирают фракции, анализируют методом ВЭЖХ, объединяют на основании результатов анализа для получения креатилглицин этилового эфира ацетата с суммарным содержанием неидентифицированных примесей не более 1%, креатинина - не более 1%, креатина - не более 1%. К объединенным фракциям прибавляют фумаровую кислоту (288,9 г, 2,49 моль), перемешивают 20 мин до растворения (рН 4,1). Из раствора отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона. К остатку прибавляют 3 л изопропилового спирта, отгоняют растворитель при пониженном давлении и температуре 40°С до окончания погона, прибавляют 5 л ацетона, перемешивают 3 ч, осадок отделяют фильтрацией, промывают 2 раза по 2 л ацетона, высушивают в вакууме при температуре 40°С. Осадок растворяют в 20 л абсолютного этанола, остаток отделяют фильтрованием, промывают абсолютным этанолом (1 л), промывные жидкости объединяют с маточным раствором. Из раствора отгоняют 15,4 л (73%) этанола при пониженном давлении и температуре 40°С, прибавляют 5 л этилацетата, выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией, промывают 3 л этилацетата, высушивают в вакууме при температуре 40°С.

Выход креатилглицин этилового эфира фумарата C₈H₁₆N₄O₃*C₄H₄O₄ - 916,0 г (38%). Содержание основного вещества 98,0%, сульфатная зола - 0,03%, хлорид-ионы - следы, п-ТСК - 3 ppm, посторонние примеси: креатинин - 1,0%, креатин - 0,6%, максимальная единичная неидентифицированная примесь - 0,1%, сумма неидентифицированных примесей - 0,4%;. Спектр ЯМР ¹Н (D₂O), δ, м.д. (J, Гц): 1,16 (3Н, т, 7,17 Гц, СН₂СН₃), 2,96 (3Н, с, NCH₃), 3,96 (2Н, с, N(CH₃)CH₂CO), 4,20-4,25 (4Н, м, NHCH₂CO и СН₂СН₃), 6,85 (2Н, с, HO₂CCH=CHCO₂H). Спектр ЯМР ¹³С (D₂O), δ, м.д.: 13,23, 37,00, 41,37, 52,59, 62,64, 134,71, 157,82, 170,00, 171,52, 171,69.

Обобщенные сведения, о результатах синтеза препаратов по заявляемому изобретению по сравнению с ближайшим аналогом, приведены в таблице 1.

Приведенные примеры показывают, что заявляемый способ получения амидов креатина позволяют повысить выход целевого продукта на 7-38%, увеличить чистоту продукта, а также получить амиды креатина, которые невозможно синтезировать по прототипу.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к способу получения амидов креатина указанной ниже общей формулы, которые проявляют антиишемическую активность. В формуле R означает аминокислотный остаток аминокислоты; Y означает OR¹, NR²R³, где R¹ представляет собой Н, CH₂Ph, алкил С₁-С₃, R², R³ - Н, алкил С₁-С₄; X - низкомолекулярная С₁-С₄ органическая кислота или минеральная кислота, или вода. Способ заключается в обработке креатина пара-толуолсульфоновой кислотой в диметилформамиде с последующим взаимодействием полученного комплекса с производными аминокислот в присутствии конденсирующего агента и основания. В качестве конденсирующего агента используют хлорангидрид моноэфира муравьиной кислоты, причем конденсирующий агент и основание вводят одновременно. Затем к полученной смеси прибавляют ацетат щелочных металлов, отгоняют не менее 80% диметилформамида, экстрагируют активное начало полярным апротонным растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон и ацетонитрил. После этого растворитель отгоняют, остаток растворяют в полярном протонном растворителе, содержащем не менее одного ингредиента из группы, в которую входят вода, этиловый и изопропиловый спирт, муравьиная и уксусная кислоты, пара-толуолсульфоновую кислоту удаляют путем хроматографирования на анионообменном сорбенте. Растворитель отгоняют в присутствии низкомолекулярной С₁-С₄ органической кислоты или минеральной кислоты и спирта при pH не более 4,5, затем обрабатывают растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат. Активное начало экстрагируют растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят этиловый и метиловый спирты, отгоняют не менее 70% растворителя и обрабатывают растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат. Предлагаемый способ позволяет повысить выход и чистоту целевого продукта. 21 з.п. ф-лы, 1 табл., 25 пр.

1. Способ получения амидов креатина общей формулы

где R - аминокислотный остаток аминокислоты; Y - OR¹, NR²R³, где R¹ - Н, CH₂Ph, алкил С₁-С₃; R², R³ - Н, алкил С₁-С₄; X - низкомолекулярная С₁-С₄ органическая кислота или минеральная кислота, или вода, заключающийся в обработке креатина пара-толуолсульфоновой кислотой в диметилформамиде с последующим взаимодействием полученного комплекса с производными аминокислот в присутствии конденсирующего агента и основания, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента вводят хлорангидрид моноэфира муравьиной кислоты, причем конденсирующий агент и основание вводят одновременно, с последующим прибавлением к полученной смеси ацетата щелочных металлов, отгонкой не менее 80% диметилформамида, экстракцией активного начала полярным апротонным растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон и ацетонитрил; отгонкой растворителя, растворением остатка в полярном протонном растворителе, содержащем не менее одного ингредиента из группы, в которую входят вода, этиловый и изопропиловый спирт, муравьиная и уксусная кислоты, удалением пара-толуолсульфоновой кислоты путем хроматографирования на анионообменном сорбенте, отгонкой растворителя в присутствии низкомолекулярной С₁-С₄ органической кислоты или минеральной кислоты и спирта при pH не более 4,5, обработкой растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат; экстракцией активного начала растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят этиловый и метиловый спирты; отгонкой не менее 70% растворителя, обработкой растворителем, содержащим не менее одного ингредиента из группы, в которую входят ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, ацетонитрил и этилацетат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют протеиногенную α-аминокислоту.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют β-аланин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют ω-нитроаргинин.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют O-изопропилтирозин.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве аминокислоты используют O-этилтирозин.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве низкомолекулярной С₁-С₄ органической кислоты используют метансульфоновую или уксусную, или фумаровую, или янтарную кислоту.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве минеральной кислоты используют ортофосфорную кислоту или соляную кислоту.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве креатина используют безводный креатин.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве креатина используют креатин моногидрат.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве производных аминокислот используют эфирные, амидные или нитропроизводные протеиногенных α-аминокислот.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве производных аминокислот используют эфирные или амидные производные β-аланина.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве основания используют N-метилморфолин.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве основания используют триэтиламин.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве хлорангидрида моноэфира муравьиной кислоты используют изобутилхлорформиат.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве хлорангидрида моноэфира муравьиной кислоты используют этилхлорформиат.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ацетата щелочных металлов используют ацетат натрия или ацетат калия.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве анионообменного сорбента используют смолы на основе сополимеров стирола или на основе акриловых сополимеров, содержащие третичные группы, типа Dowex 1×8.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве анионообменного сорбента используют смолы на основе сополимеров стирола или на основе акриловых сополимеров, содержащие четвертичные аммонийные группы, типа Amberlite IRA-67.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографирование проводят, используя в качестве элюента водный раствор муравьиной или уксусной кислот или водно-спиртовый растворитель.

21. Способ по п.20, отличающийся тем, что в качестве водно-спиртового растворителя используют смеси воды с изопропиловым спиртом или этиловым спиртом.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве спирта используют изопропиловый спирт или н-бутиловый спирт.