ЗАЩИЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ВАЗОПРЕССИНА Российский патент 1998 года по МПК C07K1/06 C07K7/16 

Изобретение относится к новым исходным соединениям, применяемым для получения вазопрессина и его аналогов, а именно к защищенным производным вазопрессина общей формулы I:

где
R₁ есть трет-бутоксикарбонил-амино-группа, а R₂ - L-аргинил или N_ε -трет-бутоксикарбонил-L-лизил;
R₁ - амино-группа, а R₂ - L-аргинил или L-лизил;
R₁ - атом водорода, а R₂ - D-аргинил;
Вазопрессин является нейрогипофизарным пептидным гормоном млекопитающих, который играет важную роль в регуляции водно-солевого обмена и тонуса кровеносных сосудов. Вазопрессин - нонапептид, содержащий дисульфидный цикл, имеет структуру

где
X может быть остатком аргинина (Arg⁸-вазопрессин) или лизина (Lys⁸-вазопрессин).

Вазопрессины и их структурные аналоги, получаемые методами химического синтеза, широко применяются в медицине в качестве лекарственных средств для диагностики и лечения несахарного диабета, гемофилии, травматических кровотечений и ряда других заболеваний.

Дисульфидный цикл, образованный двумя остатками цистеина, является существенным элементом структуры, определяющим биологическую активность вазопрессина. С точки зрения химического синтеза образование дисульфидного цикла в молекуле вазопрессина - очень важная и ответственная стадия, от которой зависит эффективность всего синтеза, а именно выход, химическая чистота, биологическая активность и устойчивость при хранении конечного продукта. Дисульфидный цикл химически нестабилен и легко подвергается восстановлению, окислению или межмолекулярной изомеризации, поэтому в процессе синтеза вазопрессина или его аналогов формирование дисульфидного цикла осуществляют, как правило, на одной из финальных стадий синтеза. С этой целью при сборке пептидной цепи вазопрессина остатки цистеина вводят в синтез с предварительно блокированными сульфгидрильными (SH) группами. Защитные группы для блокирования SH-групп подбирают таким образом, чтобы они, с одной стороны, были устойчивы ко всем реагентам и условиям реакций, применяемым при сборке пептидной цепи, с другой стороны, легко и селективно отщеплялись после сборки пептида с освобождением SH-групп или с непосредственным образованием дисульфидного цикла.

Вазопрессины являются весьма нестабильными соединениями. Падение их биологической активности часто происходит даже при таких операциях, как колоночная хроматография и упаривание растворов: инактивации могут способствовать различные органические и неорганические примеси (соли, тяжелые металлы), присутствующие в растворах. Поэтому очень важно, чтобы после деблокирования и окисления вазопрессин был получен в водном растворе с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей.

На практике при планировании синтеза вазопрессинов выбор защитных групп и условий их отщепления для остатков цистеина является важнейшим элементом, от которого зависит выбор других защитных групп, реакционных условий и реагентов.

Наиболее известным и часто используемым способом защиты SH-групп остатков цистеина при синтезе вазопрессинов является S-бензилирование, описанное в J. Amer. Chem. Soc., v. 80, pp. 3355-3358 (1958), для Arg⁸-вазопрессина и в J. Amer. Chem. Soc., v. 82, pp. 2279-2282 (1960), для Lys⁸-вазопрессина. Для защиты остатка аргинина использовали протонирование, ε-аминогруппу лизина защищали тозильной группой, которую можно удалить одновременно с S-бензильными защитными группами. Единственным приемлемым способом деблокирования таких защищенных пептидов после синтеза является обработка натрием в жидком аммиаке. Этот процесс сопровождается побочными реакциями, в том числе частичной деструкцией пептидов. В результате после окисления деблокированных пептидов получаются препараты, содержащие большое количество трудноотделимых примесей и имеющие низкую биологическую активность.

Известны способы получения Lys⁸-вазопрессина (патент Швейцарии 498 805) и Arg⁸-вазопрессина (J. Оrg. Chem., v. 38, N. 16, pp. 2865-2869) из соответствующих ди-S-трифенилметильных (тритильных) производных. Деблокирование ди-(S-тритил)-пептидов проводят путем обработки иодом в разбавленном растворе, при этом происходит одновременное образование циклического дисульфида. S-Тритильная защита неустойчива в кислых средах, в частности в условиях отщепления трет-бутоксикарбонильной (Boc) и бензилоксикарбонильной (Cbz) амино-защитных групп. Это создает значительные трудности для синтеза защищенных пептидов, содержащих остатки S-тритил-цистеина, поэтому производные ди-(S-тритил)-вазопрессинов получаются, как правило, с низкими выходами.

В работе D. Gillessen, A. Trzeciak, опубликованной в "Neurohypophyseal peptide hormones and other biologically active peptides", ed. By D.H. Schlesinger, Amsterdam, 1981, pp. 37-47, для получения Lys⁸-вазопрессина использовали производное ди-(S-ацетамидометил)-Lys⁸(Boc)-вазопрессина. S-Ацетамидометильные защитные группы отщепляли с одновременным образованием дисульфидного цикла путем обработки иодом разбавленного раствора защищенного пептида в смеси 2,2,2-трифторэтанола и метанола; Boc-защитные группы удаляли после выделения окисленного пептида. Недостатком данного способа является необходимость использования большого объема (не менее 1 л/ммол) органического растворителя на стадии деблокирования окисления.

Задачей изобретения является изыскание новых цистеин-защищенных производных вазопрессина, применение которых позволяло бы получать вазопрессин и его аналоги в виде растворов с минимальным содержанием солей и нелетучих органических примесей.

Задача решается путем синтеза новых соединений, а именно защищенных производных вазопрессина общей формулы I:

где
R₁ и R₂ принимают следующие значения:
Ia: R₁ = трет-бутоксикарбонил-амино, R₂ = L-аргинил-;
Ib: R₁ = амино-, R₂ = L-аргинил-;
Ic: R₁ = трет-бутоксикарбонил-амино-, R₂ = > -N_ε -трет-бутоксикарбонил- L-лизил-;
Id: R₁ = амино-, R₂ = L-лизил-;
Ie: R₁ = водород, R₂ = D-аргинил-;
Соединения формулы I могут быть получены путем синтеза на твердой фазе или в растворе с использованием известных методов и реагентов. Синтез в растворе может быть проведен ступенчатым наращиванием пептидной цепи или путем сборки из пептидных сегментов. Остатки цистеина и 3-меркаптопропионовой кислоты в процессе синтеза вводятся в виде S-дифенилметильных (S-Dpm) производных, получаемых известными способами, например, как описано в J. Chem. Soc. (C), p. 2683-2687 (1970). Для защиты остатка аргинина используется солеобразование, ε-аминогруппа лизана блокируется Boc-группой.

В качестве временных N_α - защитных групп используются группы, которые можно селективно отщепить, не затрагивая S-дифенилметильную защиту, например, N_α -Boc-группа. При синтезе пептидных сегментов в растворе для отщепления N_α -Boc-группы могут быть использованы известные методы и реагенты, например, растворы хлористого водорода или сульфокислот в органических растворителях, трифторуксусная кислота или ее растворы в дихлорметане или хлороформе.

Для наращивания пептидной цепи и сборки пептидных сегментов применяются известные методы конденсации, например конденсация при действии дициклогексилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола.

Соединения Ia и Ib могут быть использованы для получения Arg⁸-вазопрессина, соединения Ic и Id - для получения Lys⁸-вазопрессина, соединение Ie - для получения [дезамино¹, D-Arg⁸]-вазопрессина (десмопрессина). Этот процесс проводится в две стадии. На первой стадии проводят отщепление S-Dpm-групп с остатков цистеина и 3-меркаптопропионовой кислоты действием трифторуксусной кислоты в присутствии акцептора дифенилметильных катионов, например фенола (в соединениях Ia и Ic при этом одновременно отщепляются Boc-группы). Деблокирование проводят в течение 20-40 мин при 60-80^oC или в течение 18-24 ч при 20-25^oC. Затем отгоняют трифторуксусную кислоту и выделяют осаждением деблокированный пептид со свободными SH-группами. На второй стадии полученный пептид растворяют в воде, доводят при необходимости pH раствора до значения в интервале от 6 до 8 и окисляют известным способом, например перекисью водорода или кислородом воздуха.

Отщепление S-Dpm-групп проходит гладко и с высоким выходом. Благодаря осаждению и тщательной промывке после первой стадии деблокированный пептид практически не содержит органических примесей непептидного характера и солей и имеет высокое содержание основного вещества. При растворении деблокированного пептида в воде раствор имеет кислую реакцию, что позволяет минимизировать неконтролируемое окисление на стадии растворения. В результате окисления получается вазопрессин с высокой биологической активностью в растворе, не содержащем солей и органических примесей. Такой раствор может быть сконцентрирован известными способами, например упариванием при пониженном давлении или лиофилизацией, или путем сорбции вазопрессина на ионообменной смоле, без потери биологической активности целевого продукта.

Таким образом, предлагаемые защищенные производные вазопрессина можно эффективно использовать для получения вазопрессинов и их аналогов, причем целевые продукты получаются с высокими выходами и в форме, удобной для концентрирования и очистки без потери биологической активности.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:
ДМФА - диметилформамид
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид
ВЭЖХ - высокоэффектиная жидкостная хроматография
Сокращенные обозначения аминокислот и защитных групп используются в соответствии с рекомендациями Комиссии по биохимической номенклатуре при IUPAC-IUB, опубликованными в Eur. J. Biochem. , v. 138, N. 1, pp. 9-37 (1984). Оптически активные аминокислоты, приведенные в описаниях примеров, по умолчанию имеют L-конфигурацию.

Значения хроматографических подвижностей R_f приведены для пластинок для тонкослойной хроматографии Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, ФРГ) в системах хлороформ-метанол-уксусная кислота, 90:10:3 (А); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода, 60:5:15:10 (Б) и ацетонитрил-уксусная кислота-вода, 40:1:10 (В). Обнаружение пятен на пластинках проводят в УФ-свете и нингидриновым реактивом после прогревания. Массы молекулярных ионов (M + H)⁺ измерены на времяпролетном масс-спектрометре МСБХ-1 (НПО "Электрон", Украина).

Пример 1. Получение гидрохлорида этилового эфира (S-дифенилметил)-цистеинил-пролина [H-Cys(Dpm)-Pro-OEt • HCl].

К раствору 19.4 г Boc-(S-дифенилметил)цистеина и 7.3 г 1-гидроксибензотриазола в 100 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 10.8 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении, затем добавляют 10.8 г гидрохлорида этилового эфира пролина и 10 мл триэтиламина и перемешивают еще 2 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в 50 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 60 мл толуола и вновь упаривают. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 18.5 г целевого продукта в виде белого мелкокристаллического порошка; R_f(А)0.33; масс-спектр: (M + H)⁺ 413.2 (вычислено: 413.59).

Пример 2. Получение этилового эфира Boc-аспарагинил-(S- дифенилметил)-цистеинил-пролина [Boc-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt].

К раствору 18.4 г гидрохлорида этилового эфира (S-дифенилметил)- цистеинил-пролина (пример 1), 12.5 г Boc-аспарагина и 9.4 г 1-гидроксибензотриазола в 130 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 6 мл N-метилморфолина, затем 11.2 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют 100 мл диэтилового эфира и 150 мл петролейного эфира и оставляют на ночь в холодильнике. Выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре петролейным эфиром и сушат на воздухе. Получают 24.4 г эфира Boc-трипептида; R_f(А)0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 627.4 (вычислено: 627.823).

Пример 3. Получение этилового эфира Boc-глутаминил-аспарагинил- (S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt].

24.3 г этилового эфира Boc-аспарагинил-(S-дифенилметил) цистеинил-пролина (пример 2) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до вязкого масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный гидрохлорид трипептида растворяют в 100 мл ДМФА и добавляют 11 г Boc-глутамина и 6.2 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 6 мл триэтиламина, затем 9.4 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении, добавляют еще 2 мл триэтиламина и перемешивают 6 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 2 • 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 25.2 г эфира Boc-тетрапептида; R_f(А)0.30, R_f(Б)0.75; масс-спектр: (M + H)⁺ 755.3 (вычислено: 755.956).

Пример 4. Получение этилового эфира Boc-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Phe-Gln-Asn- Cys(Dpm)-Pro-OEt].

25.1 г этилового эфира Boc-глутаминил-аспарагинил-(S- дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 3) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. К раствору 10.6 г Boc-фенилаланина и 5.4 г 1-гидроксибензотриазола в 60 мл ДМФА при охлаждении в ледяной бане и перемешивании прибавляют 8.4 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и объединяют ее с раствором гидрохлорида тетрапептида в 80 мл ДМФА. К смеси добавляют 6 мл триэтиламина и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, растворяют в 300 мл этилацетата. Раствор промывают в делительной воронке 3 • 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 70 мл 1 н. соляной кислоты и 100 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия и упаривают до 150 мл. К остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл эфира и сушат на воздухе. Получают 25.6 г эфира Boc-пентапептида; R_f(Б)0.28; масс-спектр: (M + H)⁺902.2 (вычислено: 903.149).

Пример 5. Получение этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил- глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Boc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OEt].

25.5 г этилового эфира Boc-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил- (S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 4) растворяют в 80 мл уксусной кислоты, добавляют 50 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Гидрохлорид пентапептида растворяют в 100 мл ДМФА и добавляют 9 г Boc-тирозина и 4,2 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 3.8 мл N-метилморфолина, затем 6.9 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 400 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 50 мл ДМФА, упаривают до масла и растирают с диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Получают 26.4 г эфира Boc-гексапептида; R_f(А)0.20, R_f(Б)0.55; масс-спектр: (M + H)⁺1065.6 (вычислено: 1066.332).

Пример 6. Получение Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролина [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH].

10.7 г этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 5) растворяют в 30 мл уксусной кислоты, добавляют 30 мл 3 н. раствора хлористого водорода в уксусной кислоте и выдерживают 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, к остатку добавляют 150 мл диэтилового эфира, выпавший осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Гидрохлорид гексапептида растворяют в 50 ДМФА и добавляют 4.65 г Boc-(S-дифенилметил)цистеина и 1.4 г 1-гидроксибензотриазола. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 1.4 мл N-метилморфолина, затем 2.8 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 200 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия и 100 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла и растирают с диэтиловым эфиром, промывают на фильтре эфиром и сушат на воздухе. Полученный эфир Boc-гептапептида (12.1 г; R_f (Б) 0.55) растворяют в 100 мл ацетона и по каплям при перемешивании добавляют в течение 20 мин 25 мл 1 н. водного гидроксида натрия. Перемешивают смесь 1.5 ч при комнатной температуре, затем упаривают наполовину, разбавляют 150 мл воды, раствор фильтруют и подкисляют 3 мл уксусной кислоты. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат на воздухе. Получают 11.2 г Boc-гептапептида; R_f (Б) 0.40; масс-спектр: (M + H)⁺ 1306.2 (вычислено: 1307.647).

Пример 7. Получение 3-(S-дифенилметилтио)пропионил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина [Mpr(Dpm)-Try-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-OH].

Получают из 10.7 г этилового эфира Boc-тирозил-фенилаланил- глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина и 3.3 г 3-(S-дифенилметилтио)-пропионовой кислоты, как описано в примере 6. Выход 10.1 г, R_f(Б) 0.45; масс-спектр: (M + H)⁺ 1191.4 (вычислено: 1192.507).

Пример 8. Получение гидрохлорида Boc-(S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-аргинил-глицинамида [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys(Dpm)- Pro-Arg-Gly-NH₂ • HCl, соединение Ia].

К раствору 6.52 г Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 6) и 1.82 г дихлорида аргинил-глицинамида в 40 мл ДМФА добавляют 1 г 1-гидроксибензотриазола и 0.8 мл N-метилморфолина. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к раствору прибавляют 1.25 г ДЦГК. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 150 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 40 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 40 мл 0.5 н. соляной кислоты и 50 мл воды и сушат на воздухе. Полупродукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 80 мл этилацетата, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре этилацетатом и эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 7.0 г гидрохлорида соединения Ia; R_f(Б) 0.35, R_f(В) 0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 1520.5 (вычислено: 1519.92).

Пример 9. Получение гидрохлорида 3-(S-дифенилметилтио)пропионил- тирозил-фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-D-аргинил-глицинамида [Mpr(Dpm)-Pre-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro-D- Arg-Gly-NH₂ • HCl, соединение Ie].

Получают из 5.96 г 3-(S-дифенилметилтио)пропионил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина и 1.82 г дигидрохлорида D-аргинил-глицинамида, как описано в примере 8. Выход гидрохлорида соединения Ie 6.3 г; R_f(Б) 0.32, R_f(В) 0.65; масс-спектр: (M + H)⁺ 1405.3 (вычислено: 1404.79).

Пример 10. Получение Boc-(S-дифенилметил)цистенил-тирозил- фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-(Boc)лизил-глицинамида [Boc-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)- Pro-Lys(Boc)-Gly-NH₂, соединение Ic].

2.7 г N_α - карбоксил- N_ε -трет-бутоксикарбонил-лизил-глицинамида в 30 мл метанола гидрируют 2 ч над 0.2 г 10% Pd/C, катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают досуха. К остатку добавляют раствор 6.52 г Boc-(S-дифенилметил)цистеинил-тирозил-фенилаланил-глутаминил- аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил-пролина (пример 6) и 1 г 1-гидроксибензотриазола в 40 мл ДМФА. При охлаждении в ледяной бане и перемешивании к смеси прибавляют 1.25 г ДЦГК и 0.2 мл N-метилморфолина. Смесь перемешивают 1 ч при охлаждении и еще 5 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении, остаток обрабатывают 150 мл воды. Образовавшийся осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре 40 мл 5% водного раствора бикарбоната натрия, 40 мл 0,5 н. соляной кислоты и 50 мл воды. Сырой продукт растворяют в 30 мл ДМФА, упаривают до масла, затем добавляют 100 мл этилацетата, осадок растирают, отфильтровывают, промывают на фильтре этилацетатом и эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 7.1 г соединения Ic; R_f (Б) 0.45, R_f (В) 0.75; масс-спектр: (M + H)⁺ 1592.2 (вычислено: 1592.03).

Пример 11. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланилил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пролил-арнинил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro- Arg-Gly-NH₂ • 2TFA, соединение Ib].

3.2 г соединения Ia (пример 8) растворяют в 10 мл дихлорметана и 10 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают раствор 1 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают до масла, остаток растирают с 80 мл диэтилового эфира, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. Получают 3.2 г трифторацетата соединения Ib; R_f (Б) 0.12, R_f (В) 0.50; масс-спектр: (M + H)⁺ 1419.2 (вычислено: 1419.80).

Пример 12. Получение трифторацетата (S-дифенилметил)цистеинил- тирозил-фенилаланилил-глутаминил-аспарагинил-(S-дифенилметил)цистеинил- пропил-лизил-глицинамида [H-Cys(Dpm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Dpm)-Pro- Lys-Gly-NH₂ • 2TFA, соединение Id].

Получают из 3.2 г соединения Ic (пример 10), как описано в примере 11. Выход 3.3 г трифторацетата соединения Id; R_f (Б) 0.15, R_f (В) 0.55; масс-спектр: (M + H)⁺ 1390.5 (вычислено: 1391.78).

Пример 13. Получение Arg⁸-вазопрессина.

1.65 г соединения Ib, 6 г перегнанного фенола и 32 мл трифторуксусной кислоты перемешивают атмосфере аргона 24 ч при комнатной температуре, затем трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении. Остаток встряхивают с 20 мл петролейного эфира, после расслаивания петролейный эфир декантируют; эту операцию повторяют еще дважды. Остаток растворяют в 5 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору при перемешивании добавляют 50 мл диэтилового эфира. Выпавший белый осадок быстро отфильтровывают, промывают на фильтре 3 • 10 мл эфира и сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный трифторацетат дигидро-Arg⁸-вазопрессина (1.25 г) при перемешивании растворяют в 1000 мл дегазированной бидистиллированной воды, затем концентрированным водным аммиаком доводят pH раствора до 7.5. Раствор интенсивно перемешивают в открытом сосуде 2 сут при комнатной температуре до отрицательной реакции с нитропруссидом натрия. После окисления раствор наносят на колонку 5 x 20 см с DE-52 (Whatman, Англия) в ацетатной форме, промывают колонку 0.5 л 0.02 M ацетата аммония (pH 6.5), затем элюируют линейным градиентом ацетата аммония (pH 6.5) от 0.02 до 0.2 M. Фракции, содержащие чистый Arg⁸-вазопрессин, объединяют и лиофилизируют. Получают 550 мг Arg⁸-вазопрессина, ацетата; содержание основного вещества 74%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 94%; [α]D25

= -25.5^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1084.8 (вычислено: 1085.312).

Пример 14. Получение Lys⁸-вазопрессина.

1.62 г соединение Ic, 6 г перегнанного фенола и 32 мл трифторукскусной кислоты нагревают в атмосфере аргона 30 мин в бане с температурой 70^oC, после охлаждения трифторуксусную кислоту отгоняют при пониженном давлении и далее проводят процесс, как описано в примере 13. Получают 470 мг Lys⁸-вазопрессина ацетата; содержание основного вещества 79%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 96%; [α]D25/

= -32.1^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1057.6 (вычислено: 1057.302).

Пример 15. Получение [дезамино¹, D-Arg⁸]вазопрессина.

Получают из 1.45 г соединение Ie (пример 9), как описано в примере 13. Выход 490 мг [дезамино¹, D-Arg⁸]вазопрессина ацетата; содержание основного вещества 76%; хроматографическая чистота по обращенно-фазовой ВЭЖХ 96%; [α]D25

= +53.3^o (с 0.5, вода) в пересчете на основное вещество; масс-спектр: (M + H)⁺ 1070.1 (вычислено: 1070.302).

Изобретение относится к новым производным вазопрессина формулы I, где R₁-третбутоксикарбонил-амино-группа, R₂-L-аргинил или N₆-трет-бутоксикарбонил-L-лизил;R₁-амино-группа,аR₂-L-аргинилилиL-лизил;R₁-Н,аR₂-D-аргинил. Соединения формулы 1 пригодны в качестве исходных для получения вазопрессина и его аналогов.

C

Производные вазопрессина общей формулы:

где R₁ есть трет-бутоксикарбонил-амино-группа;
R₂ - L-аргинил или N_ε -трет-бутоксикарбонил-L-лизил; R₁ - аминогруппа, а R₂ - L-аргинил или L-лизил, R₁ - атом водорода, а R₂ - L-аргинил,
в качестве исходных соединений для получения вазопрессинов.