СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АЛКАЛОИДА ЛАППАКОНИТИНА В ЗАГОТОВЛЕННЫХ КОРНЕВИЩАХ ACONITUM SEPTENTRIONALE KOELLE Российский патент 2016 года по МПК A61K36/00 

Способ повышения содержания алкалоида лаппаконитина в заготовленных корневищах Aconitum septentrionale Koelle

Уровень техники

Антиаритмический препарат Аллапинин получают из травы борца белоустого (Aconitum leucostomum Worosch) или из корней и корневищ борца северного {Aconitum septentrionale Koelle (A. excelsum Reichenb)) семейства лютиковых - Ranunculaceae Juss. Содержание алкалоида лаппаконитина - действующего вещества антиаритмического препарата Аллапинин, в корневищах А. septentrionale бывает наиболее высоким во время интенсивного роста растений в начале вегетации в течение всего 15-20 дней [1].

Известны различные способы повышения содержания биологически активных веществ в лекарственных растениях путем их обработки до сбора сырья специальными химическими реагентами (фитогормоны и их синтетические аналоги, ретарданты и микроэлементы), а также данные об увеличении содержания биологически активных веществ в растениях под действием факторов абиотической (температурный, световой и водный режим, УФ-облучение) и биотической (атака фитофагами, фитоалексины) природы. Например, обработка мачка желтого (Glaucium flavum Crantz.) ретардантом хлорхолинхлоридом, или действием УФ-облучения или созданием водного дефицита вызывает двух- трехкратное увеличение содержания алкалоида глауцина в надземной части растений [2]. Однако эти способы применимы лишь к плантационным культурам и культурам ткани и неприменимы для заготавливаемых дикорастущих лекарственных растений.

Способов повышения содержания алкалоида лаппаконитина в уже заготовленном сырье в доступных нам источниках информации не обнаружено.

Раскрытие

Целью настоящего изобретения является разработка способа повышения содержания лаппаконитина в уже заготовленном сырье - корневищах дикорастущего растения A. septentrionale (борца северного).

Заявленная цель достигается путем активации ростовых процессов в корневищах растений A. septentrionale, собранных на стадии цветения (самой длительной стадии сезонного развития), обработкой биопрепаратом Бациспецин БМ.

Биопрепарат Бациспецин БМ был разработан как стимулятор роста растений на основе штамма почвенных бактерий Bacillus sp. 739. Препарат способствует увеличению урожая, положительно влияет на рост и развитие растений и содержит в своем составе, помимо жизнеспособных бактериальных спор, различные биологически активные вещества, включая цитокинины. Представляет собой порошок влажностью не более 15%, содержащий не менее 2×10⁶ КОЕ/г жизнеспособных спор. Препарат хранится без потери качества в условиях склада не менее пяти лет [3].

Позднее штамм Bacillus sp.739 был идентифицирован как Paenibacillus ehimensis IB-739 [4] и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ B-2680D). Штамм также известен как продуцент полисахарида [5] и циклодекстринглюканотрансферазы [6].

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Эксперимент проводили на свежесобранных корневищах генеративных (стадия цветения) растений A. septentrionale. Для каждого варианта опыта использовали по 30 корневищ. Для обработки использовали биопрепарат Бациспецин БМ в виде сухого порошка с титром 2,4×10⁶ КОЕ/г, из которого готовили водную суспензию в разведениях от 2,0 г/л до 100,0 г/л. Корневища обмакивали в приготовленную суспензию, раскладывали на поддоны и накрывали полиэтиленовой пленкой, где поддерживалась относительная влажность 85-90%, или же помещали в теплицу, где поддерживалась относительная влажность 70-80%. Более высокая относительная влажность (95% и более) приводит к переувлажнению и загниванию корневищ. В контрольном варианте корни обмакивали в дистиллированную воду и также помещали на поддоны под пленку. Через трое суток инкубации при комнатной температуре корневища извлекали и подвергали анализу на содержание в них суммы алкалоидов и лаппаконитина В качестве второго контроля использовали вариант с измельчением корней после их заготовки.

Сумму алкалоидов из корневищ A. septentrionale извлекали методом исчерпывающей экстракции [7]. Для анализа на содержание суммы алкалоидов брали навеску измельченных образцов 50 г, взвешенную с точностью до третьего знака после запятой. В качестве экстрагента использовали 70%-ный водный ацетон. Экстракцию повторяли до полного извлечения алкалоидов. Полнота экстракции проверялась качественной реакцией на третичный азот в молекуле алкалоидов с кремневольфрамовой кислотой. Объединенные вытяжки фильтровали на воронке Бюхнера, затем ацетон отгоняли на роторном испарителе, остаток подкисляли 3%-ным раствором серной кислоты до pH=1-3, экстрагировали из них дихлорэтаном органические соединения неалкалоидного характера. Водный раствор, содержащий алкалоиды, подщелачивали до pH=9-12 карбонатом натрия или аммиаком. Далее алкалоиды исчерпывающе экстрагировали дихлорэтаном и высушивали с помощью безводного сульфата натрия. Органический растворитель отгоняли сначала на роторном испарителе, затем его остатки откачивали в глубоком вакууме и вспенивали. Доведенный до постоянной массы остаток взвешивали на аналитических весах. Различие по массе суммы алкалоидов в повторностях не превышало 5%.

Содержание лаппаконитина в корневищах A. septentrionale определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Waters Breeze с двухволновым спектрофотометрическим детектором. Для анализа применялась колонка Excil Amino (250×4,6 мм, размер частиц 5 мк). В качестве подвижной фазы использовался 100% изопропиловый спирт, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование проводилось при длине волны 254 нм. Во всех случаях рассчитывали средние значения из трех биологических и трех аналитических повторностей. Различие между повторностями было менее 5%. Результаты анализов представлены в таблице 1.

Пример 2. Эксперимент проводили на свежесобранных корневищах генеративных (стадия цветения) растений A. septentrionale. Для каждого варианта опыта использовали по 30 корневищ. Для обработки использовали биопрепарат Бациспецин БМ в виде сухого порошка с титром 2,4×10⁶ КОЕ/г, из которого готовили водную суспензию в разведении 2,0 г/л. Корневища обмакивали в приготовленную суспензию, раскладывали на поддоны и накрывали полиэтиленовой пленкой где поддерживалась относительная влажность 85-90%. После инкубации при комнатной температуре корневища извлекали и подвергали анализу на содержание в них суммы алкалоидов и лаппаконитина по выше описанной методике. Инкубацию проводили в течении 1, 12, 24 часов и трех суток (72 часов). В качестве контроля использовали вариант с измельчением корней после их заготовки.

Результаты анализов представлены в таблице 2.

Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют, что обработка собранных корневищ борца северного A. septentrionale биопрепартом Бациспецин БМ (до определенной дозы), вызывает увеличение содержания в них целевого продукта - лаппаконитина. Оптимальные условия обработки - обмакивание корневищ в раствор бациспецина в концентрации, от 2 до 25 г/л и размещения их в камеры с относительной влажностью не менее 85% при комнатной температуре и инкубации при этих условиях от 1 до 3 суток.

Источники информации

1. Федоров Н.И., Мартьянов Н.А., Никитина B.C., Ишбирдина Л.М. Содержание алкалоида лаппаконитина в подземной и надземной частях Aconitum septentrionale Koelle в растительных сообществах Башкирии // Растительные ресурсы. 1996. Т. 32. Вып. 3. С. 96-101.

2. Шаин С.С. Биорегуляция продуктивности растений. М., 2005. 218 с.

3. http://www.expo.ras.ru/base/prod_data.asp?prod_id=3284

4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FN582329.1

5. Патент РФ №2460780, кл. C12N 1/20,2012.

6. Федорова П.Ю., Гильванова Е.А., Актуганов Г.Э., Усанов Н.Г. Новая циклодекстринглюканотрансфераза бактерий Paenibacillus ehimensis ВКМ B-2680D // Биотехнология. - 2012. - №4. - С. 31-38.

7. Степаненко Б.Н. Органическая химия. М.: Медгиз, 1957. 415 с.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Изобретение представляет собой способ повышения содержания алкалоида лаппаконитина в заготовленных корневищах Aconitum septentrionale Koelle, включающий обработку заготовленных корневищ водной суспензией биопрепарата Бациспецин БМ в концентрации от 2 г/л до 25 г/л путем однократного их обмакивания, размещения в камеры с влажностью не менее 85% при комнатной температуре и инкубации при этих условиях от 1 до 3 суток. Изобретение позволяет увеличить содержание в сырье целевого продукта - лаппаконитина. 2 табл., 2 пр.

Способ повышения содержания алкалоида лаппаконитина в заготовленных корневищах Aconitum septentrionale Koelle, включающий обработку заготовленных корневищ водной суспензией биопрепарата Бациспецин БМ в концентрации от 2 г/л до 25 г/л путем однократного их обмакивания, размещения в камеры с влажностью не менее 85% при комнатной температуре и инкубации при этих условиях от 1 до 3 суток.