ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2016 года по МПК C12N5/71 

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящий пункт формулы изобретения свидетельствует в пользу предварительной заявки U.S. № 61/289692, которая была подана 23 декабря 2009 года и включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам активации дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение относится к способам увеличения экспрессии генов NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

Во время эмбрионального развития позвоночных плюрипотентные клетки порождают группу клеток, создающих три зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и эндодерма) в процессе, известном как гаструляция. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование дефинитивной эндодермы. Дефинитивные эндодермальные клетки экспрессируют множество маркеров, таких как HNF-3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

Клетки, несущие черты островковых клеток, как сообщается, были получены in vitro из эмбриональных клеток мышей. Например, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщил о дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в продуцирующие инсулин структуры, схожие с островками поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщил о инсулинпродуцирующих клетках, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые могли нормализовать содержание сахара в крови при их имплантации мышам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом.

В одном примере Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.

В другом примере Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщил о создании инсулинпродуцирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые постоянно экспрессировали Pax4.

В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию PDX1 при добавлении в культуру на четвертый день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).

В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Их результаты показали, что экспрессия экзогенного Pdx1 несомненно повышает экспрессию инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в полученных дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).

В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Они также наблюдали, что уровень экспрессии инсулина и мРНК Pdx1 не зависел от ретиноевой кислоты; однако обработка 3nM FGF7 привела к повышению содержания транскриптов Pdx1 (Biochem. j. 379: 749, 2004).

В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).

Gordon et al. показали индукцию brachyury [положительных ]/ HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши при отсутствии сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнального пути Wnt (США 2006/0003446A1).

Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) сообщил, что “Сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активина одновременно были необходимы для формирования передней первичной полоски.”

Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.

В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (патент США № 6200806, WO 99/20741, WO 01/51616).

D'Amour et al. описывают производство обогащенных культур дефинитивной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).

D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) сообщили: “Мы разработали процесс дифференцировки, который позволяет превращать человеческие эмбриональные клетки (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать такие гормоны поджелудочной железы, как инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование дефинитивной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.

В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательное дифференцировка запускалось никотинамидом.

В одном примере Benvenistry et al. сообщили: “Мы считаем, что чрезмерная экспрессия PDX1 усиливает экспрессию различных генов поджелудочной железы, индукция экспрессии инсулина может требовать дополнительных сигналов, которые присутствуют только in vivo” (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).

В другом примере Grapin-Botton et al. сообщили: “Ранняя активация Ngn3 почти исключительно индуцирует глюкагон [положительные] клетки, что истощает пул клеток-предшественниц поджелудочной железы. Начиная с E11.5, PDX-1 предшественницы получили возможность дифференцироваться в инсулин [положительные] и PP [положительные] клетки” (Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457-465, March 2007).

Экспрессия NGN3 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы, может снизить способность клеток к дальнейшей дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Предыдущие исследования показали, что эти клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы и NGN3, при последующей дифференцировке более склонны к преобразованию в глюкагонпродуцирующие клетки, чем в инсулинпродуцирующие. Однако экспрессия NGN3 требуется для формирования эндокринных клеток поджелудочной железы или их предшественниц (клеток, которые могут превращаться, например, в глюкагон- или инсулинпродуцирующие клетки). Поэтому временная регуляция NGN3 важна для определения дальнейшей судьбы предшественниц эндокринных клеток поджелудочной железы с целью их преобразования в инсулинпродуцирующие клетки.

Поэтому все еще существует существенная необходимость в разработке условий для создания линий плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть использованы для удовлетворения текущих клинических потребностей, сохраняя при этом возможность к дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Настоящее изобретение предлагает альтернативный подход к повышению эффективности дифференциации человеческих эмбриональных стволовых клеток в инсулинпродуцирующие клетки при помощи способа усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:

a) культивирование плюрипотентных стволовых клеток,

b) дифференциация плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий,

c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, при помощи добавления в среду, используемую для дифференциации клеток, экспрессирующих маркеры, характерныедля дефинитивных эндодермальных клеточных линий, соединений, выбранных из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и

d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в среду, используемую для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, добавляется соединение, выбранное из группы, состоящей из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Стволовые клетки классифицируются по своему потенциалу развития на: (1) тотипотентные, способные к порождению всех эмбриональных и экстраэмбриональных видов клеток; (2) плюрипотентные, способные к порождению всех эмбриональных видов клеток; (3) мультипотентные, способные к порождению субпопуляций клеточных линий в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтическая стволовая клетка (HSC) может образовывать предшественниц, которые могут включать HSC (в целях самообновления), олигопотентных предшественниц клеток крови и все виды клеток и элементов крови (например, тромбоциты), которые являются нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, способные порождать более ограниченные субпопуляции клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные породить одну клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцировкам представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.

Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF-3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-одобный гомеобокс белок типа Mix, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки дефинитивной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, NKX6.1 или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.

Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Использованные здесь термины “эндокринная клетка поджелудочной железы”, или “экспрессирующая гормоны клетка поджелудочной железы "относятся к клеткам, способным экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток

Характеристика плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспресии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при их наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т. е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники плюрипотентных стволовых клеток

К типам полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии полипотентных клеток, получаемых из ткани, образующейся после беременности, в том числе, из преэмбриональной ткани (такой, как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока около 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей- источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются в соответствии с методикой, описанной Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование плюрипотентных стволовых клеток

В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

Например, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) and Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) открыли культуру клеточной линии плюрипотентных стволовых клеток из человеческой бластоцисты при помощи слоя питающих фибробластов эмбриона мыши.

Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценил набор из 11 различных зрелых, фетальных и неонатальных питающих клеток человека по их способности поддерживать жизнедеятельность клеточной культуры плюрипотентных стволовых клеток. Richards et al, сообщил: “клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированные на зрелых питающих фибробластах кожи, сохраняют морфологию человеческих эмбриональных стволовых клеток и остаются плюрипотентными”.

В заявке на патент США № 20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку полипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США № 20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.

В другом примере Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанного дифференцирования человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают получение питающих клеток из человеческой плаценты.

Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.

В другом примере Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих фибробластов постнатальной крайней плоти.

В патенте США № 6642048 описывается среда, поддерживающая рост полипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте США № 6642048 сообщается: “Это изобретение включает мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способ получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды”.

В другом примере, заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В патенте WO2005014799 сообщается: “Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, обуславливает секреторную активность клеток мыши; В частности, эти дифференцированные и иммортализованные трансгенные гепатоциты, названные MMH (Met-гепатоциты мыши)”.

В другом примере, Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.

В другом примере, заявке на патент США № 20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания полипотентных стволовых клеток.

В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).

В другом примере, в патенте США № 20050148070 описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток на определенной среде без сыворотки и фибробластных питающих клеток, этот способ состоит из: культивирования стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минералы, по меньшей мере один трансферрин или его заменитель, по меньшей мере один инсулин или его заменитель; в культуральной среде фактически отсутствует эмбриональная сыворотка млекопитающих и она содержит по меньшей мере 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способствующего активации сигнального рецептора фактора роста фибробластов, в то время как этот фактор роста поступает не из слоя питающих фибробластов, а из другого источника; среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без использования питающих клеток или кондиционированной среды.

В другом примере, в патенте США № 20050233446 описывается среда, которая может использоваться для культивирования стволовых клеток, включая недифференцированные примордиальные стволовые клетки приматов. Клетки из раствора, представленного фактически изотонической средой, сравнивались с культивированными стволовыми клетками. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.

В другом примере, патенте США № 6800480, говорится “В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, включающей питающие клетки и экстраклеточный матрикс, полученный из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, содержащей нуклеозиды и соль-пируват”.

В другом примере, патенте США № 20050244962 сообщается: “В одной особенности изобретения предлагается методика культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно, также, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме, слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов”.

В еще одном примере, патенте WO2005065354 описывается определенная изотоническая культурная среда, в которой фактически отсутствуют питающие клетки и эмбриональная сыворотка, эта среда состоит из: a. базальной среды; b. основного фактора роста фибробластов в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; в. инсулина в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. аскорбиновой кислоты в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.

В другом примере, в заявке на патент WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL^® (Becton Dickenson). MATRIGEL^® является растворимым препаратом из опухолевых клеток Энгельбрет-Холм-Сварм, которые превращаются в гель при комнатной температуре с образованием воссозданной базальной мембраны.

В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.

Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

Образование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные эндокринной линии клеток поджелудочной железы, с усилением экспрессии NGN3 и NKX6.1.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии клеток поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:

a) культивирования плюрипотентных стволовых клеток,

b) дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток дефинитивной эндодермы,

c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с добавлением в среду, используемую для дифференцировки клеточной линии дефинитивной эндодермы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и

d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной клеточной линии поджелудочной железы.

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой, а затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А в отсутствие сыворотки, затем культивирования клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример данного способа описан в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин А и лиганд Wnt в отсутствие сыворотки, затем удаления лиганда Wnt и культивирования клеток с активином A и сывороткой. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной сформированной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. No. 11/779,311, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. No. 60/990,529.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076889.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076900.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076908.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США Сер. № 61/076915.

Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или с использованием способа, предложенного в настоящем изобретении.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в соответствии с методикой, описанной D'Amour et al., Nature Biotechnol. 24:1392-1401, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, фактором роста фибробластов и ингибитором сигнального пути Hedgehog KAAD-циклопамином с последующим удалением содержащей фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин среды и культивированием клеток в среде, содержащей ретиноевую кислоту, фактор роста фибробластов и KAAD-циклопамин. Пример использования данного способа приведен в публикации Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, ретиноевой кислотой и по меньшей мере одним фактором роста фибробластов в течение периода времени, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 11/779,311, принадлежащей LifeScan, Inc.

В одном из аспектов настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в заявке на патент США Сер. № 60/990529.

Эффективность дифференцировки может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.

Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Сюда относятся количественная ревертазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)), и иммунологический анализ, такой как иммуногистохимический анализ секционного материала, Вестерн-блоттинг и проточный цитометрический анализ (FACS) для исследования маркеров, экспрессируемых в живых клетках (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть выделены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы.

К плюрипотентным стволовым клеткам, которые могут использоваться в настоящем изобретении, относятся, например, человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H9 (код NIH: WA09), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H1 (код NIH: WA01), человеческие эмбриональные стволовые клетки линии H7 (код NIH: WA07) и человеческие эмбриональные стволовые клетки линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также для использования в рамках настоящего изобретения подходят клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, и Tra 1-81.

Маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, выбираются из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, NODAL, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксового белка, FGF4 CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии дефинитивной эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку-предшественницу первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой мезэндодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, представляет собой клетку дефинитивной эндодермы.

Маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, выбирают из группы, состоящей из PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HB9 и PROX1. Подходит для использования в настоящем изобретении клетка, экспрессирующая, как минимум, один из маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, представляет собой клетку панкреатической эндодермы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы. В настоящем изобретении предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы .

Усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, соединениями, выбранными из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7. Кроме того, усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, соединениями, выбранными из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, состоящей из веществ X, Y и Z, клетки обрабатываются путем добавления в среду, которая используется для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, состоящей из веществ X, Y и Z, клетки обрабатываются путем добавления в среду, которая используется для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, с усилением экспрессии NGN3 и NKX6.1

Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, при помощи любого способа из этой области техники или любого способа, который был предложен в настоящем изобретении.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей экзендин 4, затем удаления среды, содержащей экзендин 4 с последующим культивированием клеток в среде, содержащей экзендин 1, IGF-1 и HGF. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, Миссури) и экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, содержащей экзендин 4. Пример использования данного способа приведен в публикации D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным № 11/736908, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 11/779311, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 60/953178, принадлежащей LifeScan, Inc.

Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, полученные способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, способами, описанными в заявке на патент США с серийным No. 60/990529, принадлежащей LifeScan, Inc.

Маркеры, характерные для эндокринной линии дифференцировки клеток поджелудочной железы, выбирают из группы, состоящей из следующих маркеров: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1 альфа. В одном осуществлении настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. Соответствующей целям настоящего изобретения является клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном из аспектов настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Указанная панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте указанная панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.

В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток. Клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3-бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка с экспрессией маркеров, характерных для линии дифференцировки β-клеток, представляет собой β-клетку.

В настоящем изобретении предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения усиление экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, может быть достигнуто путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, соединением, выбранным из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

В случае, когда клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатический эндодермы, обрабатываются соединением, выбранным из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, клетки, обработанные путем добавления в среду, использующуюся для дифференцировки клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется, помимо прочих, следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Скрининг аналогов малых молекул, регулирующих экспрессию NGN3

Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия фактора транскрипции NGN3. Желаемым результатом является увеличение эффективности этого процесса. Скрининг низкомолекулярных соединений был произведен на основании предположения, что энзиматические ингибиторы могут регулировать передачу клеточных сигналов во время дифференцировки и оказывают прямое или непрямое влияние на экспрессию генов наиболее важных факторов транскрипции, таких как NGN3.

Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231); PerkinElmer; Cat #6005182 Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO₂.

Подготовка соединений: Скрининг был проведен с использованием двух имеющихся в продаже банков низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2) и EMD Biosciences: Cat # 539745). В Таблице 1 и Таблице 2 показаны соединения из этих банков ингибиторов киназ BioMol и EMD соответственно. Соединения из этих банков были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Соединения из этих банков далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5мкмоль в 0,1% ДМСО.

Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400), в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032), в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19) и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) с (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 50 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль транс-ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625) и 30 нг/мл Активина A. Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на двух отдельных планшетах (Планшеты A и B); третий планшет (Планшет C) остался необработанным. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Четвертый этап протокола дифференцировки занял три дня. Происходила подкормка клеток на 1 и 2 день (но не на 3) путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin, и 1 мкмоль ингибитора Alk 5(Axxora; Cat # ALX-270-445). Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на двух отдельных планшетах (Планшеты В и С); третий планшет (Планшет А) остался необработанным. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы с последующей фиксацией при комнатной температуре с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) в ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Первое антитело (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444) было разведено в соотношении 1:300 в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) были разведены в соотношении 1:100 и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4мкг/мл Хехст33342 (Invitrogen; Cat # H3570) в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.

При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенных красителями Хехст 33342 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.

Результаты исследования показаны в Таблице 3 из комбинаций двух банков ингибиторов киназ, которые были использованы для обработки 6 исследуемых планшетов в рамках этого единичного эксперимента. Представленные данные являются репрезентативными коэффициентами интенсивности флуоресценции окрашивания NGN3 для обработанных лунок с индивидуальными соединениями в сравнении с лунками, которые были обработаны только нейтральным ДМСО. Коэффициенты интенсивности, как и ранжирование, показаны для индивидуальных соединений, которые были получены отдельно во время 3 или 4 шага, или при сочетании 3 и 4 шага. Соединения с коэффициентами интенсивности >1,4 относительно контроля, который был обработан нейтральным веществом, были отмечены как пики для подтверждения и дополнительной оценки. Особенно интересно, как было обобщено в Таблице 4, что соединения, при добавлении которых были обнаружены некоторые целевые сигнальные клеточные пути, могут быть вовлечены в оптимальную схему экспрессии NGN3 во время дифференцировки эндокринных клеток.

Пример 2

Скрининг аналогов малых молекул, регулирующих экспрессию NKX6.1 и NGN3

Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия факторов NKX6.1 и NGN3. Исследование ингибиторов киназ было проведено для определения того, могут ли они оказывать положительное действие на экспрессию одного или обоих маркеров во время дифференцировки клеток. В данном примере в протокол дифференцировки также был включен ингибитор деацетилазы гистонов Трихостатин А с целью регуляции реконструкции хроматина и возможного усиления транскрипции генов.

Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) (Packard ViewPlates; PerkinElmer; Cat #6005182) Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO₂.

Подготовка соединений: Скрининг был проведен с использованием двух имеющихся в продаже банков низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2), как показано в Таблице 1. Соединения из этих банков были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Соединения из этих банков далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5мкмоль в 0,1% ДМСО.

Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мло сновного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19), и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Третий этап протокола дифференцировки занял пять дней. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 50 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль M транс ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625), 30 нг/мл Активина A и 100 нмоль Трихостатина A (TsA; Sigma; Cat # T8552). Во время шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ были добавлены в каждую лунку на 2 и 4 день. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Четвертый этап протокола дифференцировки занял три дня. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin,мкмоль ингибитора Alk 5 (Axxora; Cat # ALX-270-445) и 1 мкг/мл DAPT (Sigma; Cat #D5942). Во время шага 4 в первый день в каждую лунку были добавлены опытные образцы ингибиторов киназ и 100 нмоль Трихостатина А, затем на 2 и 3 день при подкормке клеток оба опытных образца ингибиторов киназ и Трихостатин А уже не добавлялись. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы с последующей фиксацией при комнатной температуре в течение 20 минут с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) В ФСБв течение 30 минут при комнатной температуре. Первое антитело (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444 или анти-NKX6.1 мыши; Университет штата Айова; Cat # F55A12) было разведено (в соотношении 1:300 для анти-NGN3; в соотношении 1:500 для анти-NKX6.1) в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) и вторичные ослиные противомышиные антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Cat #A21202) были разведены в соотношении 1:100 (для обоих видов вторичных антител) и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4 мкг/мл красителя Хехст 33342 (Invitrogen; Cat # H3570)в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.

При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенных красителями Хехст 33342, Alexa Flour 647 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 или NKX6.1 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.

Результаты данного исследования были обобщены в Таблице 5, Таблице 6 и Таблице 7. Данные из Таблицы 5 являются репрезентативными коэффициентами интенсивности флуоресценции окрашивания NGN3 и NKX6.1 для обработанных лунок с индивидуальными соединениями в сравнении с лунками, которые были обработаны только нейтральным ДМСО. Кроме того, также показано ранжирование воздействия каждого соединения на экспрессию белков NGN3 или NKX6.1. В Таблице 6 приводится ранжирование 16 наивысших пиков, которые оказали положительное воздействие на экспрессию NGN3 и/или NKX6.1. В Таблице 7 обобщаются данные о мишенях и путях передачи сигнала, которые имеют отношение к этим пикам. Сигнальные пути, обусловленные воздействием соединения с множественными пиками, которые были получены в рамках этого исследования, должны иметь наибольшее значение с точки зрения влияния на экспрессию этих двух факторов транскрипции, которые играют критическую роль в дифференцировке эндокринных клеток.

Пример 3

Подтверждение регулирующей роли аналогов малых молекул в экспрессии NGN3 и NKX6.1

Во время превращения клеток-предшественниц в эндокринные клетки необходима экспрессия фактора NKX6.1 и NGN3. Исследование ингибиторов киназ было проведено для определения того, могут ли они оказывать положительное действие на экспрессию одного или обоих маркеров во время дифференцировки клеток. В данном примере в протокол дифференцировки также был включен ингибитор деацетилазы гистонов Трихостатин А с целью регуляции реконструкции хроматина и возможного усиления транскрипции генов.

Подготовка клеток для анализа: Недифференцированное, плюрипотентное состояние исходной культуры эмбриональных стволовых клеток человека (клеточная линия H1 эмбриональных стволовых клеток человека) поддерживалось при помощи подавления факторов роста на планшетах с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши, которая была покрыта MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) с проведением пассирования клеток в среднем раз в четыре дня. Пассирование проводилось путем обработки клеточной культуры раствором диспазы с концентрацией 1 мг/мл (Invitrogen, Cat #: 17105-041) в течение 5-7 минут при 37°C с последующим промыванием монослоя с кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши и аккуратным соскабливанием для восстановления клеточных кластеров. Кластеры были центрифугированы на низкой скорости для сбора сгустка клеток и удаления остаточного количества диспазы. Для проведения планового обслуживания клеточные кластеры были разведены в отношении 1:3 или 1:4. Все линии эмбриональных стволовых клеток человека поддерживали при номерах пассажа менее P50 и периодически проверяли на нормальный кариотип и отсутствие микоплазмы. Для скринингов в формате небольшого исследования кластеры эмбриональных стволовых клеток человека H1 были забраны из клеточной культуры, которая была предварительно обработана диспазой описанным выше способом, и были высеяны с распределением 1:2 (по площади поверхности) на черный планшет с 96 лунками объемом 100 мкл, которые для инактивации факторов роста были покрыты MATRIGEL (BD Biosciences; Cat # 356231) (Packard ViewPlates; PerkinElmer; Cat #6005182) . Клеткам дали зафиксироваться, и затем восстановили фазу логарифмического роста с периодичностью от 1 до 3 дней, подкармливая клетки кондиционированной средой с фибробластами эмбриона мыши с добавлением 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (R&D Systems; Cat # 233-FB). Во время проведения исследования планшеты содержались во влажной камере при 37°C с 5% содержанием CO₂.

Подготовка соединений: Подтверждающий скрининг был проведен с использованием одного имеющегося в продаже банка низкомолекулярных ингибиторов киназ (BioMol Intl; Cat # 2832A(V2.2), как показано в Таблице 1. Интересующие соединения из этого банка были доступны в чистом виде в количестве 10 ммоль на планшетах с 96 лунками, где они были разведены в 100% ДМСО и хранились при -80°C. Интересующие нас индивидуальные соединения из этого банка далее были разведены до промежуточной концентрации 2,5 ммоль в 100% ДМСО (Sigma; Cat # D2650), после чего хранились до использования при -80°C. В день проведения исследования эти индивидуальные соединения были разведены в соотношении 1:12.5 в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы до получения рабочего запаса с концентрацией 200 мкмоль в 8% ДМСО, после чего они были разведены в соотношении 1:80 в каждой лунке для проведения анализа до получения итоговой концентрации соединения 2,5 мкмоль в 0,1% ДМСО.

Скрининговое исследование дифференцировки: Шаг 1 протокола дифференцировки проводился в течение 3 дней, во время которых ежедневно происходила подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл). В первый день исследования для подкормки в лунки вводилась среда RPMI-1640 (Invitrogen; Cat #: 22400) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA) (Proliant Inc.; Cat #: SKU 68700), 100 нг/мл Активина A (PeproTech; Cat #120-14), 20 нг/мл Wnt3a (R&D Systems; Cat # 1324-WN/CF) и 8 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (R&D Systems; Cat # 233-FB). На второй и третий день исследования для подкормки в лунки вводилась та же среда, за исключением того, что из нее был удален Wnt3a. Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Шаг 2 протокола дифференцировки проводился в течение двух дней. Происходила ежедневная подкормка клеток путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей среды (100 мкл) Игла в модификации Дульбекко/F12 (Invitrogen; Cat # 11330-032) в состав которой входила не содержащая жирных кислот 2% V фракция бычьего альбумина (FAF BSA), 50 нг/мл фактора роста фибробластов (PeproTech; Cat # 100-19) и 250 нмоль KAAD-циклопамина (Calbiochem; Cat # 239804). Клетки во всех лунках подкармливались и обрабатывались одинаковым образом.

Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200 мкл) (Invitrogen; Cat # 10569) с добавлением 0,1% Albumax (Invitrogen; Cat #: 11020-021), 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена (ITS-X; Invitrogen; Cat # 51500056), 0 нг/мл фактора роста фибробластов, 100 нг/мл Noggin (R&D Systems; Cat # 3344-NG), 250 нмоль KAAD-циклопамина, 2 мкмоль транс-ретиноевой кислоты (RA) (Sigma-Aldrich; Cat # R2625) и 20 нг/мл Активина А. Во время подкормки в 1 и 3 день шага 3 опытные образцы ингибиторов киназ в трех экземплярах были добавлены в каждую лунку планшетов. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Третий этап протокола дифференцировки занял четыре дня. Происходила подкормка клеток через день путем аспирирования среды из каждой лунки с последующей ее заменой эквивалентным количеством свежей модифицированной по способу Дульбекко среды Игла с высоким содержанием глюкозы (200l) с добавлением 0,1% Albumax, 0,5x добавки инсулина-трансферрина-селена, 100 нг/мл Noggin и 1мкмоль ингибитора Alk 5(Axxora; Cat # ALX-270-445). Во время шага 4 опытные образцы ингибиторов киназ в трех экземплярах были добавлены в каждую лунку планшетов во время подкорма клеток на 1 и 3 день. На каждом планшете каждая из 16 контрольных лунок была обработана эквивалентным количеством 0,1% ДМСО без какого-либо исследуемого соединения.

Одновременный многопараметрический анализ: В конце шага 4 среды из всех исследуемых планшетов были аспирированы и зафиксированы при комнатной температуре в течение 20 минут с 4% параформальдегидом (Sigma-Aldrich; Cat # 158127), разведенным в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) без двухвалентных катионов (Invitrogen; Cat # 14190), а затем однократно промыты ФСБ. Клеточные мембраны образцов были пермеабилизированы 0,5% Тритоном X-100 (VWR; Cat # VW3929-2) в течение 20 минут при комнатной температуре, двукратно промыты ФСБ и блокированы 5% ослиной сывороткой (Jackson ImmunoResearch; Cat # 017-000-121) в ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Первые антитела (анти-NGN3 барана; R&D Systems; AF3444 или анти-NKX6.1 мыши ; Университет Штата Айова; Cat # F55A12) было разведено (в соотношении 1:300 для anti-NGN3; в соотношении 1:500 для анти-NKX6.1) в 5% ослиной сыворотке и добавлено в каждую лунку на один час при комнатной температуре. После двукратного промывания ФСБ вторичные ослиные противобараньи антитела Alexa Fluor 647 (Invitrogen; Cat # A21448) и вторичные ослиные противомышиные антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen; Cat #A21202) были разведены в соотношении 1:100 (для обоих видов вторичных антител) и добавлены в лунку к каждому образцу в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего они были дважды промыты ФСБ. Для контрастной окраски ядер было добавлено 4мкг/мл красителя Хехст 33342 (Invitrogen; Cat # H3570) в течение 10 минут при комнатной температуре. Планшеты были однократно промыты ФСБ, после чего в каждой лунке для визуализации было оставлено по 100 мкл ФСБ.

При помощи IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare) с использованием дихроического зеркала с 51008 светоделителями проводилась визуализация клеток, окрашенныхкрасителями Хехст 33342, Alexa Flourr 488 и Alexa Flour 647. Время воздействия было оптимизировано в сравнении с лунками с положительным контролем, которые были окрашены только вторичными антителами. Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания каждую лунку снимали в 15 проекциях. Общее число клеток и общую интенсивность сигнала NGN3 измеряли для каждой лунки с помощью программного пакета IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). Сегментацию ядер определяли по ступеням шкалы серых тонов (исходный интервал 100-300) и размерам ядра. Общий уровень экспрессии белка NGN3 или NKX6.1 выражается в виде общей интенсивности или интегральной интенсивности, определяемой как произведение общей интенсивности флюоресценции клетки на площадь клетки. Фон оценивался на основе критериев допустимости шкалы оттенков серого в диапазоне от 200 до 3500. Данные об общей интенсивности были нормализованы путем деления общей интенсивности флюоресценции каждой лунки на среднюю общую интенсивность флюоресценции положительного контроля.

Результаты этих исследований показаны в Таблице 8. Предположения о свойствах двух соединений (кенпаулона и BML-259) не подтвердились, и они не оказывали усиливающее действие на экспрессию NGN3 или NKX6.1 в сравнении с контролем. Было показано, что оставшиеся исследованные соединения оказывают положительное воздействие на оба фактора транскрипции, что подтверждает полученные ранее результаты и подчеркивает важность этих связанных сигнальных путей.

Таблица 1
Банк ингибиторов киназ BioMol (Cat # 2832, v2.2) РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ № CAS НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № Молекулярная масса Мишень B1 167869-21-8 PD-98059 267,3 MEK B2 109511-58-2 U-0126 380,5 MEK B3 152121-47-6 SB-203580 377,4 p38 митоген-активируемая протеинкиназа B4 84477-87-2 H-7 364,3 Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. B5 84468-17-7 H-9 324,3 Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. B6 62996-74-1 Стауроспорин 466,5 Неспецифично B7 133550-35-5 AG-494 280,3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа фактора роста тромбоцитов B8   AG-825 397,5 HER1-2 B9 125697-92-9 Лавендустин A 381,4 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса B10 136831-49-7 RG-14620 274,1 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса B11 118409-57-7 Тирфостин 23 186,1 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса B12 118409-58-8 Тирфостин 25 202,1 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса C1 122520-85-8 Тирфостин 46 204,2 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа фактора роста тромбоцитов C2 122520-86-9 Тирфостин 47 220,2 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса C3 122520-90-5 Тирфостин 51 268,2 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса C4 2826-26-8 Тирфостин 1 184,2 Отрицательный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. C5 116313-73-6 Тирфостин AG 1288 231,2 Тирозинкиназы

C6 63177-57-1 Тирфостин AG 1478 315,8 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса C7 71897-07-9 Тирфостин AG 1295 234,3 Тирозинкиназы C8 10537-47-0 Тирфостин 9 282,4 Киназа фактора роста тромбоцитов C9   HNMPA (гидрокси-2-нафталенилметилфосфоновая кислота) 238,2 Киназа инсулинового рецептора C10 120685-11-2 PKC-412 (протеинкиназа С) 570,6 Ингибитор протеинкиназы С C11 10083-24-6 Пицеатаннол 244,3 Тирозинкиназа селезенки C12 172889-26-8 PP1 281,4 Киназы семейства Src D1 133550-35-3 AG-490 294,3 JAK-2 киназа D2   AG-126 215,2 ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа D3   AG-370 259,3 Киназа фактора роста тромбоцитов D4   AG-879 316,5 Киназа рецептора фактора роста нервов D5 154447-36-6 LY 294002 307,4 PI 3-K D6 19545-26-7 Вортманнин 428,4 Фосфоинозитид-3-киназа D7 133052-90-1 GF 109203X 412,5 Протеинкиназа С D8 548-04-9 Гиперицин 504,4 Протеинкиназа С D9 138489-18-6 Ro 31-8220 553,7 Протеинкиназа С D10 123-78-4 Сфингозин 299,5 Протеинкиназа С D11 127243-85-0 H-89 519,2 Протеинкиназа A D12 84478-11-5 H-8 338,3 Протеинкиназа A, Протеинкиназа G E1 91742-10-8 HA-1004 329,8 Протеинкиназа A, Протеинкиназа G E2 103745-39-7 HA-1077 327,8 Протеинкиназа A, Протеинкиназа G E3   HDBA (2-гидрокси-5-(2,5-дигидроксибензиламино)бензойная кислота) 275,3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II

E4 127191-97-3 KN-62 721,9 Кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II E5   KN-93 501 Кальций/кальмодулин - зависимая протеинкиназа II E6 109376-83-2 ML-7 452,7 Киназа легких цепей миозина E7 105637-50-1 ML-9 361,3 Киназа легких цепей миозина E8 452-06-2 2-аминопурин 135,1 p58 протеинкиназа PITSLRE бета 1 E9 158982-15-1 N9-изопропилоломоуцин 326,4 Циклин-зависимая киназа E10 101622-51-9 Оломоуцин 298,3 Циклин-зависимая киназа E11 101622-50-8 изооломоуцин 298,4 Негативный контроль для оломицина. E12 186692-46-6 Росковитин 354,5 Циклин-зависимая киназа F1 24386-93-4 5-йодотуберцидин 392,2 Внеклеточно регулируемая киназа 2, аденозин-киназа, креатинкиназа 1, креатинкиназа 2, F2 62004-35-7 LFM-A13 360 Тирозинкиназа Брутона F3 152121-30-7 SB-202190 331,3 p38 митоген-активируемая протеинкиназа F4 172889-27-9 PP2 301,8 Семейство киназ Src F5 208260-29-1 ZM 336372 389,4 RAF прото-онкогенная серин/треонин протеинкиназа F6 5812-07-7 SU 4312 264,3 Flk1 F7 146535-11-7 AG-1296 266,3 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов F8 220904-83-6 GW 5074 520,9 RAF прото-онкогенная серин/треонин протеинкиназа F9 6865-14-1 Пальмитоил-DL-карнитин Cl 436,1 Протеинкиназа C F10 82-08-6 Роттлерин 516,6 Протеинкиназа C дельта F11 446-72-0 Генистеин 270,2 Тирозинкиназы F12 486-66-8 Даидзеин 254,2 Негативный контроль для генистеина. G1 63177-57-1 Эрбстатина аналог 194 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса

G2 6151-25-3 Кверцитина дигидрат 338,3 Фосфоинозитид-3-киназа G3   SU1498 390,5 Flk1 G4 4452-06-6 ZM 449829 182,2 JAK-3 киназа G5 195462-67-7 BAY 11-7082 207,3 Сигнальный путь IκB киназ G6 53-85-0 DRB (5,6-дихлор-1-b-D-рибофуранозилбензимидазол) 319,1 Креатинкиназа II G7   HBDDE (2,2',3,3',4,4'-гексагидрокси-1,1'-бифенил-6,6'-диметанола диметиловый эфир) 338,4 Протеинкиназа C альфа, протеинкиназа C гамма G8 129-56-6 SP 600125 220,2 c-Jun-N-терминальная киназа G9 479-41-4 Индирубин 262 Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 G10 160807-49-8 Индирубин-3'-моноксим 277,3 Киназа гликогенсинтазы-3 бета G11 146986-50-7 Y-27632 338,3 RhoA-активируемая киназа G12 142273-20-9 Кенпауллон 327,2 Киназа гликогенсинтазы-3 бета H1 121-40-4 Терреиновая кислота 154,1 Киназа Брутона H2 35943-35-2 Трицирибин 320,3 Сигнальный путь протеинкиназы В H3   BML-257 326,4 Протеинкиназа В H4   SC-514 224,3 IKK2 H5   BML-259 260,4 Циклин-зависимая киназа 5/p25 H6 520-36-5 Апигенин 270,2 Креатинкиназа-II H7   BML-265 (аналог эрлотиниба) 305,4 EGFRK H8 53123-88-9 Рапамицин 914,2 мишень рапамицина в клетках млекопитающих

Таблица 2
Банк ингибиторов киназ EMD Calbiochem (Cat # 539745) РАСПОЛОЖЕНИЕ НА ПЛАНШЕТЕ № CAS НАИМЕНОВАНИЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЛИ № Молекулярная масса A2 127191-97-3 KN-62 721,9 A3 587871-26-9 Ингибитор ATM-киназы 395,5 A4 905973-89-9 Ингибитор ATM/ATR-киназы 555,8 A5 237430-03-4 Алстерпауллон 293,3 A6 852527-97-0 Алстерпауллон, 2-цианоэтил 346,3 A7 496864-16-5 Алоизин A, RP107 267,3 A8 496864-15-4 Алоизин, RP106 281,4 A9 220792-57-4 Аминопурваланол A 403,9 A10 866405-64-3 Ингибитор AMPK, Соединение C 399,5 A11 879127-16-9 Ингибитор III киназы Aurora 413,4 B2 443797-96-4 Ингибитор киназы Aurora / Cdk 435,4 B3 160807-49-8 Индирубин-3′-моноксим 277,3 B4 19542-67-7 BAY 11-7082 207,2 B5 189232-42-6 Богемин 340,4 B6 220749-41-7 Ингибитор Cdk1 294,7 B7 190654-01-4 Ингибитор Cdk1, CGP74514A 385,9 B8 443798-55-8 Cdk1/2-ингибитор III 425,4 B9 40254-90-8 Ингибитор Cdk1/5 185,2 B10 301836-43-1 Ингибитор казеинкиназы I, D4476 398,4 B11 934358-00-6 Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA 463,8 C2 546102-60-7 Ингибитор Cdk4 404,2 C3 141992-47-4 Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 271,3

C4 265312-55-8 Cdk4-ингибитор III 284,3 C5 300801-52-9 Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 249,3 C6 516480-79-8 Chk2-ингибитор II 363,8 C7 212779-48-1 Соединение 52 346,8 C8 199986-75-9 Cdk2-ингибитор III 400,5 C9 444723-13-1 Cdk2-ингибитор IV, NU6140 422,5 C10 784211-09-2 Ингибитор Cdk/Crk 473,4 C11   ERK-ингибитор III 318,3 D2 146986-50-7 Ингибитор ROCK, Y-27632 338,3 D3 865362-74-9 ERK-ингибитор II, FR180204 327,3 D4   ERK-ингибитор II, отрицательная контрольная группа 328,3 D5   Фаскаплизин, синтетический 306,8 D6   GSK-3b-ингибитор I 222,3 D7 478482-75-6 GSK-3b-ингибитор II 395,2 D8 487021-52-3 GSK-3b-ингибитор VIII 308,3 D9 667463-62-9 GSK-3-ингибитор IX 356,2 D10   GSK-3-ингибитор X 398,2 D11 626604-39-5 GSK-3b-ингибитор XI 349,3 E2 330161-87-0 SU6656 371,5 E3 404828-08-6 GSK-3-ингибитор XIII 301,4 E4 244148-46-7 Изогранулатимид 276,3 E5 186611-52-9 IC261 311,3 E6 507475-17-4 IKK-2-ингибитор IV 279,3 E7   Индирубиновое производное E804 365,4 E8 129-56-6 JNK-ингибитор II 220,2 E9   JNK ингибитор, отрицательная контрольная группа 234,2 E10 345987-15-7 JNK-ингибитор V 372,5

E11 312917-14-9 JNK-ингибитор IX 350,4 F2 41179-33-3 Ингибитор MK2a 349,4 F3 894804-07-0 JNK-ингибитор VIII 356,4 F4 97161-97-2 K-252a, Nocardiopsis sp. 467,5 F5 142273-20-9 Кенпауллон 327,2 F6 139298-40-1 KN-93 501,0 F7   MEK-ингибитор I 374,5 F8 623163-52-0 MEK-ингибитор II 289,7 F9 305350-87-2 Ингибитор MEK1/2 335,4 F10 522629-08-9 Ингибитор MNK1 244,2 F11 545380-34-5 Ингибитор активации транскрипционного фактора NF-κB 356,4 G2 581098-48-8 Ингибитор III MAP-киназы p38 404,5 G3 219138-24-6 Ингибитор MAP-киназы p38 365,8 G4 167869-21-8 PD 98059 267,3 G5 152121-53-4 PD 169316 360,3 G6 165806-53-1 SB220025 338,4 G7 212844-53-6 Пурваланол A 388,9 G8   GSK3b-ингибитор XII, TWS119 318,3 G9 127243-85-0 H-89, дигидрохлорид 519,3 G10   SB 202474, отрицательная контрольная группа для опытов с ингибированием p38 MAPK 279,3 G11 152121-30-7 SB 202190 331,3 H2 152121-47-6 SB 203580 377,4 H3 103745-39-7 HA 1077, дигидрохлорида фасудил 364,3 H4 135897-06-2 SB 218078 393,4 H5 318480-82-9 SC-68376 236,3

H6 72873-74-6 SKF-86002 297,4 H7   Ингибитор сфингозинкиназы 339,2 H8 62996-74-1 Стауроспорин, Streptomyces sp. 466,5 H9 52029-86-4 STO-609 374,4 H10 666837-93-0 SU9516 241,3 H11 871307-18-5 Ингибитор Tpl2-киназы 404,8

Таблица 3
Банки ингибиторов киназ EMDII и BioMol   NGN3 Интенсивность Доза на шаге 3 Доза на шаге 4 Доза на шаге 3&4 Банк Лунка Мишень Ингибитор Ранжирование Коэффициент Ранжирование Коэффициент Ранжирование Коэффициент Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 4 Семейство киназ Src PP2 8 1,81 2 2,50 1 2,49 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 5 Фосфоинозитид-3-киназа LY 294002 7 1,82 9 1,63 2 2,46 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 3 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-203580 3 2,23 7 1,88 3 2,34 Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 2 p38 SB 203580 19 1,53 52 1,08 4 2,22 Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 5 p38 SC-68376 29 1,41 121 0,69 5 2,12 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 4 Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. H-7 5 1,93 5 2,18 6 2,08 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 10 не является ингибитором протеинкиназы p38 SB 202474, отрицательный контроль для p38 митоген-активируемая протеинкиназы 116 0,88 62 1,03 7 2,02 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 7 (CDK1/2/5)(GSK3i) Алоизин A, RP107 58 1,25 55 1,06 8 1,97

Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 3 RhoA-активируемая киназа гиалуронат 1077, фасудил 47 1,32 20 1,40 9 1,93 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 3 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-202190 11 1,72 58 1,05 10 1,83 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 2 Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-62 110 0,93 107 0,81 11 1,82 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 11 RhoA-активируемая киназа Y-27632 120 0,84 1 2,67 12 1,78 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 11 Протеинкиназа A H-89 2 2,57 4 2,23 13 1,75 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 6 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин AG 1478 15 1,62 10 1,57 14 1,74 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 3 ATM-киназа Ингибитор ATM-киназы 54 1,28 88 0,91 15 1,70 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 12 Семейство киназ Src PP1 4 2,05 12 1,48 16 1,67 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 1 Протеинкиназа А, протеинкиназа G HA-1004 6 1,82 3 2,30 17 1,63 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 9 Циклин-зависимая киназа1/5 Ингибитор циклин-зависимой киназы 1/5 83 1,12 100 0,85 18 1,61 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 7 CDC28 Соединение 52 67 1,22 122 0,68 19 1,61 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 9 MEK1/2 Ингибитор MEK1/2 94 1,03 110 0,77 20 1,60 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 7 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса BML-265 (аналог эрлотиниба) 16 1,58 30 1,25 21 1,59 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 4 MEK1/2 PD 98059 71 1,21 78 0,96 22 1,57 Ингибиторы киназ F - 2 MK2a Ингибитор MK2a 107 0,95 80 0,95 23 1,54

из банка EMDII                   Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 6 p38 SKF-86002 46 1,32 92 0,89 24 1,49 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 9 Киназа инсулинового рецептора Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора 93 1,06 39 1,19 25 1,38 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 5 Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. H-9 1 2,62 6 1,97 26 1,36 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 6 Креатинкиназа-II Апигенин 38 1,35 120 0,70 27 1,32 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 2 Протеинкиназа A, протеинкиназа G HA-1077 12 1,69 35 1,21 28 1,30 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 12 Протеинкиназа PKA, протеинкиназа G H-8 28 1,43 16 1,45 29 1,30 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 10 Циклин-зависимая киназа Оломоуцин 25 1,46 41 1,17 30 1,30 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 8 MEK MEK-ингибитор II 105 0,96 96 0,88 31 1,28 Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 4 CHK1 SB 218078 61 1,23 29 1,25 32 1,27 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 7 Тирозинкиназы Тирфостин AG 1295 90 1,07 48 1,12 33 1,24 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 7 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-1296 43 1,33 82 0,94 34 1,24 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 51 79 1,16 28 1,26 35 1,22

Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 5 cRAF ZM 336372 23 1,48 114 0,76 36 1,19 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 2 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 47 40 1,35 47 1,12 37 1,18 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 6 Flk1 SU 4312 37 1,35 65 1,01 38 1,13 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 4 IKK2 SC-514 20 1,52 64 1,01 39 1,13 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 11 GSK3 GSK-3b-ингибитор XI 132 0,62 44 1,15 40 1,13 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 6 CHK2 Chk2-ингибитор II 63 1,23 66 1,00 41 1,11 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 3 ERK ERK-ингибитор II, FR180204 55 1,27 33 1,22 42 1,11 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 10 AMPK Ингибитор AMPK, Соединение C 32 1,38 87 0,92 43 1,08 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 8 JNK JNK-ингибитор II 48 1,31 115 0,75 44 1,08 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 8 HER1-2 AG-825 106 0,96 37 1,20 45 1,06 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 10 Креатинкиназа 1/киназа анапластической лимфомы/p38 Ингибитор казеинкиназы I, D4476 100 0,99 45 1,13 46 1,05 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 11 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 23 36 1,36 13 1,47 47 1,05 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 1 Киназа Брутона Терреиновая кислота 10 1,78 15 1,46 48 1,05

Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 11 Транскрипционный фактор NF-кВ Ингибитор активации транскрипционного фактора NF-кВ 121 0,84 125 0,65 49 1,04 Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 5 CHK1 IC261 118 0,87 131 0,55 50 1,04 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 7 Протеинкиназа C GF 109203X 101 0,99 26 1,29 51 1,04 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 11 Киназа Aurora /LCK киназа /BMX тирозинкиназа/инсулиноподобный фактор роста 1R/тирозинкиназа селезенки Ингибитор III киназы Aurora 87 1,10 67 1,00 52 1,03 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 12 Киназа гликогенсинтазы-3 бета Кенпауллон 14 1,66 23 1,32 53 1,03 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 4 Транскрипционный фактор NF-кВ BAY 11-7082 123 0,83 79 0,96 54 1,03 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 4 Негативный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. Тирфостин 1 131 0,66 49 1,12 55 1,02 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 12 Негативный контроль для генистеина Даидзеин 62 1,23 19 1,41 56 1,01 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 10 Протеинкиназа C Сфингозин 72 1,20 25 1,30 57 1,00 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 8 p58 киназа PITSLRE бета 1 2-аминопурин 111 0,93 60 1,04 58 1,00 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 3 Flk1 SU1498 68 1,21 59 1,04 59 0,99 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 10 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса RG-14620 114 0,89 17 1,44 60 0,97

Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 11 TPL2 Ингибитор Tpl2-киназы 99 0,99 76 0,97 61 0,96 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 8 c-Jun-N-терминальная киназа SP 600125 31 1,38 89 0,91 62 0,95 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 11 p38 SB 202190 50 1,30 38 1,20 63 0,94 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 3 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-370 70 1,21 70 0,98 64 0,94 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 8 Киназа cRAF GW 5074 39 1,35 111 0,77 65 0,94 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 6 Фосфоинозитид-3-киназа Вортманнин 9 1,80 50 1,10 66 0,93 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 2 RhoA-активируемая киназа Ингибитор RhoA-активируемой киназы, Y-27632 122 0,83 14 1,46 67 0,93 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 2 Киназа IRAK AG-126 18 1,53 85 0,93 68 0,92 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 5 Тирозинкиназы Тирфостин AG 1288 104 0,98 34 1,22 69 0,91 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 7 MEK MEK-ингибитор I 126 0,74 102 0,85 70 0,91 Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 10 Циклин-зависимая киназа 1/2/4 SU9516 89 1,09 132 0,54 71 0,91 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 9 Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 Индирубин 115 0,88 124 0,66 72 0,91 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 4 ATM/ATR Ингибитор ATM/ATR-киназы 82 1,14 43 1,15 73 0,89 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 2 p38 Ингибитор III MAP-киназы p38 22 1,51 18 1,43 74 0,89

Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 9 Протеинкиназа A H-89, дигидрохлорид 57 1,26 24 1,31 75 0,89 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 6 Киназа гликогенсинтазы 3 GSK-3b-ингибитор I 96 1,03 75 0,97 76 0,89 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 3 p38 Ингибитор MAP-киназы p38 53 1,28 94 0,89 77 0,88 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 11 Негативный контроль для оломуцина. изооломоуцин 34 1,38 22 1,37 78 0,88 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 9 Циклин-зависимая киназа N9-изопропилоломоуцин 73 1,19 93 0,89 79 0,87 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 12 Циклин-зависимая киназа Росковитин 52 1,28 108 0,79 80 0,86 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 3 Протеинкиназа В BML-257 33 1,38 51 1.09 81 0,86 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 11 Тирозинкиназы Генистеин 27 1,44 11 1,56 82 0,85 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II HDBAd) 85 1,11 95 0,89 83 0,84 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 11 ERK ERK-ингибитор III 78 1,16 27 1,28 84 0,84 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 1 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов Тирфостин 46 66 1,22 21 1,40 85 0,84 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 2 Киназа Брутона LFM-A13 51 1,29 105 0,83 86 0,83

Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 3 Киназа гликогенсинтазы GSK-3-ингибитор XIII 17 1,56 98 0,87 87 0,82 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 7 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-494 84 1,12 63 1,03 88 0,82 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 9 Протеинкиназа C Пальмитоил-DL-карнитин Cl 92 1,06 74 0,97 89 0,82 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 5 Циклин-зависимая киназа 5/p25 BML-259 41 1,34 77 0,96 90 0,80 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 10 Киназа гликогенсинтазы-3 бета Индирубин-3'-моноксим 86 1,10 53 1,08 91 0,80 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 7 Киназа гликогенсинтазы-3 бета Ингибитор II киназы гликогенсинтазы-3 бета 109 0,94 81 0,94 92 0,77 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 6 Креатинкиназа II DRB 49 1,31 84 0,93 93 0,76 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 5 CDC2 Ингибитор Cdc2-подобной киназы, TG003 44 1,33 61 1,04 94 0,75 Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 2 MEK U-0126 75 1,17 8 1,73 95 0,74 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 10 Киназа гликогенсинтазы 3 Ингибитор X киназы гликогенсинтазы 3 136 0,44 56 1,05 96 0,71 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 1 Киназа JAK-2 AG-490 60 1,24 71 0,98 97 0,70

Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 11   Ингибитор III казеинкиназы II, TBCA 69 1,21 36 1,21 98 0,70 Ингибиторы киназ из банка EMDII H - 9   STO-609 91 1,06 126 0,62 99 0,69 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 4 Киназа JAK-3 ZM 449829 59 1,24 83 0,94 100 0,68 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 11 Тирозинкиназа селезенки Пицеатаннол 65 1,22 69 0,98 101 0,65 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 5   Алстерпауллон 103 0,98 119 0,72 102 0,64 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 6 Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-93 108 0,94 113 0,76 103 0,61 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 3 c-Jun-N-терминальная киназа Ингибитор VIII c-Jun-N-терминальной киназы 42 1,34 46 1,12 104 0,60 Ингибиторы киназ из банка EMDII D - 8 Киназа гликогенсинтазы 3 GSK-3b-ингибитор VIII 77 1,17 103 0,85 105 0,60 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 2 Фосфоинозитид-3-киназа Кверцитина дигидрат 21 1,51 128 0,59 106 0,59 Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 9 Не является ингибитором JNK JNK ингибитор, отрицательный контроль 74 1,18 72 0,98 107 0,59 Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 4   Изогранулатимид 76 1,17 99 0,86 108 0,59 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 3   Индирубин-3′-моноксим 97 1,02 118 0,72 109 0,57 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 7   Ингибитор Cdk1, CGP74514A 119 0,86 123 0,67 110 0,55

Ингибиторы киназ из банка BioMol B - 9 Киназа рецептора фактора роста эпителия Лавендустин A 98 1,01 40 1,17 111 0,54 Ингибиторы киназ из банка INH E - 5 Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-93 113 0,90 86 0,93 112 0,54 Ингибиторы киназ из банка BioMol D - 4 Киназа рецептора фактора роста нервов AG-879 102 0,99 112 0,77 113 0,53 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 1 Киназа рецептора фактора роста эпителия Эрбстатина аналог 35 1,38 109 0,77 114 0,53 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 3   Cdk4-ингибитор II, NSC 625987 64 1,23 54 1,06 115 0,51 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 5   Кенпауллон 124 0,80 106 0,82 116 0,46 Ингибиторы киназ из банка BioMol F - 10 Протеинкиназа С дельта Роттлерин 133 0,61 136 0,39 117 0,45 Ингибиторы киназ из банка EMDII B - 5 Циклин-зависимая киназа 1 Богемин 30 1,39 90 0,90 118 0,44 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 4 Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-62 125 0,80 32 1,23 119 0,44 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 7 Протеинкиназа C альфа, протеинкиназа С гамма HBDDE 88 1,09 134 0,48 120 0,43 Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 7 Киназа легких цепей миозина ML-9 134 0,61 73 0,97 121 0,40 Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 10   JNK-ингибитор V 130 0,66 101 0,85 122 0,39 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 6   SB220025 95 1,03 130 0,55 123 0,36 Ингибиторы киназ из банка EMDII A - 8   Алоизин, RP106 80 1,15 91 0,89 124 0,35 Ингибиторы киназ из банка EMDII E - 6 IKK2 IKK-2-ингибитор IV 26 1,44 116 0,74 125 0,35

Ингибиторы киназ из банка BioMol E - 6 Киназа легких цепей миозина ML-7 127 0,73 31 1,25 126 0,35 Ингибиторы киназ из банка BioMol C - 8 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов Тирфостин 9 135 0,58 135 0,40 127 0,34 Ингибиторы киназ из банка BioMol G - 5 Сигнальный путь IkB-киназа BAY 11-7082 128 0,71 127 0,60 128 0,34 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 2 Сигнальный путь протеинкиназы В Трицирибин 13 1,68 129 0,57 129 0,34 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 8 Циклин-зависимая киназа 2 Ингибитор III циклин-зависимой киназы 2 24 1,46 117 0,73 130 0,32 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 7   Пурваланол A 112 0,91 133 0,53 131 0,32 Ингибиторы киназ из банка EMDII G - 5 p38 PD 169316 45 1,32 97 0,87 132 0,31 EMDII D - 4   ERK-ингибитор II, негативный контроль 56 1,26 57 1,05 133 0,31 Ингибиторы киназ из банка EMDII F - 10   Ингибитор MNK1 81 1,15 42 1,16 134 0,31 Ингибиторы киназ из банка EMDII C - 9   Ингибитор IV циклин-зависимой киназы 2, NU6140 129 0,70 68 0,99 135 0,29 Ингибиторы киназ из банка BioMol H - 8 Мишень рапамицина в клетках млекопитающих Рапамицин 117 0,87 104 0,84 136 0,25

Таблица 4   Доза на стадии 3 Доза на стадии 4 Доза на стадии 3&4 Метаболический путь мишени ингибитор Ранжирование Коэффициент Ранжирование Коэффициент Ранжирование Коэффициент Семейство киназ Src PP2 8 1,81 2 2,50 1 2,49 Фосфоинозитид-3-киназа LY 294002 7 1,82 9 1,63 2 2,46 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-203580 3 2,23 7 1,88 3 2,34 p38 SB 203580 19 1,53 52 1,08 4 2,22 p38 SC-68376 29 1,41 121 0,69 5 2,12 Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. H-7 5 1,93 5 2,18 6 2,08 Не является ингибитором p38 SB 202474, негативный контроль для p38 митоген-активируемой протеинкиназы 116 0,88 62 1,03 7 2,02

(Циклин-зависимая киназа 1/2/5)(киназа гликогенсинтазы 3i) Алоизин A, RP107 58 1,25 55 1,06 8 1,97 RhoA-активируемая киназа гиалуронат 1077, фасудил 47 1,32 20 1,40 9 1,93 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-202190 11 1,72 58 1,05 10 1,83 Кальций\кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-62 110 0,93 107 0,81 11 1,82 RhoA-активируемая киназа Y-27632 120 0,84 1 2,67 12 1,78 Протеинкиназа A H-89 2 2,57 4 2,23 13 1,75 Киназа рецептора фактора роста эпителия Тирфостин AG 1478 15 1,62 10 1,57 14 1,74 ATM Ингибитор ATM-киназы 54 1,28 88 0,91 15 1,70 Семейство киназ Src PP1 4 2,05 12 1,48 16 1,67 Протеинкиназа A, протеинкиназа G HA-1004 6 1,82 3 2,30 17 1,63

Циклин-зависимая киназа 1/5 Ингибитор циклин-зависимой киназы 1/5 83 1,12 100 0,85 18 1,61 Циклин-зависимая киназа 28 Соединение 52 67 1,22 122 0,68 19 1,61 MEK1/2 Ингибитор MEK1/2 94 1,03 110 0,77 20 1,60 Киназа рецептора фактора роста эпителия BML-265 (аналог эрлотиниба) 16 1,58 30 1,25 21 1,59 MEK1/2 PD 98059 71 1,21 78 0,96 22 1,57 MK2a Ингибитор MK2a 107 0,95 80 0,95 23 1,54 p38 SKF-86002 46 1,32 92 0,89 24 1,49 Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. H-9 1 2,62 6 1,97 26 1,36 PKA, PKG HA-1077 12 1,69 35 1,21 28 1,30 Протеинкиназа A, протеинкиназа G H-8 28 1,43 16 1,45 29 1,30 Циклин-зависимая киназа Оломоуцин 25 1,46 41 1,17 30 1,30 Киназа cRAF ZM 336372 23 1,48 114 0,76 36 1,19

IKK2 SC-514 20 1,52 64 1,01 39 1,13 Киназа рецептора фактора роста эпителия Тирфостин 23 36 1,36 13 1,47 47 1,05 Киназа Брутона Терреиновая кислота 10 1,78 15 1,46 48 1,05 Киназа гликогенсинтазы 3 бета Кенпауллон 14 1,66 23 1,32 53 1,03 Негативный контроль для генистеина. Даидзеин 62 1,23 19 1,41 56 1,01 Киназа рецептора фактора роста эпителия RG-14620 114 0,89 17 1,44 60 0,97 Фосфоинозитид-3-киназа Вортманнин 9 1,80 50 1,10 66 0,93 RhoA-активируемая киназа Ингибитор RhoA-активируемой киназы, Y-27632 122 0,83 14 1,46 67 0,93 ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа AG-126 18 1,53 85 0,93 68 0,92

p38 Ингибитор III MAP-киназы p38 22 1,51 18 1,43 74 0,89 Тирозинкиназы Генистеин 27 1,44 11 1,56 82 0,85 Киназа рецептора фактора роста эпителия, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов Тирфостин 46 66 1,22 21 1,40 85 0,84 Киназа гликогенсинтазы Ингибитор XIII гликогенсинтазы 3 17 1,56 98 0,87 87 0,82 MEK U-0126 75 1,17 8 1,73 95 0,74 Фосфоинозитид-3-киназа Дегидратированный кверцитин 21 1,51 128 0,59 106 0,59 IKK2 IKK-2-ингибитор IV 26 1,44 116 0,74 125 0,35 Сигнальный путь протеинкиназы В Трицирибин 13 1,68 129 0,57 129 0,34 Циклин-зависимая протеинкиназа 2 Ингибитор III циклин-зависимой протеинкиназы 2 24 1,46 117 0,73 130 0,32

Таблица 5   NKX6.1 Интенсивность NGN3 Интенсивность Лунка Активность мишени Вещество Общая интенсивность ядер Коэффициент Ранжирование Коэффициент Ранжирование B - 5 Протеинкиназа А, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа С. H-9 1,00 7,36 1 2,24 1 D - 8 Протеинкиназа C Гиперицин 1,07 2,15 18 2,22 2 D - 5 PI 3-K LY 294002 1,08 6,84 2 2,18 3 D - 11 Протеинкиназа A H-89 1,09 5,39 3 2,13 4 F - 4 Семейство Src PP2 1,01 4,07 7 2,09 5 B - 3 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-203580 1,07 5,05 4 1,95 6 C - 6 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин AG 1478 1,10 2,41 14 1,89 7 F - 8 Киназа cRAF GW 5074 1,06 3,48 10 1,78 8 D - 6 Фосфоинозитид-3-киназа Вортманнин 1,10 3,87 9 1,67 9 E - 1 Протеинкиназа А, протеинкиназа G HA-1004 1,08 3,88 8 1,55 10 D - 7 Протеинкиназа C GF 109203X 1,05 4,54 6 1,53 11 C - 12 Семейство киназ Src PP1 0,99 1,90 22 1,43 12 F - 3 p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-202190 1,08 1,90 23 1,40 13 G - 11 RhoA-активируемая киназа Y-27632 1,08 1,31 40 1,40 14

G - 12 Киназа гликогенсинтазы-3 бета Кенпауллон 0,99 3,18 11 1,32 15 C - 9 Киназа инсулинового рецептора Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора 1,01 2,31 15 1,32 16 B - 4 Протеинкиназа A, протеинкиназа G, киназа легких цепей миозина и протеинкиназа C. H-7 1,02 1,99 21 1,26 17 B - 7 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-494 1,10 1,57 30 1,26 18 C - 7 Тирозинкиназы Тирфостин AG 1295 1,08 1,43 36 1,26 19 H - 7 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса BML-265 (аналог эрлотиниба) 1,06 2,15 17 1,25 20 B - 12 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 25 1,02 4,68 5 1,24 21 E - 2 Протеинкиназа A, протеинкиназа G HA-1077 1,02 1,46 34 1,20 22 F - 7 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-1296 1,09 1,74 25 1,18 23 E - 9 Циклин-зависимая киназа N9-изопропилоломоуцин 1,05 1,42 37 1,18 24 B - 11 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 23 1,03 1,43 35 1,17 25

D - 12 Протеинкиназа А, протеинкиназа G H-8 0,99 1,21 45 1,16 26 C - 5 Тирозинкиназы Тирфостин AG 1288 1,04 1,63 27 1,15 27 E - 11 Негативный контроль для оломуцина. изооломоуцин 1,04 1,51 31 1,14 28 F - 6 Flk1 SU 4312 1,07 1,01 55 1,12 29 C - 11 Тирозинкиназа селезенки Пицеатаннол 1,07 1,32 39 1,10 30 G - 8 c-Jun-N-терминальная киназа SP 600125 1,04 1,67 26 1,09 31 H - 11   ДМСО 1,03 1,04 53 1,09 32 E - 5 Кальций/ кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-93 1,04 1,10 51 1,03 33 E - 12 Циклин-зависимая киназа Росковитин 1,03 0,67 75 1,03 34 F - 11 Тирозинкиназы Генистеин 1,03 1,10 52 1,02 35 B - 8 HER1-2 AG-825 1,05 1,12 50 1,00 36 B - 10 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса RG-14620 1,02 1,26 41 1,00 37 F - 9 Протеинкиназа C Пальмитоил-DL-карнитин Cl 1,05 1,19 47 0,99 38 E - 10 Циклин-зависимая протеинкиназа Оломоуцин 1,04 1,22 44 0,99 39 D - 10 Протеинкиназа C Сфингозин 1,04 1,62 28 0,99 40 G - 6 Креатинкиназа II DRB 1,01 1,50 32 0,98 41 C - 3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 51 1,04 1,46 33 0,97 42 F - 2 Киназа Брутона LFM-A13 0,97 1,82 24 0,96 43 E - 8 Киназа p58 PITSLRE бета 1 2-аминопурин 1,07 0,93 61 0,93 44 B - 9 Киназа рецептора фактора Лавендустин A 1,02 0,98 57 0,92 45

  роста эпидермиса             G - 7 Протеинкиназа C альфа, Протеинкиназа C гамма Селективный ингибитор протеинкиназы С 1,07 0,92 63 0,91 46 D - 2 ИЛ1-ассоцированная цитоплазматическая киназа AG-126 0,99 1,21 46 0,86 47 H - 12   ДМСО 1,02 0,75 69 0,86 48 H - 6 Креатинкиназа-II Апигенин 1,05 0,77 68 0,84 49 F - 5 Киназа cRAF ZM 336372 1,06 1,36 38 0,83 50 F - 12 Негативный контроль для генистеина. Даидзеин 1,03 0,92 62 0,83 51 C - 1 Киназа рецептора фактора роста эпимермиса, киназа рецептора фактора роста тромбоцитов Тирфостин 46 1,05 2,54 13 0,82 52 H - 9   ДМСО 1,03 0,95 60 0,81 53 B - 1 MEK PD-98059 0,92 2,02 20 0,81 54 H - 1 Киназа Брутона Терреиновая кислота 1,02 1,24 42 0,81 55 H - 5 Циклин-зависимая киназа 5/p25 BML-259 1,04 0,83 67 0,80 56 C - 2 Киназа рецептора фактора роста эпимермиса Тирфостин 47 1,00 1,13 49 0,79 57 H - 2 Сигнальный путь протеинкиназы В Трицирибин 0,73 2,06 19 0,78 58 D - 3 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов AG-370 1,01 1,15 48 0,77 59

G - 10 Киназа гликогенсинтазы-3 бета Индирубин-3'-моноксим 0,96 0,92 64 0,74 60 C - 4 Негативный контроль для ингибиторов тирозинкиназы. Тирфостин 1 1,00 0,95 59 0,73 61 G - 4 Киназа JAK-3 ZM 449829 1,01 1,23 43 0,73 62 D - 1 Киназа JAK-2 AG-490 1,04 2,26 16 0,72 63 D - 4 Киназа рецептора фактора роста нервов AG-879 1,03 0,39 80 0,72 64 G - 2 Фосфоинозитид-3-киназа Кверцитина дигидрат 0,97 1,03 54 0,71 65 G - 5 Сигнальный путь IkB-киназы BAY 11-7082 0,93 1,00 56 0,68 66 H - 10   ДМСО 0,99 0,88 65 0,67 67 G - 9 Киназа гликогенсинтазы-3 бета, циклин-зависимая киназа 5 Индирубин 1,01 0,59 77 0,66 68 E - 6 Киназа легких цепей миозина ML-7 0,98 2,84 12 0,65 69 B - 2 MEK U-0126 0,87 0,68 73 0,65 70 G - 3 Flk1 SU1498 1,01 0,70 72 0,65 71 E - 3 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса, кальций/
кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II HDBA 0,99 0,88 66 0,64 72 H - 4 IkB-киназа 2 SC-514 0,95 0,71 71 0,62 73 E - 7 Киназа легких цепей миозина ML-9 1,06 1,60 29 0,59 74 F - 10 Протеинкиназа C дельта Роттлерин 0,24 0,96 58 0,56 75 E - 4 Кальций/кальмодуллин-зависимая протеинкиназа II KN-62 0,96 0,71 70 0,56 76 H - 3 Протеинкиназа В BML-257 0,98 0,68 74 0,55 77

H - 8 Мишень рапамицина в клетках млекопитающих Рапамицин 0,47 0,65 76 0,39 78 C - 10 Ингибитор протеинкиназы C PKC-412 (протеинкиназа С) 0,17 0,45 79 0,39 79 G - 1 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Эрбстатина аналог 0,82 0,38 81 0,34 80 D - 9 Протеинкиназа C Ro 31-8220 0,09 0,48 78 0,30 81 B - 6 Неспецифично Стауроспорин 0,13 0,17 83 0,30 82 C - 8 Киназа рецептора фактора роста тромбоцитов Тирфостин 9 0,28 0,29 82 0,29 83 F - 1 Внеклеточно регулируемая киназа 2, аденозин-киназа, креатинкиназа 1, креатинкиназа 2, 5-йодотуберцидин 0,08 0,13 84 0,27 84

Таблица 6 Ранжирование NKX6.1 Ранжирование NGN3 Ранжирование 1 H-9 H-9 2 LY 294002 Гиперицин 3 H-89 LY 294002 4 SB-203580 H-89 5 Тирфостин 25 PP2 6 GF 109203X SB-203580 7 PP2 Тирфостин AG 1478 8 HA-1004 GW 5074 9 Вортманнин Вортманнин 10 GW 5074 HA-1004 11 Кенпауллон GF 109203X 12 ML-7 PP1 13 Тирфостин 46 SB-202190 14 Тирфостин AG 1478 Y-27632 15 Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA) Кенпауллон 16 AG-490 Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA)

Таблица 7 Сигнальный путь Соединения Протеинкиназа C/ протеинкиназа A/ протеинкиназа G H-9, гиперицин, H-89, GF 109203X, HA-1004 Киназы Src PP2, PP1 Фосфоинозитид-3-киназа LY 294002, Вортманнин p38 митоген-активируемая протеинкиназа SB-203580, SB-202190 Киназа рецептора фактора роста эпидермиса Тирфостин 25, тирфостин AG1478, тирфостин 46 Киназа cRAF GW 5074 Киназа гликогенсинтазы 3 бета Кенпауллон Киназа инсулиноавого рецептора Ингибитор тирозинкиназы инсулинового рецептора (HNMPA) Киназа JAK2 AG490 RhoA-активируемая киназа Y27632 Киназа легких цепей миозина ML-7

Таблица 8   Общая сегментация ядер NKX6.1 NGN3 Планшет Обработка [концентрация] Коэффициент Коэффициент количества клеток Коэффициент интенсивности Коэффициент количества клеток Коэффициент интенсивности Планшет 1 PD-98059 [2,5 мкмоль] 0,96 2,08 2,37 2,21 2,41 Планшет 1 SB-203580 [2,5 мкмоль] 1,05 2,93 2,58 5,26 4,74 Планшет 1 H-7 [2,5 мкмоль] 1,09 2,02 1,88 2,75 2,44 Планшет 1 H-9 [2,5 мкмоль] 1,13 1,93 1,76 2,85 2,47 Планшет 1 AG-490 [2,5 мкмоль] 0,99 3,78 4,20 2,48 2,35 Планшет 1 LY 294002 [2,5 мкмоль] 1,03 6,54 6,60 4,93 4,43 Планшет 1 GF109203X [2,5 мкмоль] 0,82 5,20 3,57 4,17 3,33 Планшет 1 H-89 [2,5 мкмоль] 1,08 2,41 2,30 4,00 3,74 Планшет 1 KN-62 [1мкмоль] 1,02 0,69 0,61 0,81 0,77 Планшет 1 KN-93 [1 мкмоль] 1,05 0,59 0,55 0,84 0,79

Планшет 1 Контрольная группа 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Планшет 2 HA-1004 [2,5 мкмоль] 1,08 2,83 2,66 2,77 2,49 Планшет 2 HA-1077[2,5 мкмоль] 1,07 1,48 1,31 2,57 2,27 Планшет 2 SB-202190 [2,5 мкмоль] 1,08 2,12 1,90 4,53 3,91 Планшет 2 PP2 [2,5 мкмоль] 1,04 2,06 1,71 6,21 6,12 Планшет 2 GW 5074 [2,5 мкмоль] 1,11 2,77 2,32 3,15 2,79 Планшет 2 Кенпаулон [2,5 мкмоль] 1,02 0,53 0,45 1,52 1,40 Планшет 2 BML-259 [2,5 мкмоль] 0,99 1,08 1,02 1,21 1,23 Планшет 2 BML-265 [2,5 мкмоль] 0,97 6,12 6,34 4,50 4,65 Планшет 2 KN-62 [1 мкмоль] 1,03 0,71 0,67 0,72 0,71 Планшет 2 KN-93 [1 мкмоль] 1,04 0,75 0,76 0,93 0,93 Планшет 2 Контрольная группа 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Публикации, цитируемые в настоящем документе, в силу ссылки на них полностью включаются в настоящий документ. Хотя различные аспекты изобретения иллюстрируются выше ссылками на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что область изобретения ограничивается не упомянутым выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Изобретение относится к области генетической инженерии, молекулярной биологии и медицины. Предложен способ увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы. Культивируют выделенные плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки человека, полученные из стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека (линия H1, Н7 или Н9). Дифференцировку выделенных плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки линии дефинитивной эндодермы проводят путем обработки средой с добавлением агониста рецептора TGF-β. Дифференцировку клеток линии дефинитивной эндодермы в клетки линии панкреотической эндодермы проводят путем культивирования в среде с добавлением соединения, выбранного из группы: Н-9, Н-89, GF 109203Х, НА-1004, РР2, РР1, SB-203580, SB-202190, Тирфостина 25, Тирфостина AG1478, Тирфостина 46, GW 5074, гидроксил-2-нафталенилметилфосфоновой кислоты, AG490, Y-27632 и ML-7. Дифференцировку клеток линии панкреатической эндодермы в клетки эндокринной линии поджелудочной железы проводят путем культивирования с Noggin. Способ увеличивает экспрессию NGN3 и NKX6.1 по сравнению с клетками, которые не обработаны указанным соединением. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

1. Способ увеличения экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии поджелудочной железы, включающий следующие стадии:
a) культивирования выделенных плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека, полученных из стабильных линий H1, Н7 или Н9 эмбриональных стволовых клеток человека,
b) дифференцировки выделенных плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки линии дефинитивной эндодермы путем обработки выделенных плюрипотентных стволовых клеток человека средой с добавлением агониста рецептора TGF-β,
c) дифференцировки клеток линии дефинитивной эндодермы в клетки линии панкреатической эндодермы путем культивирования клеток линии дефинитивной эндодермы в среде с добавлением соединения, выбранного из группы, которая состоит из Н-9, Н-89, GF 109203Х, НА-1004, РР2, РР1, SB-203580, SB-202190, Тирфостина 25, Тирфостина AG1478, Тирфостина 46, GW 5074, гидроксил-2-нафталенилметилфосфоновой кислоты, AG490, Y-27632 и ML-7, и
d) дифференцировки клеток линии панкреатической эндодермы в клетки эндокринной линии поджелудочной железы путем культивирования клеток линии панкреатической эндодермы с Noggin, где указанный способ увеличивает экспрессию NGN3 и NKX6.1 по сравнению с клетками, которые не обработаны указанным соединением.

2. Способ по п. 1, где к среде, используемой для дифференцировки линии панкреатической эндодермы, добавляют соединение, выбираемое из группы, которая состоит из Н-9, Н-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, SB-203580, SB-202190, Тирфостина 25, Тирфостина AG1478, Тирфостина 46 и GW 5074.