НОВОЕ ЛЕЧЕНИЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА ( РС ) Российский патент 2016 года по МПК A61K31/192 A61P25/00 A61P37/00 

Настоящее изобретение относится к применению R-энантиомера соединения согласно следующей формуле (I)

где каждый из R₁ или R₂ представляют собой группу, выбранную из H, -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ и -CH₂CH₂CH₂CH₃, или взятые вместе друг с другом могут образовывать циклопропиловое кольцо, циклобутиловое кольцо, циклопентиловое кольцо или циклогексиловое кольцо, R₃ представляет собой группу, выбранную из -COOH, -COOR₆, -CONH₂, -CONHR₆, -CONR₆R₇, -CONHSO₂R₆, -COO-(CH₂)₃-CH₂OH, -COO-(CH₂)₄-ONO₂, -COO-PhOCH₃-C₂H₂-COO-(CH₂)₄-ONO₂, тетразолила и -COOH биоизостера, R₄ или R₅ представляет собой группу, выбранную из -Cl, -F, -Br, -I, -CF₃, -OCF₃, -SCF₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -CN, -CH=CH₂, -CH₂OH и -NO₂, R₆ или R₇ представляют собой группу, выбранную из -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ и -CH₂CH₂CH₂CH₃, и m или n представляют собой целые числа, выбранные из 0, 1, 2 и 3, или нитропроизводное указанного соединения и фармацевтически приемлемые соли указанного соединения, предпочтительно таренфлурбил (R-флурбипрофен) для применения при лечении рассеянного склероза (РС).

РС является хроническим воспалительным демиелинизирующим заболеванием, поражающим центральную нервную систему (ЦНС). Наиболее распространенной начальной стадией заболевания является ремиттирующий подтип, характеризующийся непредсказуемыми приступами (рецидивами) с последующими периодами относительной ремиссии без новых признаков активности заболевания.

Различные виды терапии применяют для пациентов, испытывающих острые приступы, для пациентов с ремиттирующим подтипом, для пациентов с прогрессирующими подтипами и для лечения различных последствий РС. Основной целью терапии является возвращение функции после приступа, предупреждение новых приступов и предотвращение инвалидности.

Следующие виды терапии могут быть применены в случае рассеянного склероза: интерферон бета 1a и 1b, Глатирамер, митоксантрон, Натализумаб (моноклональные антитела против интегрина альфа4бета1) и глюкокортикоиды для лечения острых приступов. FTY-720 (Финголимод, аналог сфингозин-1-фосфата, недавно одобренный для медицинского применения), кладрибин (иммуносупрессор), Терифлуномид (иммуносупрессор) и Фампридин (4-аминопиридин, блокатор калиевых каналов) находятся на стадии клинического исследования. Кроме того, эффективность ингибиторов HMG-CoA редуктазы и конкретных каннабиноидов изучали экспериментально.

Несмотря на множество многообещающих результатов исследований, проведенных с лекарственным средством Финголимодом, и регистрацию Натализумаба для лечения ремиттирующего РС эффективного средства для лечения РС до сих пор нет, в лучшем случае наблюдается снижение частоты приступов и, таким образом, отсрочка неврологического дефицита.

Для случаев первичного прогрессирующего РС пока не известно никакого эффективного лечения. Кроме того, все доступные виды терапии, основанные на лекарственных средствах (бета-интерферон, Глатирамер, митоксантрон, Натализумаб) обладают существенной токсичностью.

Таренфлурбил (R-флурбипрофен) (химическое название (R)-2-(2-фтор-4-фенилфенил)пропионовая кислота) тестировали в 2008 как потенциального кандидата для лечения болезни Альцгеймера. Тем не менее, дальнейшее развитие этого исследования было остановлено после того, как было обнаружено недостаточное улучшение когнитивных функций.

R-флурбипрофен вместе, например, с Ибупрофеном и Напроксеном, принадлежит к группе 2-арилпропионовых кислот (профены). Точно так же, как Ибупрофен, R-флурбипрофен является побочным продуктом коммерческого рацемического флурбипрофена, активным компонентом которого, как считают, является S-энантиомер. Флурбипрофен в настоящее время находится в стадии клинических испытаний для лечения метастатического рака простаты.

Cardozo с соавт. (в Cardozo L.D., Stanton S.L., Robinson H., Hole D. Evaluation of flurbiprofen in detrusor instability. Br Med J. 1980 Feb 2; 280 (6210): 281-2) описывают двойное слепое, перекрестное испытание ингибитора синтетазы простагландина, флурбипрофена, и плацебо в случае женщин с нестабильностью детрузора (27 случаев идиопатического происхождения и три случая при вторично-прогрессирующем рассеянном склерозе). Частота, неотложность и императивное недержание, все были значительно снижены флурбипрофеном (P менее 0,001, P менее 0,025 и P менее 0,025 соответственно), также повышено давление детрузора во время заполнения мочевого пузыря (P менее 0,01). Побочные эффекты, однако, наблюдались у 13 пациентов при приеме флурбипрофена по сравнению с пятью при приеме плацебо (P менее 0,025). После испытания 19 пациентов выявили желание продолжать прием флурбипрофена. Флурбипрофен является полезным для лечения идиопатической нестабильности детрузора и хорошо переносится большинством пациентов.

В US 2009-0162421 описано применение таренфлурбила и/или его фармацевтически приемлемой соли или производного в энантиомерно чистой форме для получения лекарственного средства для лечения невропатии, связанной с болью. В отличие от US 2009-0162421 настоящее изобретение относится к применению R-флурбипрофена для лечения нейроиммунологической патологии - рассеянного склероза и, таким образом, для предупреждения или прогрессирования потери моторных функций и нейродегенерации, которая происходит в результате иммунно-обусловленной демиелинизации. Предупреждение демиелинизации, которая происходит в результате аутоиммунной атаки миелинизирующих клеток в центральной нервной системе, может быть связана с сокращением других неврологических симптомов, связанных с РС, которые могут включать гиперчувствительность ноцицептивной системы с нейропатическими болеподобными явлениями центрального происхождения. Однако нейропатическая боль, вызываемая повреждением нерва (травматическим, воспалительным, метаболическим, ишемическим, токсическим и т.д.) и описанная в US 2009-0162421, прежде всего является результатом повышенной возбудимости травмированных или вторичных ноцицептивных нейронов. Некоторые формы связаны с активацией микроглии в моделях на грызунах, которая, однако, сильно отличается от генерализованной и распространенной иммунной активации при рассеянном склерозе как с точки зрения механизмов, так и с точки зрения локализации.

Кроме того, нейропатическая боль не является аутоиммунным заболеванием, а действие и применение R-флурбипрофена, описанного в US 2009-0162421 для лечения нейропатической боли, опосредовано через различные механизмы по сравнению с описанными здесь иммуномодулирующими свойствами. Уменьшение нейропатической боли посредством R-флурбипрофена, главным образом, является результатом предупреждения недостаточно адаптируемых нейронных изменений, встречающихся после аксонального повреждения, тогда как его действие при рассеянном склерозе, главным образом, является результатом иммуномодулирующего действия на Т-клетки, предотвращающего, таким образом, аутоиммунно-опосредованную деструкцию оболочек миелина нейронов, т.е. деструкцию олигодендроцитов и клеток Шванна. Если такая деструкция миелина происходит в таламокортикальном тракте, т.е. восходящем болевом пути, это может вызывать симптомы центральной нейропатической боли при РС. Это значит, что вторично R-флурбипрофен может уменьшать эту форму нейропатической боли или ее прогрессию у пациентов, страдающих РС. Суммируя вышесказанное, действие R-флурбипрофена на нейропатическую боль (например, главным образом, вызываемую травмой, герпетической инфекцией, диабетами или ишемией), однако, не позволяет прогнозировать его иммуномодулирующее действие и описанное здесь предупреждение иммунно-опосредованной деструкции миелина и потери моторной функции при РС.

Следовательно, настоящее изобретение основано на новом применении R-флурбипрофена для иммунной модуляции и сохранения моторной функции при рассеянном склерозе, которое является аутоиммунным заболеванием нервной системы, при этом относится к применению R-флурбипрофена для предупреждения или снятия ноцицептивной повышенной возбудимости нейронов, вызываемой наиболее часто травмой периферического нерва, воспалением, метаболическими дисфункциями или ишемией.

Barkhof с соавт. (в Barkhof F., van Waesberghe J.H., Uitdehaag B.M., Polman C.H. Ibuprofen does not suppress active multiple sclerosis lesions on gadolinium-enhanced MR images. Ann Neurol. 1997 Dec; 42(6):982) исследовали действие Ибупрофена на количество и размер поражений РС в MRT. Авторы описывают, что действие совместно вводимых бета-интерферонов существенно не зависит от совместного лечения.

Ввиду вышеизложенного существует настоятельная необходимость разработки нового и эффективного лечения РС, в частности первичного прогрессирующего РС.

В первом аспекте настоящего изобретения указанная задача решается посредством R-энантиомерного соединения согласно следующей формуле (I)

где каждый из R₁ или R₂ представляет собой группу, выбранную из H, -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ и -CH₂CH₂CH₂CH₃, или взятые вместе друг с другом могут образовывать циклопропиловое кольцо, циклобутиловое кольцо, циклопентиловое кольцо или циклогексиловое кольцо, R₃ представляет собой группу, выбранную из -COOH, -COOR₆, -CONH₂, -CONHR₆, -CONR₆R₇, -CONHSO₂R₆, -COO-(CH₂)₃-CH₂OH, -COO-(CH₂)₄-ONO₂, -COO-PhOCH₃-C₂H₂-COO-(CH₂)₄-ONO₂, тетразолила и -COOH биоизостера, R₄ или R₅ представляет собой группу, выбранную из -Cl, -F, -Br, -I, -CF₃, -OCF₃, -SCF₃, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -CN, -CH=CH₂, -CH₂OH и -NO₂, R₆ или R₇ представляют собой группу, выбранную из -CH₃, -CH₂CH₃, -CH₂CH₂CH₃ и -CH₂CH₂CH₂CH₃, и m или n представляют собой целые числа, выбранные из 0, 1, 2 и 3, или нитропроизводное указанного соединения, такого как сложный 4-нитрооксибутиловый эфир (R)-2-(2-фторбифенил-4-ил)пропионовой кислоты и фармацевтически приемлемых солей указанного соединения для применения при лечении рассеянного склероза (РС).

Предпочтительно R₁ выбран из H. Далее, предпочтительно применение соединения согласно настоящему изобретению, выбранного из группы, состоящей из следующих соединений:

(R)-2-(2-фтор-4-фенилфенил)пропионовая кислота,

сложный 4-нитрооксибутиловый эфир (R)-2-(2-фторбифенил-4-ил)пропионовой кислоты,

сложный 2-фтор-α-метил-4-гидроксибутиловый эфир (R)-1,1'-бифенил)-4-уксусной кислоты,

сложный 4-нитрооксибутиловый эфир (R)-3-[4-(2-фтор-α-метил-[1,1'-бифенил]-4-ацетилокси)-3-метоксифенил]-2-пропеновой кислоты,

(R)-2-метил-2(2-фтор-4'-трифторметилбифен-4-ил)пропионовая кислота,

(R)-2-метил-2(2-фтор-4'-циклогексилбифен-4-ил)пропионовая кислота,

амид (R)-2-(2-фтор-3',5'-бис(хлор)бифен-4-ил)пропионовой кислоты,

(R)-2-(2-фтор-4'-трифторметилбифен-4-ил)пропионовая кислота,

(R)-2-(2-фтор-3'-трифторметилбифен-4-ил)пропионовая кислота,

(R)-2-(2-фтор-3',5'-бис(трифторметил)бифен-4-ил)пропионовая кислота,

(R)-2-(4'-циклогексил-2-фторбифен-4-ил)пропионовая кислота,

(R)-2-(2-фтор-1,1'-бифенил-4-ил)-2-метилпропановая кислота

и (R)-5-[1-(2-фторбифенил-4-ил)-1-метилэтил]-2H-тетразол.

Дополнительно предпочтительным для применения при лечении рассеянного склероза (РС) является R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен. Еще более предпочтительным является применение соединения, как описано выше, предпочтительно R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, для получения лекарственного средства для лечения рассеянного склероза (РС). Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения рассеянного склероза (РС), включающему введение нуждающемуся пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена. Основной целью терапии согласно настоящему изобретению является возвращение функции после приступа, предотвращение новых приступов и предотвращение инвалидности. Таким образом, лечение по настоящему изобретению предпочтительно относится к лечению, отличающемуся от лечения невропатии, связанной с болью, т.е. предпочтительно не включает лечение невропатии, связанной с болью.

В контексте настоящего изобретения лечение должно включать как профилактическое, так и/или фактическое лечение симптомов заболевания РС, как описано в настоящем описании, которые могут быть облегчены и/или даже полностью сняты с применением указанного лечения.

Настоящее изобретение основано на том, что неожиданно было обнаружено, что R-энантиомер профенового соединения, а именно R-флурбипрофен, снижает/ингибирует появление параличей в модели ЭАЭ рассеянного склероза у мышей (ЭАЭ: экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит) и почти полностью блокирует MOG-индуцированную активацию микроглии и инфильтрацию иммунных клеток в люмбальном отделе спинного мозга. Таким образом, вследствие схожести между ситуацией у человека и мышиной моделью у пациента-человека ожидается по меньшей мере схожий эффект от таренфлурбила (R-флурбипрофена).

В отличие от S-изомера R-флурбипрофен не ингибирует циклооксигеназы и никак не влияет на синтез простагландина. Даже при высокой суточной дозировке и продолжительной терапии какая-либо существенная токсичность не замечена. Другой аспект настоящего изобретения, таким образом, относится к способу лечения рассеянного склероза (РС), не содержащему ингибирование циклооксигеназ и не влияющему на синтез простагландина, включающему введение нуждающемуся в нем пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена. Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к улучшенному путем предотвращения и/или снижения токсичности, присутствующей в указанном лечении в результате ингибирования циклооксигеназ, способу лечения рассеянного склероза (РС), включающему введение нуждающемуся в нем пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена.

R-флурбипрофен тестировали в качестве потенциальной терапии при болезни Альцгеймера, но, в итоге, он не продемонстрировал значительного эффекта. Кроме того, Barkhof с соавт. (см. выше) исключил индивидуальный эффект Ибупрофена на РС, и, таким образом, специалист ожидал бы, что флурбипрофен или такое соединение, как показано вышеуказанной формулой (I), также будут неэффективны при РС.

Предпочтительно подлежащий лечению РС является ремиттирующим или прогрессирующим РС.

Даже при высокой суточной дозировке и долговременной терапии не было замечено какой-либо токсичности R-флурбипрофена. Таким образом, в целом, может быть применена любая дозировка соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, которая демонстрирует благоприятное действие на симптомы РС, подлежащего лечению. Соответствующие эффективные дозировки могут быть легко определены специалистом и/или лечащим врачом. Предпочтительным является применение соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, согласно настоящему изобретению, где указанное соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, используется в количестве от 50 мг до 3000 мг, предпочтительно от 100 мг до 1500 мг, более предпочтительно от 300 мг до 1200 мг, в расчете на лекарственную форму. Дополнительно предпочтительным является применение, в котором указанное соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, предоставлены в дозировке от 5 мг/кг массы тела до 15 мг/кг массы тела проходящего лечение пациента в сутки.

В целом, соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, может быть введено пациенту любым подходящим и эффективным способом, таким как пероральный, ректальный или путем инъекции. Предпочтительно перорально. Кроме того, соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, может быть введено пациенту в любой подходящей и эффективной фармацевтически приемлемой форме, в такой форме, как таблетки, капсулы, драже, порошок, свечи, гель и/или раствор для инъекции.

Соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, может быть применено как самостоятельно, так и в комбинации с другими соединениями и видами лечения, доступными для терапии и/или лечения РС. Предпочтительно осуществляется действие на неврологическую симптоматику. Комбинация включает одновременное или раздельное применение соединений и лечений. Комбинация также включает любой синергический эффект соединений и видов лечения, которые доступны для терапии и/или лечения РС. Поэтому другим аспектом настоящего изобретения является применение соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, где указанное соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, предоставлено в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством против РС, таким как, например, интерферон бета 1a или 1b, Глатирамер, митоксантрон, Натализумаб, глюкокортикоид, Финголимод, кладрибин, Терифлуномид, Фампридин, ингибитор HMG-CoA редуктазы или каннабиноид. Предпочтительными являются интерферон бета 1a или 1b.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения и, в частности, уменьшению симптомов рассеянного склероза (РС), предпочтительно неврологического дефицита, включающему введение нуждающемуся в нем пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, как описано в настоящем описании.

Еще один другой аспект настоящего изобретения относится к способу снижения частоты, встречаемости и/или тяжести приступов при рассеянном склерозе, таком как ремиттирующий РС, включающему введение нуждающемуся в нем пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, как описано в настоящем описании.

В модели ЭАЭ рассеянного склероза у мышей, которых лечили R-флурбипрофеном (9 мг/сутки в питьевой воде), не проявился паралич, тогда как в то же самое время у контрольной группы животных, которым давали плацебо, развивался пара- и тетрапарез, и их пришлось умерщвлять в соответствии с критериями завершения. У животных, которых лечили R-флурбипрофеном, не обнаруживали почти никакой активации микроглии или инфильтрации Т-клетками белого вещества в дистальном отделе спинного мозга, т.е. в главной локализации патологических иммунологических проявлений ЭАЭ. Деструкция оболочек миелина, опосредованная Т-клетками, и прямое повреждение аксонов являются причинами неврологического дефицита.

Биологические механизмы действия R-флурбипрофена при ЭАЭ известны только частично. R-флурбипрофен приводит к комплексной модуляции сигнальных молекул липидной природы и модуляции факторов транскрипции (таких как, например, NF-kappaB и PPAR) и поэтому к иммуномодуляции и изменению нейроиммунологической коммуникации. Таким образом, умеренное модулирующее действие обусловливает благоприятное действие/профиль токсичности соединения.

Как указано выше, при помощи доступных в настоящее время лекарственных средств не может быть осуществлено лечение РС, возможно только снижение количества приступов и замедление прогрессирования заболевания. В некоторых случаях для первично-прогрессирующего (неремиттирующего) РС не существует никакой эффективной терапии. Заболевание приводит к нарастающему параличу и, в итоге, к летальному исходу. Кроме того, пациенты страдают от боли из-за спастичности мышц и нейроиммунологического повреждения болепроводящих нейронов или центров.

Главным преимуществом соединения согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофена или нитро-R-флурбипрофена, является его низкая токсичность, которая по существу доказана для R-флурбипрофена. Даже при долговременной терапии у пожилых пациентов не обнаруживали никаких значительных побочных действий. Обычно умеренные побочные действия не приводят к завершению терапии.

Уменьшение неврологических симптомов и нейроиммунологической патологии, наблюдавшихся у животных, которых лечили R-флурбипрофеном, было существенным. Поэтому предполагается, что соединение согласно настоящему изобретению и, предпочтительно, R-флурбипрофен или нитро-R-флурбипрофен, будут также уменьшать симптомы у пациентов, страдающих РС.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано на следующих примерах со ссылкой на сопровождающие чертежи, но без ограничения ими. В целях настоящего изобретения все процитированные в настоящем описании ссылки включены полностью посредством ссылки.

Описание фигур

На фиг.1 показано действие R-флурбипрофена (9 мг/кг/сутки перорально) в модели ЭАЭ рассеянного склероза у C57BL6/J мышей. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) вызывали подкожной инъекцией 100 мкг MOG35-55 в 200 мкл CFA с последующей интраперитонеальной инъекцией 200 нг коклюшного токсина (PTX). PTX-инъекцию повторяли спустя 2 дня. R-флурбипрофен применяли перорально с питьевой водой (225 мкг/4 мл в сутки) (n=6). Контрольная группа получала плацебо (n=9). Ноцицептивное поведение изучали исключительно перед проявлением моторных дисфункций. Измеряли механическую гипералгезию, термическую гипералгезию (верхняя, левая ось Y) и холодовую аллодинию (основание). Гипералгезия является ранним проявлением нейроиммунологической активации. Моторную функцию регистрировали на основе стандартной оценочной системы: оценка 0,5: дистальный парез хвоста; оценка 1: полный паралич хвоста; оценка 1,5: парез хвоста и умеренный парез задних конечностей; оценка 2,0: тяжелый парез одной задней конечности; оценка 2,5: средний парапарез задних конечностей; оценка 3,0: полный паралич обеих задних конечностей; оценка 3,5: полный паралич обеих задних конечностей и парез одной передней конечности; оценка 4: полный паралич (тетраплегия), агония или смерть. Животных умерщвляли начиная с оценки 3,5. Все тесты проводились наблюдателем, не информированным о лечении. R-флурбипрофен снижал гипералгезию, которая была заметна вначале, и полностью останавливал развитие моторных дисфункций (P<0,05). Животные, которых лечили R-флурбипрофеном, не проявляли признаков демиелинизации в течение периода наблюдения. В группе, принимавшей плацебо, все животные получили оценки от 2,5 до 3,5.

На фиг.2 показана микроглиальная активация в спинном мозге (поясничный отдел) спустя 3 недели после MOG35-55 инъекции C57BL/6 мышам, которых лечили R-флурбипрофеном (9 мг/кг/сутки перорально) или давали плацебо. Для гистологической экспертизы мышам внутрисердечно вливали 4%-й параформальдегид; получали ткань, затем фиксировали в ПФА и сохраняли в 20%-й сахарозе для защиты от криоартефактов. Ткань помещали в OCT и делали срезы на замораживающем микротоме (16 мкм). Иммунное окрашивание проводили с помощью первичных антител, специфичных к маркеру микроглии Iba-1. Нейроны обнаруживали посредством anti-NeuN. После окрашивания вторичными антителами, меченными флуорохромом, делали снимки при помощи флуоресцентного микроскопа от Zeiss. У животных, которых лечили R-флурбипрофеном, не обнаруживали никакой активации микроглиальных клеток. Таким образом, в спинном мозге не обнаруживали никаких патологических изменений, и он не отличался от спинного мозга здоровых контрольных животных. Напротив, у животных с ЭАЭ, которым давали плацебо, наблюдали массивную активацию и пролиферацию микроглии.

На фиг.3 показана инфильтрация Т-клеток в задний рог поясничного отдела спинного мозга спустя 3 недели после инъекции MOG35-55 при лечении R-флурбипрофеном (9 мг/кг/сутки перорально) (фиг.3A) или плацебо (фиг.3B). Препарирование проводили так, как описано выше. Т-клетки обнаруживали с применением антител anti-CD3. Инфильтрация Т-клеток в область белого вещества в переднем роге и заднем роге почти полностью подавлялась при лечении R-флурбипрофеном.

На фиг.4 показана динамика клинических показателей в модели ЭАЭ рассеянного склероза в зависимости от времени начала лечения R-флурбипрофеном. ЭАЭ вызывали инъекцией пептида MOG35-55 и коклюшного токсина у C57BL6 мышей. Введение лекарственной среды или R-флурбипрофена (9 мг/кг/сутки перорально) начинали в сутки иммунизации (сутки 1) или спустя 5 или 8 суток после иммунизации посредством MOG. Клинические оценки ЭАЭ определяли так, как описано на фиг.1. У животных, которых лечили R-флурбипрофеном, не развивался ЭАЭ, если терапию начинали в сутки 1, и значительно снижались оценки ЭАЭ, если лечение начинали спустя 5 или 8 суток после инъекции MOG. Площади под кривыми зависимости оценок от времени анализировали при помощи статистического t-теста при P<0,05.

На фиг.5 показана визуализация нейровоспаления в модели ЭАЭ рассеянного склероза. Визуализацию в ближнем инфракрасном диапазоне (Maestro-Imaging Platform) получали спустя 3 суток после инъекции ProSense 680 в/в C57BL6 мышам, которым вводили лекарственную среду или R-флурбипрофен (9 мг/кг/сутки перорально) начиная с 3 суток после индукции ЭАЭ инъекцией пептида MOG35-55 и коклюшного токсина. ProSense 680 является флуоресцентным субстратом катепсинов и позволяет проводить анализ воспаления. A: контрольная мышь, не получавшая инъекцию ProSense. B: введение лекарственной среды. C: лечение R-флурбипрофеном.

На фиг.6 показан результат анализа проточной цитометрии CD4+/CD25+ Т-клеток в спинном мозге в модели ЭАЭ рассеянного склероза. C57BL6 мышам вводили лекарственную среду или R-флурбипрофен (9 мг/кг/сутки перорально) начиная с 3 суток после индукции ЭАЭ инъекцией пептида MOG35-55 и коклюшного токсина. Когда клинические оценки у животных достигали 1,5-2, из поясничного отдела спинного мозга получали суспензию отдельных клеток. Анализ Т-клеток проводили на проточном цитометре (BD FACS Conto II) со специфичными антителами, специфичными к белкам, являющимся маркерами клеточной поверхности. Т-клетки идентифицировали при помощи CD3 и затем по экспрессии маркеров CD проводили сортировку Т-клеток на популяции. У животных, которых лечили R-флурбипрофеном, обнаруживали большее количество CD4+/CD25+ Т-клеток, что указывало на большее количество регуляторных Т-клеток, обладающих защитными функциями при ЭАЭ.

На фиг.7 показаны результаты анализа проточной цитометрии IL10+ и FoxP3+ Т-клеток в модели ЭАЭ рассеянного склероза. C57BL6 мышам вводили лекарственную среду или R-флурбипрофен (9 мг/кг/сутки перорально) начиная с 3 суток после индукции ЭАЭ инъекцией пептида MOG35-55 и коклюшного токсина. Когда клинические оценки у животных достигали 1,5-2, из селезенки получали суспензии отдельных клеток. Анализ Т-клеток проводили на проточном цитометре (BD FACS Conto II) со специфичными антителами, специфичными к белкам, являющимся маркерами клеточной поверхности. Т-клетки идентифицировали при помощи CD3 и затем выделяли популяцию Т-клеток. Для анализа внутриклеточных цитокинов спленоциты мышей ЭАЭ, которым вводили лекарственную среду или R-флурбипрофен, стимулировали посредством 50 нг/мл PMA + 500 нг/мл иономицина в течение 2 ч при 37°C с последующим введением 10 мкг/мл брефелдина А в течение 2 ч при 37°C для предотвращения выпуска цитокинов. У мышей, которых лечили R-флурбипрофеном, обнаруживали более высокую фракцию CD4+/CD25+/FoxP3+ регуляторных Т-клеток и увеличение выработки противовоспалительного IL-10.

На фиг.8 показаны результаты иммунофлуоресцентного анализа демиелинизации в оптическом нерве в модели ЭАЭ рассеянного склероза. C57BL6 мышам вводили лекарственную среду или R-флурбипрофен (9 мг/кг/сутки перорально) начиная с 5 суток после индукции ЭАЭ инъекцией пептида MOG35-55 и коклюшного токсина. Когда клинические оценки у животных достигали 1,5-2, мышам внутрисердечно вливали фосфатный буферный солевой раствор с последующей фиксацией посредством 4% ПФА. Оптические нервы удаляли, затем фиксировали, обеспечивали криозащиту в 20%-й сахарозе в течение ночи и делали срез на замораживающем микротоме. Срезы инкубировали с антителами, специфичными к основному белку миелина, и проводили контрастное окрашивание с помощью антител, специфичных к NeuN, являющемуся нейрональным маркером. Анализ выполняли при помощи флуоресцентного микроскопа (Zeiss Axiovert). Изображения показывают, что лечение R-флурбипрофеном существенно снижает деструкцию миелиновых оболочек, окружающих нейронные волокна, по сравнению с мышами, которым вводили лекарственную среду.

Настоящее изобретение относится к лечению рассеянного склероза. Предложено применение R-энантиомера таренфлурбила (R-флурбипрофена) для применения при лечении рассеянного склероза. Технический результат состоит в снижении деструкции миелиновых оболочек вокруг аксонов. 6 з.п. ф-лы, 10 ил.

1. Применение R-флурбипрофена (таренфлурбила) или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения для лечения рассеянного склероза (PC).

2. Применение по п. 1, где указанный PC является ремиттирующим или прогрессирующим PC.

3. Применение по п. 1, где указанное соединение используют в количестве от 50 мг до 3000 мг, предпочтительно от 100 мг до 1500 мг.

4. Применение по п. 1, где указанное соединение используется в дозировке от 5 мг/кг массы тела до 15 мг/кг массы тела в сутки.

5. Применение по п. 1, где указанное соединение вводят перорально, ректально или путем инъекции.

6. Применение по п. 1, где указанное соединение предоставлено в форме таблетки, капсулы, драже, порошка, свечи, геля или раствора для инъекции.

7. Применение по п. 1, где указанное соединение предоставлено в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством против PC, таким как, например, интерферон бета 1а или 1b, Глатирамер, митоксантрон, Натализумаб, глюкокортикоид, Финголимод, кладрибин, Терифлуномид, Фампридин, ингибитор HMG-CoA редуктазы или каннабиноид.