НОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2016 года по МПК A61K47/48 

Область техники

Настоящее изобретение имеет отношение к новой конструкции олигонуклеотида с присоединенными к нему гидрофильным и гидрофобным материалами, улучшающими доставку одноцепочечных или двухцепочечных олигонуклеотидов, пригодных для лечения рака и инфекционных болезней, и ее применению.

Первый аспект настоящего изобретения имеет отношение к конструкции двуспиральной олиго-РНК, содержащей мишень-специфический лиганд, связанный с гидрофильным материалом, содержащимся в конструкции, к наночастице, состоящей из соединенных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций, фармацевтической композиции, содержащей РНК-конструкцию, фармацевтической композиции, содержащей наночастицу, состоящую из соединенных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций, способу получения данной конструкции, способу получения наночастицы, состоящей из РНК-конструкций, и способу доставки связанной с лигандом двуспиральной олиго-РНК конструкции.

Второй аспект настоящего изобретения имеет отношение к конъюгату антисмыслового олигонуклеотида (именуемому в дальнейшем "ASO"), который содержит гидрофильный материал и гидрофобный материал, связанный с двумя концами ASO, путем простой ковалентной связи или ковалентной связи, через промежуточный линкер, для усиления эффективности внутриклеточной доставки ASO, способу получения конъюгата и методу доставки наночастицы, состоящей из ASO конъюгатов.

Уровень техники

С тех пор, как была установлена роль РНК-интерференции (в дальнейшем называемой 'РНКи'), было обнаружено, что РНКи оказывает воздействие на специфическую последовательность мРНК в целом ряде клеток млекопитающих (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764-773). После доставки в клетки длинной двухцепочечной РНК, доставленная РНК разрезается эндонуклеазой dicer на малые интерферирующие РНК (в дальнейшем называемые 'миРНК') длиной 21-23 пар оснований (по). миРНК связывается с RISC (РНК-индуцированный комплекс сайлесинга) и ингибирует экспрессию гена-мишени специфичным к последовательности образом с помощью процесса, в котором антисмысловая цепь распознает и разрушает целевую мРНК (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES и RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).

Bertrand et al. сообщил, что миРНК оказывает превосходное ингибирующее действие на экспрессию мРНК in vitro и in vivo по сравнению с антисмысловым олигонуклеотидом (ASO) в отношении одного и того же целевого гена, и что этот эффект является продолжительным (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture и in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun.2002. 296: 1000-1004). Кроме того, поскольку миРНК комплементарно связывается с целевой мРНК для регуляции экспрессии целевого гена специфичным к последовательности образом, ее можно успешно использовать во множестве практических применений по сравнению с обычными лекарственными средствами на основе антител или химическими препаратами (низкомолекулярными лекарственными средствами) (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. Molecular Therapy. 2006 13(4): 664-670).

миРНК демонстрирует превосходные свойства и может иметь широкое применение, однако, для того, чтобы разработать клеточные терапевтические средства на основе миРНК, необходимо улучшить стабильность и эффективность внутриклеточной доставки миРНК, для того, чтобы эффективно доставлять миРНК в клетки-мишени (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1-2): 67-73).

В попытке удовлетворить эти требования используются устойчивые к действию нуклеаз аналоги или носители, такие как вирусные векторы, липосомы или наночастицы.

Вирусные носители, такие как аденовирус и ретровирус, имеют высокую эффективность трансфекции, однако несут риски иммуногенности и онкогенности. Тем не менее, известно, что невирусные носители, включающие наночастицы, имеют низкую эффективность внутриклеточной доставки по сравнению с вирусными носителями, однако имеют преимущества, включая высокую безопасность in vivo, мишень-специфическую доставку, эффективное поглощение и интернализацию олигонуклеотидов РНКи в клетки или ткани, низкую цитотоксичность и стимуляцию иммунитета. Таким образом, считается, что эти невирусные носители являются наиболее многообещающим способом доставки, который обеспечивает эффективное ингибирование экспрессии гена-мишени (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J. Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).

Разработаны системы доставки с использованием различных наночастиц для специфической доставки в раковую опухоль. Подобные системы наночастиц, как правило, создаются таким образом, что поверхность покрывается гидрофильным материалом с целью увеличения времени циркуляции в крови и является положительно заряженной для увеличения эндоцитоза (Active targeting schemes for nanopartical systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1615-1626). В то же время, опухолевая ткань является очень ригидной (устойчивой) и в отличие от нормальной ткани имеет диффузионное ограничение, причем преодолевает диффузионное ограничение посредством образования кровеносных сосудов в близлежащей области путем ангиогенеза, поскольку это диффузионное ограничение оказывает побочное действие на перемещение питательных веществ, необходимых для опухоли, и истощение таких материалов, как кислород и двуокись углерода. Кровеносные сосуды, образованные в опухолевой ткани путем ангиогенеза могут быть подтекающими и дефектными и включают кровеносные сосуды, имеющие щели с размером в пределах примерно от 100 нм до 2 мкм в зависимости от вида опухоли.

Таким образом, наночастицы свободно проходят через эндотелий капилляров опухолевой ткани, имеющей подтекающие и дефектные кровеносные сосуды, по сравнению со структурированными капиллярными сосудами нормальной ткани, так что они легко доставляются в ходе их циркуляции в крови. Кроме того, опухолевая ткань не имеет лимфодренажа, и таким образом, лекарственное средство накапливается в ней. Этот механизм известен как эффект усиленного проникновения и удерживания (EPR). Посредством этого эффекта наночастицы легко доставляются напрямую в опухолевую ткань, а этот механизм известен под названием пассивный таргетинг (пассивное нацеливание) (Nanoparticals for drug delivery in cancer treatment. Urol Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1): 57-64).

С целью преодоления неспецифического распределения in vivo, неспецифического нацеливания (таргетинга) и отсутствия растворимости в воде терапевтических средств, включая противоопухолевые лекарственные препараты, были проведены исследования по оптимизации размера наночастиц, нагруженных лекарственными средствами, или модификации поверхности с целью увеличения времени их циркуляции в крови. В частности, были проведены исследования в отношении полимерных наночастиц, содержащих конъюгаты полимера с лекарственным средством, касающиеся увеличения опухолеспецифической доставки противоопухолевых препаратов путем связывания противоопухолевых препаратов с водорастворимыми, биодеградируемыми материалами, такими как альбумин, поли-L-глутамат (PGA) или сополимер N-(2-гидроксипропил)-метакриламид (Therapeutic Nanoparticals for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: 1310-1316). В дополнение к этому были проведены исследования в отношении соединения амфифильного материала с противоопухолевым препаратом, для того, чтобы получить полимерные мицеллы, состоящие из гидрофобной сердцевины, состоящей из противоопухолевого лекарственного средства, и гидрофильной оболочки (Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. J Control Release 2001; 74: 295-302).

Таким образом, в том случае, когда гидрофобный материал дополнительно связывается с терапевтическим средством, таким как противоопухолевое лекарственное средство, для увеличения когезионной прочности сердцевины, мицеллы могут образовываться даже при низкой концентрации, и могут формироваться полимерные мицеллы, обладающие повышенной устойчивостью, благодаря гидрофильному материалу оболочки. Терапевтическое средство, имеющее гидрофобный и гидрофильный материалы, связанные с его концами с помощью биодеградируемой связи, может формировать улучшенные полимерные мицеллы, которые могут стабильно доставлять терапевтическое средство в раковую ткань-мишень.

Недавно в качестве технологии доставки двухцепочечной олиго-РНК была разработана технология самосборки наночастицы SAMiRNA, которая образуется за счет свойств материалов, связанных с концами нуклеиновой кислоты (Korean Patent Laid-Open Publication No. 2009-0042297). SAMiRNA представляет собой самособирающуюся наночастицу, состоящую из двухцепочечных олиго-РНК структур с присоединенными к ним гидрофильным и гидрофобным материалами, увеличивающими доставку двухцепочечной олиго-РНК, при этом технология образования SAMiRNA может быть технологией улучшения внутриклеточной доставки двухцепочечной олиго-РНК.

Было обнаружено, что при введении SAMiRNA, меченой флуоресцентной меткой, в хвостовую вену мыши на модели ксенотрансплантата опухоли, наночастица специфично доставлялась в опухоль с помощью упомянутого выше пассивного нацеливания (смотри фиг. 2).

В то же время, наночастицы для активного нацеливания, имеют присоединенный к ним нацеливающий фрагмент. Сообщалось также, что нацеливающий фрагмент вызывает преимущественное накопление наночастиц в ткани-мишени или увеличивает интернализацию наночастиц в клетках-мишенях (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10): 552-8. Epub 2008 Aug 21).

Активное нацеливание означает увеличение доставки наночастиц в клетки-мишени с использованием нацеливающего фрагмента, такого как антитело или лиганд, связанный с наночастицами. В последние годы были проведены исследования по локализации миРНК в желательной ткани с использованием различных нацеливающих фрагментов, связанных с. миРНК.

Например, было обнаружено, что миРНК с присоединенным к ней α-токоферолом была эффективной, стабильно доставлялась in vivo и ингибировала экспрессию гена-мишени посредством РНК-интерференции (Kazutaka Nishina et al., The American Society of Gene therapy, 2008, 16(4): 734-740). Кроме того, было показано, что миРНК с присоединенным к ней холестерином более эффективно доставлялась в ткань печени по сравнению с проникающим в клетки пептидом (ССР), который в основном используется для доставки миРНК (US-20060014289; Moschos S.A. et al., Bioconjug. Chem. 18:1450-1459). Было сообщено, что эффект доставки объясняется не только специфичностью опухолевой ткани, но также специфичностью клетки, на которую нацеливается прикрепленный нацеливающий фрагмент.

В активном нацеливании используются материалы, обладающие способностью связываться с углеводородами, рецепторами или антигенами, которые являются специфическими для клетки-мишени или сверхэкспрессируются на поверхности клетки-мишени (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticals for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917). Так что, наночастицы, имеющие связанный с ними активный фрагмент, накапливаются в опухолевой ткани в ходе их циркуляции в крови посредством пассивного таргетинга, причем доставка наночастиц в клетки-мишени увеличивается с помощью нацеливающего фрагмента, таким образом увеличивается терапевтический эффект лекарственного средства, доставленного в клетки. В качестве нацеливающего средства преимущественно используется лиганд или антитело. Лиганд или антитело связывается со своим рецептором на клеточной поверхности с высокой авидностью и специфичностью и способствует интернализации наночастиц с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME) (Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis (RME) of proteins и peptides: use of RME as a drug delivery system. J Control Release 1996; 39: 191-200).

Рецептор клеточной поверхности или антиген, на который нацеливается этот лиганд или антитело, имеет характерную особенность, в том смысле, что он является специфическим для клеток-мишеней или сверхэкспрессируется в клетках-мишенях для облегчения доступа к ним нацеленного лиганда, тем самым увеличивая скорость эндоцитоза. В дополнение к этому, рецептор или антиген доставляет наночастицы с присоединенным к ним лигандом в клетки и возвращается назад на поверхность клетки (Receptor-mediated endocytosis: An overview of a dynamic process. J. Biosci., Oct. 1984, 6(4), pp. 535-542.). Фрагментами, нацеленными на опухоль, являются материалы, которые специфически связываются или с рецепторами, специфически экспрессирующимися на линии клеток-мишеней, такими как эпидермальный фактор роста или рецептор липопротеина низкой плотности, или с опухолеспецифическими рецепторами, такими как фолатный рецептор, которые, как известно, сверхэкспрессируются на поверхности различных раковых клеток (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticals for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006, 5(8): 1909-1917).

Если нацеленный фрагмент, в частности, рецептор-специфический лиганд, увеличивающий интернализацию посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), связывается с SAMiRNA, он может оказывать эффективное содействие доставке SAMiRNA в клетки-мишени, в частности, раковые клетки, и таким образом, SAMiRNA может доставляться в целевые клетки даже при относительно низкой концентрации и дозе, так что двухцепочечная олиго-РНК может демонстрировать высокую активность, и может быть ингибирована неспецифическая доставка двухцепочечной олиго-РНК в другие органы и клетки.

В дополнение к этому, технология образования SAMiRNA может применяться не только к двухцепочечным олиго-РНК, но также к одноцепочечным олигонуклеотидам, в частности, одноцепочечному антисмысловому олигонуклеотиду (ASO) с терапевтическими целями.

Технология ASO - это технология контролирования переноса информации от гена к белку путем изменения метаболизма мРНК с использованием одноцепочечной РНК или ДНК. Другими словами, это технология осуществления предпочтительного ингибирования экспрессии представляющего интерес белка с использованием выбранной нуклеотидной последовательности, которая комплементарно и специфически гибридизуется с данным белком. Поскольку ASO связывается с геном-мишенью в соответствии со специфической последовательностью, он не влияет на экспрессию генов, отличных от гена-мишени. Таким образом, технология ASO может служить в качестве полезного средства при анализе функции in vivo конкретного белка и также может использоваться в качестве генной терапии против определенных болезней (FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995).

В последние годы был создан антагомир, представляющий собой новый тип одноцепочечного антисмыслового олигонуклеотида, и использован для ингибирования функции микроРНК в клетках. Известно, что антагомир или ингибитор микроРНК, который представляет собой синтезированную химическим путем короткую РНК, комплементарно связывается с целевой микроРНК, чтобы ингибировать функцию микроРНК. Предпочтительно антагомир имеет модифицированную химическую структуру, такую как 2′ метокси или фосфотионат для предотвращения деградации антагомира. В настоящее время известны антагомиры, ингибирующие функции микроРНК, связанных с различными болезнями, включая рак, фиброз сердца и легких ("Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'" Nature, Dec. 2005, 438(7068): 685-689; "MicroRNAs as Therapeutic Targets" New England J. Medicine, 2006, 354 (11): 1194-1195; Meister G. et al., "Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing" RNA, Mar. 2004, 10 (3): 544-550).

Антисмысловая ДНК связывается с целевой мРНК с образованием РНК/ДНК дуплекса, который разрушается РНКазой H (разновидность рибонуклеазы, которая специфически разрушает мРНК, имеющую сформированный РНК/ДНК гибридный дуплекс) in vivo. Антисмысловая РНК образует дуплекс РНК/РНК, а деградация целевой мРНК индуцируется РНКазой L. РНКаза L представляет собой рибонуклеазу, которая преимущественно разрушает одноцепочечную РНК вокруг двухцепочечной РНК (Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376, 1992).

Однако, ASO, содержащий антагомир-ингибитор микроРНК должен эффективно доставляться в клетки-мишени для достижения желательного эффекта, причем ASO может быть разрушен рибонуклеазой в крови. Таким образом, чтобы использовать ASO в терапевтических целях, конъюгат ASO должен эффективно доставляться через клеточную мембрану, при этом должна быть обеспечена стабильность ASO in vivo (Shigeru Kawakami и Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).

Таким образом, для стабильности in vivo большинство ASO имеют форму олигодезоксинуклеотидов (ODN), полученных с помощью различных модификаций, обеспечивающих устойчивость к нуклеазам. Модификация может представлять собой замену -ОН группы в 2′ положении углерода молекулы сахара одного или более нуклеотидов на -CH₃ (метил), -OCH₃, -NH₂, -F (фтор), -O-2-метоксиэтил, -О-пропил, -O-2-метилтиоэтил, -О-3-аминопропил, -О-3-диметиламинопропил, -O-N-метилацетамидо или -О-диметиламидоксиэтил; замену кислорода в молекуле сахара нуклеотида на серу; модификацию связи между нуклеотидами в фосфортиоатную, боранфосфонатную или метилфосфонатную связь; или комбинацию одного или более из этого; или модификацию в форме PNA (пептидо-нуклеиновой кислоты) или LNA (закрытой нуклеиновой кислоты) (смотри Crooke et al., Ann. Rev. Med. Vol. 55: pp 61-65 2004, США 5,660,985, США 5,958,691, США 6,531,584, США 5,808,023, США 6,326,358, США 6,175,001 Braasch D.А. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 1139-1143, 2003; Chiu Y. L. et al., RNA, 9: 1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al., Nucleic Acid Res. 31: 589-595, 2003).

Для доставки ASO в клетки-мишени разработаны методы доставки генов, использующие вирусы, такие как аденовирус и ретровирус, и методы доставки генов, использующие невирусные носители, такие как липосомы, катионные липиды или катионные полимеры. Однако, с вирусными носителями связаны проблемы, касающиеся безопасности, поскольку не гарантируется, что эти носители не вызывают нарушений нормальных функций генов хозяина после включения в хромосому хозяина или не активируют онкогены. Кроме того, если вирусный ген постоянно экспрессируется даже на низких уровнях, вызывая аутоиммунные заболевания, или если вирусный носитель вызывает модифицированную вирусную инфекцию, ASO не могут эффективно доставляться.

Для преодоления таких проблем и недостатков изучаются методы слияния гена с невирусным липосомальным носителем или методы использования катионных липидов или полимеров. Хотя эти невирусные векторы являются менее эффективными, чем вирусные носители, их преимущество заключается в безопасности in vivo, меньшем числе побочных эффектов и в производстве с меньшими затратами (Lehrman S. Nature. 401(6753): 517-518, 1999).

Для того чтобы добиться эффективной стабильной доставки молекул ODN, включая ASO, с использованием невирусных носителей, требуется эффективный способ предотвращения ферментативного и неферментативного расщепления. Поэтому предложены способы химической модификации ASO, чтобы сделать ASO устойчивыми в отношении нуклеаз и увеличить внутриклеточное поглощение ASO (Shigery Kawakami и Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).

В то же время, полимеры, содержащие PEG (полиэтиленгликоль), образуют композиты, имеющие мицеллярные структуры, спонтанно образованные взаимодействием между ними, эти композиты известны как полимерно-композитные мицеллы (Kataoka K. et al. Macromolecules, 29: 8556-8557, 1996). Эти полимерно-композитные мицеллы обладают преимуществом, заключающимся в том, что они имеют очень маленький размер по сравнению с другими системами доставки лекарственного средства, такими как микросферы или наночастицы, притом, что распределение их является очень однородным, при этом они формируются спонтанно (самопроизвольно), облегчая возможность контролировать качество композиции и обеспечивать воспроизводимость.

В последние годы с целью увеличения эффективности внутриклеточной доставки ASO была разработана технология обеспечения стабильности ASO и эффективного проникновения ASO через клеточную мембрану путем конъюгирования гидрофильного материала, такого как биосовместимый полимер PEG, с ASO путем простой ковалентной связи или ковалентной связи через промежуточный линкер (Корейский патент, номер 0466254). Однако трудно достичь улучшения стабильности ASO in vivo и обеспечения эффективной доставки ASO в ткань-мишень посредством только химической модификации и пегилирования.

Как описано выше, была разработана технология SAMiPHK в отношении наночастиц, полученных путем введения гидрофобного и гидрофильного материалов в миРНК для увеличения внутриклеточной доставки миРНК, однако о применении этой технологии для доставки ASO еще не сообщалось. Таким образом, существует необходимость в разработке системы доставки ASO и способа ее получения путем введения различных химических модификаций в ASO и конъюгирования различных полимеров с ASO с целью защиты ASO от ферментов, чтобы тем самым увеличить их устойчивость и эффективное проникновение через клеточную мембрану.

Сущность изобретения

В первом аспекте цель настоящего изобретения заключалась в получении терапевтической лекарственной конструкции, которая содержит гидрофильный и гидрофобный материалы, представляющие собой биосовместимые полимерные соединения, присоединенные к обоим концам лекарственного средства простой ковалентной связью или ковалентной связью через промежуточный линкер, с целью увеличения эффективности внутриклеточной доставки лекарственного средства, и дополнительно содержит лиганд, связанный с гидрофильным материалом, наночастицу, состоящую из терапевтической лекарственной конструкции, и предложении способа ее получения.

Другая цель настоящего изобретения заключалась в получении двуспиральной олиго-РНК конструкции, которая содержит биосовместимый гидрофильный и гидрофобный полимерный материалы, присоединенные к обоим концам двуспиральной олиго-РНК простой ковалентной связью или ковалентной связью через промежуточный линкер, с целью увеличения эффективности внутриклеточной доставки двуспиральной олиго-РНК, и дополнительно содержит рецептор-специфический лиганд, связанный с гидрофильным материалом, который обладает способностью усиливать интернализацию клеткой-мишенью (в частности, раковой клеткой) путем рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME); наночастицу, состоящую из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций; и фармацевтической композиции, содержащую или связанную с лигандом двуспиральную олиго-РНК конструкцию или наночастицу, состоящую из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций.

Еще одна цель настоящего изобретения заключалась в предложении способа получения связанной с лигандом двуспиральной олиго-РНК конструкции и наночастицы, содержащей то же самое, и способа доставки двуспиральной олиго-РНК с использованием лиганд-связанной двуспиральной олиго-РНК конструкции.

Когда мишень-специфический лиганд связывается с двуспиральной олиго-РНК конструкцией, наночастица, состоящая из лиганд-связанных двуспиральных олиго-РНК конструкций, может эффективно доставляться в клетку-мишень. Таким образом, даже когда лиганд-связанная двуспиральная олиго-РНК конструкция вводится в относительно низкой концентрации, она может проявлять активность двуспиральной олиго-РНК в клетке-мишени. Кроме того, поскольку присоединенный лиганд может предотвратить неспецифическую доставку двуспиральной олиго-РНК в другие органы и клетки, лиганд-связанная двуспиральная РНК конструкция может использоваться для лечения различных болезней и также может эффективно использоваться в качестве системы доставки нового типа двуспиральной олиго-РНК. В частности, лиганд-связанная двуспиральная РНК конструкция может эффективно использоваться для лечения болезней, включая рак и инфекционные болезни.

Во втором аспекте цель настоящего изобретения заключалась в получении конъюгата ASO-полимер, содержащий биосовместимый гидрофильный и гидрофобный полимерный материалы, присоединенные к обоим концам ASO посредством простой ковалентной связи или ковалентной связи через промежуточный линкер с целью повышения эффективности внутриклеточной доставки ASO, и предложении способа его получения.

Другая цель настоящего изобретения заключалась в предложении метода доставки ASO с использованием наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер, и фармацевтической композиции, содержащую или конъюгат ASO-полимер или наночастицу, состоящую из конъюгатов ASO-полимер.

Конъюгат ASO-полимер согласно настоящему изобретению и наночастица, состоящая из конъюгатов ASO-полимер, может увеличивать стабильность ASO in vivo, делая возможной эффективную доставку терапевтического ASO в клетки. Кроме того, они могут проявлять активность ASO при относительно низких концентрациях по сравнению с ASO, концы которого не модифицированы, даже при отсутствии трансфекционного агента. Таким образом, конъюгат ASO-полимер и наночастица, состоящая из конъюгатов ASO-полимер, могут использоваться для лечения различных болезней, включая рак и инфекционные заболевания, и также могут очень эффективно использоваться в качестве нового типа системы доставки ASO в основных биоинженерных исследованиях и медицинской промышленности.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - это схематическое изображение наночастицы (SAMiPHK), состоящей из двуспиральных структур олиго-РНК с присоединенным к ней лигандом.

Фиг. 2 показывает опухолеспецифическую доставку SAMiPHK. Фиг. 2А - это фотография, показывающая биораспределение SAMiPHK с течением времени после однократного введения Су5.5-меченой SAMiPHK в хвостовую вену мыши с трансплантированной опухолью в дозе 5 мг/кг веса тела (участок, показанный серой пунктирной линией - это участок с трансплантированной опухолью). Фиг. 2(B) - ex vivo фотография тканей, собранных через 48 часов после введения SAMiPHK.

Фиг. 3 показывает результаты ЯМР-анализов 1,3,4,6-тетра-ацетил-NAG (соединение A). ¹H ЯМР (300 MHz, DMSO-D6); δ 7.89 ppm (1H, d, J=9.3 Hz), 5.64 ppm (1H, d, J=8.7 Hz), 5.27 ppm (1H, d, J=3.3 Hz), 5.07 ppm (1H, dd, J=11.7, 3.6 Hz), 4.22 ppm (1H, t, J=6.3 Hz), 4.14-3.96 ppm (2H, m), 2.12 ppm (3H, s), 2.04 ppm (3H, s), 1.99 ppm (3H, s), 1.91 (3H, s), 1.78 ppm (3H, s).

Фиг. 4 показывает результаты ЯМР-анализов 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацеталгалактозамина(NAG) (соединение В). ¹H ЯМР (300 MHz, DMSO-D₆); δ 7.71 ppm (1Н, d, J=9.3 Hz), 5.21 ppm (1H, d, J=3.0 Hz), 4.97 ppm (1H, dd, J=11.1, 3.0 Hz), 4.56 ppm (1H, d, J=8.7 Hz), 3.88 ppm (1H, q, J=8.7 Hz), 3.83-3.74 ppm (1H, m), 3.62-3.39 ppm (25H, m), 2.10 ppm (3H, s), 2.01 ppm (3H, s), 1.89 ppm (3H, s), 1.77 ppm (3H,s).

Фиг. 5 показывает результаты ЯМР-анализов 1-гекса(эталенгликоль)-NAG-фосфорамидита) (соединение С). (А) ¹H ЯМР (300 MHz, DMSO-D₆); δ 7.78 ppm (1H, d, J=9.3 Hz), 5.21 ppm (1H, d, J=3.0 Hz), 4.97 ppm (1H, dd, J=11.1, 3.6 Hz), 4.56 ppm (1H, d, J=8.1 Hz), 3.88 ppm (1H, d, J=9.0 Hz), 3.81-3.41 ppm (ЗОН, m), 2.89 ppm (2H, t, J=5.7 Hz), 2.11 ppm (3H, s), 2.00 ppm (3H, s), 1.89 ppm (3H, s), 1.77 ppm (3H, s), 1.20-1.12 ppm (12H, m), (В) ³¹P ЯМР data (121 MHz, DMSO-D₆); δ 147.32 ppm.

Фиг. 6 показывает процесс получения одноцепочечной РНК.

Фиг. 7 показывает процесс получения двуспиральной олиго-РНК конструкции, содержащей PEG, связанный с 5′ концом двуспиральной олиго-РНК, и результаты анализа конструкции РНК. Фиг. 7(A) показывает процесс связывания PEG с двуспиральной олиго-РНК с использованием PEG-фосфорамидита. Фиг. 7(B) показывает результаты MALDI-TOF MS-анализа одноцепочечной РНК (21 нукл), которая не была модифицирована на 5′ конце (SEQ ID NO: 1; MB 6662.1). Фиг. 7(C) показывает результаты MALDI-TOF MS одноцепочечной РНК (21 нукл), имеющей PEG, связанный с 5′ концом (SEQ ID NO: 1; MB 6662.1).

Фиг. 8 показывает процесс получения моно-NAG-PEG-PHK конструкции и результаты анализа данной конструкции. Фиг. 8(A) показывает процесс связывания N-ацетил галактозамина (NAG) с PEG-RNA с использованием N-ацетил-галактозамин-фосфорамидита. Фиг. 8(B) показывает результаты MALDI-TOF MS анализа NAG-PEG-РНК конструкции (синий, MB 9171.2), конструкции, содержащей N-ацетил-галактозамин, связанный с PEG-РНК (зеленый, MB 8624.1), и показывает, что центральный пик сдвинут по молекулярной массе N-ацетил-галактозамина (MB 547).

Фиг. 9 показывает процесс получения тройной конструкции NAG-PEG-PHK и результат анализа данной конструкции. Фиг. 9(A) показывает процесс связывания N-ацетил-галактозамина с PEG-РНК с использованием дендримера фосфорамидита и NAG-фосфорамидита, и фиг. 9(B) показывает результаты MALDI-TOF MS анализа PEG-РНК (зеленый, MB 8624.1), и моно-NAG-PEG конструкции (синий, MB 9171.2) и тройной-NAG-PEG-PHK конструкции (красный, MB 10630), содержащей связанный с ней N-ацетил галактозамин.

Фиг. 10 показывает процесс получения 5′ фолат-PEG-PHK конструкции и результаты анализа данной конструкции. Фиг. 10(A) показывает процесс связывания фолата с PEG-РНК с использованием NHS-фолата, и фиг. 10(B) показывает результаты MALDI-TOF MS анализа PEG-РНК (зеленый, MB 8624.1) и фолат-PEG-PHK конструкции (синий, MB 9277.8) и показывает, что центральный пик сдвинут молекулярной массой фолата (MB 615).

Фиг. 11 показывает результаты анализов 5′ C₂₄-РНК конструкции. Фиг. 11(A) показывает результаты MALDI-TOF MS анализа одноцепочечной РНК, комплементарной SEQ ID NO: 1 (MB 7349.5), и фиг. 11(B) показывает анализ MALDI-TOF MS 5′ С₂₄-РНК конструкции, комплементарной SEQ ID NO: 1 (MB 7830.2).

Фиг. 12 показывает процесс получения 3′ CPG-амин-PEG-PHK конструкции с помощью амин-CPG.

Фиг. 13 показывает процесс получения 3′ CPG-амин-PEG-RNA-C₂₄ конструкции с помощью амин-CPG.

Фиг. 14 показывает процесс получения 3′ фолат-PEG-PHK конструкции и результаты анализа данной конструкции. Фиг. 14(A) показывает процесс связывания фолата с 3′ амин-PEG-PHK структурой с помощью NHS-фолата; и фиг. 14(B) показывает результаты MALDI-TOF MS анализа 3′ фолат-PEG-PHK конструкции (SEQ ID NO: 1; MB 9277.7):

Фиг. 15 показывает результаты исследования физических свойств наночастицы (фолат-SAMiPHK), состоящей из структур 5′ фолат-РНК-полимер. Фиг. 15(A) - графическая диаграмма, показывающая размер и коэффициент полидисперсности (PDI) фолат-SAMiPHK, и фиг. 15(B) - графическая диаграмма, показывающая критическую концентрацию мицелл фолат-SAMiPHK.

Фиг. 16 показывает эффект фолат-SAMiPHK на ингибирование экспрессии гена-мишени в линии клеток, сверхэкспрессирующих фолатный рецептор. Уровень мРНК гена мишени в линии опухолевых клеток KB, сверхэкспрессирующих фолатный рецептор, был измерен с помощью количественной ПЦР через 48 часов после введения фолат-SAMiPHK и SAMiPHK. На фиг. 16, в отсутствие фолата в культуральной среде: условия без фолата; с фолатом в культуральной среде: содержание избыточного количества (1 мМ) фолата; Контроль (Con): группа, обработанная наночастицей SAMiPHK-Con, состоящей из структур двуспиральная олиго-РНК-полимер, содержащих последовательность SEQ ID NO: 2 (контрольная последовательность); SAM: группа, обработанная наночастицей SAMiPHK-Sur, состоящей из конструкций двуспиральная олиго-РНК-полимер, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина); Фолат-SAM: тестируемая группа, обработанная наночастицей Фолат-SAMiPHK-Sur, состоящей из фолат-двуспиральных олиго-РНК, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина), и имеющей присоединенный к ней фолат.

Фиг. 17 показывает эффект фолат-SAMiPHK на ингибирование экспрессии гена-мишени в опухолевой ткани. Уровень мРНК гена-мишени (сурвивина) в опухолевой ткани был измерен с помощью количественной ПЦР через 48 часов или 72 часа после однократного введения SAMiPHK и фолат-SAMiPHK в дозе 5 мг/кг веса тела в хвостовую вену мыши с опухолью из линии клеток KB, которая сверхэкспрессирует фолатный рецептор 48. На фиг. 17, PBS: отрицательный контроль; SAMiPHK: группа, которой вводили наночастицу SAMiPHK-Sur состоящую из двуспиральных олиго-РНК-полимер-структур, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина) и без присоединенного лиганда; Фолат-SAMiPHK: группа с введением наночастицы фолат-SAMiPHK-Sur с последовательностью SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина), имеющей связанный с ней фолатный лиганд.

Фиг. 18 - это схематическое изображение наночастицы, содержащей конъюгат ASO-полимер.

Фиг. 19 показывает MALDI-TOF MS-спектр ASO и конъюгата ASO-полимер согласно настоящему изобретению. Четыре нуклеотида на обоих концах (5′ и 3′ концы) модифицированы 2-ОСН₃ (метокси), и 'm' обозначает ОСН₃ (метокси) группу. Фиг. 19(A) показывает MALDI-TOF-результаты в отношении ASO (М.В. 5967.9 Да), и фиг. 19(B) показывает MALDI-TOF-результаты конъюгата ASO-полимер (М.В. 8448 Да).

Фиг. 20 показывает результаты исследования физических свойств наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер. Фиг. 20(A) - диаграмма, показывающая размер и коэффициент полидисперсности (PDI) наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер; и фиг. 20(B) - диаграмма, показывающая критическую концентрацию мицелл наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер.

Фиг. 21 показывает результаты анализа уровня мРНК экспрессии при различных лечебных концентрациях (10, 50 и 100 нМ) в целях проверки эффектов ASO и конъюгата ASO-полимер на ингибирование экспрессии гена-мишени в опухолевых клетках. Перетасованная ASO SEQ ID NO: 4 (контрольная последовательность); Сурвивин: ASO SEQ ID NO: 3 (последовательность сурвивина); ASO: ASO, без присоединенного к нему материала; конъюгат ASO-полимер: конъюгат ASO-полимер в форме 3′PEG-ASO-5′липида).

Наилучшее техническое выполнение изобретения

1. Первый аспект настоящего изобретения

В первом аспекте настоящего изобретения термин "антисмысловая цепь" означает цепь, которая проявляет РНКи-активность, необходимую для связывания и разрушения целевой мРНК в RISC (индуцированный РНК комплекс сайленсинга), а термин "смысловая цепь" означает цепь, имеющую последовательность, комплементарную антисмысловой цепи.

Использованный в описании термин "комплементарный" или "комплементарное связывание" означает, что две последовательности связываются друг с другом с образованием двухцепочечной структуры. Термин включает не только полное совпадение между двумя последовательностями, но также несоответствие (ошибочное спаривание) между двумя последовательностями.

Настоящее изобретение предоставляет терапевтическую конструкцию лекарство-полимер, имеющую следующую формулу (1), и содержащую соединенный к ней лиганд:

Формула 1

L-A-X-R-Y-B

в которой А представляет собой гидрофильный материал; В представляет собой гидрофобный материал; X и Y каждый независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; R представляет собой лекарственное средство; и L представляет собой рецептор-специфический лиганд, обладающий свойством усиливать интернализацию клеткой-мишенью путем рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME).

В данном документе лекарственное средство может быть выбрано из числа противоопухолевых препаратов, двуспиральных олиго-РНК, противовирусных препаратов, стероидных противовоспалительных препаратов (SATO), нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), антибиотиков, противогрибковых средств, витаминов, гормонов, ретиноевой кислоты, простагландинов, простациклинов, антиметаболических средств, микотиков, агонистов холина, антагонистов адреналина, противосудорожных средств, анксиолитических средств, транквилизаторов, антидепрессантов, анестезирующих средств, болеутоляющих средств, анаболических стероидных средств, эстрогенов, прогестеронов, гликозаминогликанов, полинуклеотидов, иммуносупрессорных средств и иммуностимулирующих средств.

В настоящем изобретении лекарственное средство предпочтительно представляет собой двуспиральную олиго-РНК или противоопухолевое лекарственное средство. Если терапевтическое средство представляет собой двуспиральную олиго-РНК, гидрофильный материал может быть присоединен к 3′ или 5′ концу двуспиральной олиго-РНК.

В терапевтической конструкции лекарство-полимер изобретения, содержащей соединенный к ней лиганд, лиганд может быть дополнительно присоединен к конкретному месту (в частности, концу) гидрофильного материала, соединенного с двуспиральной олиго-РНК или противоопухолевым препаратом. Лиганд может быть выбран из числа антитела, специфического к рецептору-мишени, аптамера (одноцепочечной нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК или модифицированной нуклеиновой кислоты), способной связываться с молекулой-мишенью с высокой аффинностью и специфичностью), пептида или химических веществ, включая фолат (фолат используется взаимозаменяемо с фолиевой кислотой, и использованный в описании термин "фолат" относится к фолату, который является активным в природе или в организме человека), N-ацетилгалактозамин (NAG) и маннозу, обладающих свойством специфически связываться с рецептором, усиливающим интернализацию клеткой-мишенью посредством RME. В данном описании лиганд является материалом, осуществляющим доставку к мишени-рецептору специфическим образом, и не ограничивается только перечисленными выше антителом, аптамером, пептидом и химическими веществами.

Предпочтительно двуспиральная олиго-РНК состоит из 19-31 нуклеотидов. Двуспиральная олиго-РНК, используемая в настоящем изобретении, может быть любой двуспиральной олиго-РНК для любого гена, который используется или может использоваться для генной терапии или исследований.

Гидрофобный материал используется для формирования наночастицы, состоящей из двуспиральных олиго-РНК структур, посредством гидрофобного взаимодействия. Из числа гидрофобных материалов пригодными для использования при получении конструкции настоящего изобретения являются углеродная цепь и холестерин, поскольку они могут быть легко присоединены на стадии синтеза двуспиральных олиго-РНК.

Гидрофобный материал предпочтительно имеет молекулярную массу 250-1000. В частности, гидрофобный материал, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой стероидное производное, производное глицерида, эфир глицерина, полипропиленгликоль, C₁₂-C₅₀ ненасыщенный или насыщенный углеводород, диацил фосфатидилхолин, жирную кислоту, фосфолипид, липополиамин или тому подобное, но не ограничивается этим, при этом специалистам в данной области техники понятно, что может использоваться любой гидрофобный материал, подходящий для целей настоящего изобретения.

В частности, стероидное производное может быть выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестерин формиата, холестанил формиата и холестанил амина, и производное глицерида может быть выбрано из числа моно-, ди- и три-глицеридов, при этом жирная кислота в триглицериде может быть C₁₂-C₅₀ ненасыщенной или насыщенной жирной кислотой.

Кроме того, гидрофильный материал предпочтительно является катионным или неионным полимером с молекулярной массой 200-10000, и более предпочтительно неионным полимером с молекулярной массой 1000-2000. Например, гидрофильный материал, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно является неионным гидрофильным полимерным соединением, таким как полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон или полиоксазолин, но не ограничивается этим.

Гидрофильный материал при необходимости может быть модифицирован так, чтобы он имел функциональную группу, необходимую для связывания с лигандом. В частности, из числа гидрофильных материалов, полиэтиленгликоль (PEG), который может иметь разную молекулярную массу и функциональные группы, имеет хорошую биосовместимость, не вызывает иммунный ответ, увеличивает стабильность in vivo двуспиральной олиго-РНК и увеличивает эффективность доставки РНК, поэтому является весьма подходящим для получения изобретательской двуспиральной олиго-РНК конструкции.

Линкер, опосредующий ковалентную связь, особым образом не ограничивается, поскольку он образует ковалентную связь между гидрофильным материалом (или гидрофобным материалом) и концом двуспиральной олиго-РНК и обеспечивает связь, которая при необходимости может разрушаться в определенной окружающей среде. Таким образом, линкер может включать любое соединение, которое связывает гидрофильный материал (или гидрофобный материал) с двуспиральной олиго-РНК в ходе процесса получения данной конструкции.

Кроме того, ковалентная связь может быть неразрушающейся связью или разрушающейся связью. В данном описании неразрушающаяся связь включает, но не ограничивается этим, амидную связь или фосфатную связь, а разрушаемая связь включает, но не ограничивается этим, дисульфидную связь, связь, разрушаемую кислотой, сложноэфирную связь, ангидридную связь, биодеградируемую связь или связь, разрушаемую ферментативным путем.

Настоящее изобретение предоставляет лиганд-конъюгированную двуспиральную олиго-РНК конструкцию, представленную следующей формулой (2), которая содержит гидрофильный материал, присоединенный к 3′ концу кодирующей цепи двуспиральной олиго-РНК, лиганд, связанный с гидрофильным материалом, и гидрофобный материал, присоединенный к 5′ концу смысловой цепи:

Формула 2

В-Х-5′S3′-Y-A-L

AS

в которой А является гидрофильным материалом; В является гидрофобным материалом; X и Y каждый независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; S представляет собой смысловую (кодирующую) цепь двуспиральной олиго-РНК; AS представляет собой антисмысловую цепь двуспиральной олиго-РНК; и L представляет собой рецептор-специфический лиганд, обладающий свойством увеличения интернализации клетки-мишени посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME).

Способ получения конъюгированной с лигандом двуспиральной олиго-РНК конструкции, представленной формулой (2), включает стадии:

(1) синтеза одноцепочечной РНК на твердой подложке с присоединенным к ней гидрофильным материалом, имеющим функциональную группу;

(2) ковалентного связывания гидрофобного материала с 5′ концом одноцепочечной РНК, имеющей функциональную группу гидрофильного материала, соединенного с ней;

(4) отделения конструкции функциональная группа-РНК-полимер и отдельно синтезированной комплементарной одноцепочечной РНК от твердой подложки;

(5) связывания лиганда с концом гидрофильного материала с помощью функциональной группы; и

(6) гибридизации связанной с лигандом конструкции РНК-полимер с комплементарной одноцепочечной РНК с образованием двухцепочечной РНК-конструкции.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ может включать стадии: (1) связывания гидрофильного материала с твердой подложкой (CPG), имеющей присоединенную к ней функциональную группу; (2) синтеза одноцепочечной РНК на твердой подложке (CPG), имеющей присоединенную к ней функциональную группу гидрофильного материала, соединенного с подложкой; (3) ковалентного связывания гидрофобного материала с 5′ концом одноцепочечной РНК; (4) отделения конструкции функциональная группа-РНК-полимер и отдельно синтезированной комплементарной одноцепочечной РНК от твердой подложки (CPG); (5) связывания лиганда с концом гидрофильного материала с помощью функциональной группы с целью получения конструкции РНК-полимер, имеющей связанный с ней лиганд; и (6) гибридизации связанной с лигандом конструкции РНК-полимер с комплементарной одноцепочечной РНК с образованием двухцепочечной РНК-конструкции, имеющей связанный с ней лиганд. После стадии (6), конструкция РНК-полимер и комплементарная одноцепочечная РНК могут быть отделены и очищены от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а затем может быть измерена молекулярная масса с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF с целью установления, были ли получены желаемая конструкция РНК-полимер и РНК. В вышеописанном способе получения стадия синтеза одноцепочечной РНК, комплементарной с одноцепочечной РНК, синтезированной на стадии (3), может проводиться до стадии (1) или на любой из стадий (1)-(6).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет связанную с лигандом двуспиральную олиго-РНК конструкцию, представленную следующей формулой (3), которая содержит гидрофильный материал, связанный с 5′ концом смысловой цепи двуспиральной олиго-РНК, лиганд, соединенный с гидрофильным материалом, и гидрофобный материал, соединенный с 3′ концом кодирующей цепи:

Формула 3

L-A-X-5′S3′-Y-B

3′AS5′

Способ получения связанной с лигандом двуспиральной олиго-РНК-конструкции, представленной формулой (3), содержит стадии:

(1) синтеза одноцепочечной РНК на твердой подложке, имеющей функциональную группу, соединенную с ней;

(2) ковалентного связывания гидрофильного материала с материалом, полуученым на стадии (1);

(3) ковалентного связывания лиганда с материалом, полученным на стадии (2);

(4) отделения материала, полученного на стадии (3) от твердой подложки;

(5) ковалентного связывания гидрофобного материала с материалом, полученным в результате стадии (4), с помощью функциональной группы, связанной с 3′ концом; и

(6) гибридизации материала, полученного в результате стадии (5), с комплементарной одноцепочечной РНК с получением двуспиральной РНК-конструкции.

В более предпочтительном варианте осуществления способ получения может содержать стадии: (1) синтеза одноцепочечной РНК на твердой подложке (CPG), имеющей функциональную группу, связанную с ней; (2) ковалентного связывания гидрофильного материала с 5′ концом одноцепочечной РНК; (3) связывания лиганда с гидрофильным материалом, соединенным с одноцепочечной РНК, чтобы синтезировать структуру функциональная группа-РНК-гидрофильный полимер; (4) отделение конструкции функциональная группа-РНК-гидрофильный полимер от твердой подложки (CPG); (5) связывания гидрофобного материала с РНК через функциональную группу, чтобы синтезировать структуру РНК-полимер, имеющую присоединенный к ней лиганд; и (6) гибридизации полученной конструкции РНК-полимер с комплементарной одноцепочечной РНК, чтобы получить двуспиральную структуру олиго-РНК-полимер.

После стадии (5) РНК может быть отделена и очищена от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а затем может быть измерена молекулярная масса с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF с целью установления, были ли получены желаемая конструкция РНК-полимер и РНК. В описанном выше способе получения стадия синтеза одноцепочечной РНК, комплементарной с одноцепочечной РНК, синтезированной на стадии (1), может проводиться до стадии (1) или на любой из стадий (1)-(6).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет связанную с лигандом двуспиральную олиго-РНК структуру, представленную следующей формулой (4), которая содержит гидрофильный или гидрофобный материал, соединенный с 5′ концом смысловой цепи и антисмысловую цепь двуспиральной РНК:

Формула (4)

L-A-X-5′S3′

3′AS5′-Y-B

в которой А является гидрофильным материалом; В является гидрофобным материалом; X и Y каждый независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; S представляет собой смысловую цепь двуспиральной олиго-РНК; AS представляет собой антисмысловую цепь двуспиральной олиго-РНК; и L представляет собой рецептор-специфический лиганд, обладающий свойством усиления интернализацию клеткой-мишенью посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME).

Способ получения двуспиральной олиго-РНК-конструкции, представленной формулой (4), содержит стадии:

(1) синтеза одноцепочечной РНК на твердой подложке;

(2) ковалентного связывания гидрофильного материала с 5′ концом одноцепочечной РНК;

(3) соединения лиганда с гидрофильным материалом, связанным с одноцепочечной РНК;

(4) отделения связанной с лигандом конструкции РНК-гидрофильный полимер и отдельно синтезированной конструкции комплементарная РНК-гидрофобный полимер от твердой подложки; и

(5) гибридизацию связанной с лигандом конструкции РНК-гидрофильный полимер с комплементарной структурой РНК-гидрофобный полимер с получением двухцепочечной структуры.

Данный способ получения содержит, между стадиями (1)-(4), стадию синтеза одноцепочечной РНК, комплементарной одноцепочечной РНК стадии (1), и затем стадию ковалентного связывания гидрофобного материала с синтезированной одноцепочечной РНК, чтобы синтезировать структуру одноцепочечная РНК-гидрофобный полимер.

Настоящее изобретение также предоставляет наночастицу, содержащую двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую соединенный с ней лиганд, и наночастицу, содержащую конструкцию терапевтическое средство-полимер, имеющую соединенный с ней лиганд.

Наночастица образуется посредством взаимодействия между связанными с лигандом двуспиральными олиго-РНК конструкциями настоящего изобретения. В частности, образуется наночастица, имеющая структуру, в которой гидрофобный материал располагается в центре наночастицы, двуспиральная олиго-РНК находится под защитой внешнего гидрофильного материала, а лиганд располагается на поверхности наночастицы (смотри фиг. 1). Наночастица доставляет двуспиральную олиго-РНК в клетку с помощью лиганда, и поэтому доставляет РНК в клетку с высокой эффективностью. Такая наночастица может использоваться для лечения болезней. Синтез и характерные свойства данной конструкции, эффективность внутриклеточной доставки и действие наночастицы, содержащей данную конструкцию, далее будут подробно описаны в примерах, предоставленных ниже.

Настоящее изобретение также предлагает способ генной терапии, который использует наночастицу, состоящую из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций или связанных с лигандом конструкций лекарственное средство-полимер.

В частности, настоящее изобретение предлагает терапевтический способ, включающий стадии: получения наночастицы, состоящей из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК структур; и введения наночастицы в организм животного.

Настоящее изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически эффективное количество наночастиц, состоящих из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций.

Предназначенная для введения композиция настоящего изобретения может содержать, в дополнение к описанному выше активному ингредиенту, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, используемый в настоящем изобретении, должен быть совместимым с активным ингредиентом настоящего изобретения и может быть физиологическим солевым раствором, стерильной водой, раствором Рингера, забуференным раствором, раствором декстрозы, раствором мальтодекстрина, глицерином, этанолом или смесью двух или более из них. В дополнение к этому, композиция настоящего изобретения может при необходимости содержать другие общепринятые вспомогательные вещества, включая антиоксиданты, буферы и бактериостатические средства. Кроме того, композиция настоящего изобретения может быть создана в виде инъекционных форм, таких как водные растворы, суспензии или эмульсии, с использованием разбавителей, диспергирующих веществ, поверхностно-активных веществ, связывающих и смазывающих веществ. В частности, композиция настоящего изобретения предпочтительно предоставляется в виде лиофилизированной композиции. Для получения лиофилизированных композиций можно использовать любой обычный метод, известный в данной области техники, при этом также может быть добавлен стабилизатор для лиофилизации.

В дополнение к этому, композиция настоящего изобретения может быть включена в состав подходящих лекарственных форм, в зависимости от типа болезни или компонента, в соответствии с методом, известным в данной области техники или методом, раскрытым в справочнике по фармации Ремингтона (Mack Publishing Company, Easton PA).

Дозировка фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть определена специалистом в данной области техники в зависимости от состояния пациента и тяжести болезни. В дополнение к этому, композиция настоящего изобретения может быть изготовлена в виде порошков, таблеток, капсул, жидкости, растворов для инъекций, мазей и сиропов и может предоставляться в лекарственных формах или дозированных лекарственных формах, например, запаянных ампулах или флаконах.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться перорально или парентерально. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может вводиться различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, внутримозговой, субдуральный, внутрисердечный, внутрикожный, подкожный, внутрибрюшинный, гастроинтестинальный, подъязычный и местный.

Для клинического применения фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть создана в подходящих формах с использованием известного в данной области техники метода. Доза композиции настоящего изобретения может изменяться в зависимости от различных факторов, таких как вес тела пациента, возраст, пол, состояние здоровья и диета, время и способ введения, скорость экскреции и тяжесть болезни, и может быть легко определена специалистом в данной области техники.

2. Второй аспект настоящего изобретения

Во втором аспекте настоящее изобретение предлагается конъюгат ASO-полимер, представленный следующей формулой 5:

Формула 5

A-X-R-Y-B

в которой один из А и В является гидрофильным материалом, а другой является гидрофобным материалом, X и Y каждый независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер, и R представляет собой ASO.

Использованный в описании термин "ASO" включает не только обычные антисмысловые олигонуклеотиды, использующиеся для ингибирования экспрессии мРНК, но также антагомиры, ингибирующие функции микроРНК.

Гидрофильный материал в формуле (5) может иметь присоединенный к нему мишень-специфический лиганд. Мишень-специфический лиганд обладает свойством увеличивать мишень-специфическую интернализацию посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), при этом его можно выбрать из числа мишень-специфических антител или аптамеров, пептидов, таких как рецептор-специфические лиганды, и химических материалов, таких как фолат, N-ацетилгалактозамин (NAG) и манноза. В описании нацеливающий фрагмент представляет собой материал, обеспечивающий специфическую доставку к мишени, и не ограничивается описанными выше антителом, аптамером, пептидом и химическими материалами.

В конъюгате настоящего изобретения ASO предпочтительно содержит 10-50 олигонуклеотидов, более предпочтительно 13-25 олигонуклеотидов.

Для увеличения стабильности in vivo ASO включает олигодезоксинуклеотады (ODN), полученные с помощью различных модификаций, обеспечивающих устойчивость к нуклеазам. Модификация может быть одной или комбинацией двух или более, выбранных из числа замены -ОН группы в 2′ положении углерода молекулы сахара одного или более нуклеотидов на -CH₃ (метил), -OCH₃, -NH₂, -F (фтор), -O-2-метоксиэтил, -О-пропил, -O-2-метилтиоэтил, -О-3-аминопропил, -О-3-диметиламинопропил, -O-N-метилацетамидо или -О-диметиламидоксиэтил; замены кислорода в молекуле сахара нуклеотида на серу; модификации связи между нуклеотидами в фосфортиоатную, боранфосфонатную или метилфосфонатную связь. Альтернативно, модификация может быть модификацией в форме PNA (пептидо-нуклеиновой кислоты) или LNA (закрытой нуклеиновой кислоты).

Используемый в настоящем изобретении ASO не ограничивается специальным образом и может быть ASO для любого гена, который используется или может использоваться для генной терапии или исследований.

Специалистам понятно, что используемые в настоящем изобретении ASO включают не только ASO, совершенно равноценные с целевой мРНК, но также ASO, которые не совпадают с целевой мРНК, для ингибирования трансляции мРНК.

Гидрофильный материал предпочтительно имеет молекулярную массу 200-10000, более предпочтительно 1000-2000. Кроме того, гидрофильный материал предпочтительно является катионным или неионным полимерным соединением.

Например, гидрофильное полимерное соединение, используемое в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой неионное гидрофильное полимерное соединение, такое как PEG (полиэтилен), поливинилпирролидон или полиоксазолил, но не ограничивается этим.

Гидрофильный материал при необходимости может быть модифицирован, чтобы иметь функциональную группу, необходимую для связывания с другими материалами. Среди гидрофильных материалов, в частности, полиэтиленгликоль (PEG), который может иметь разную молекулярную массу и функциональные группы, имеет хорошую биосовместимость, не вызывает иммунный ответ, увеличивает стабильность ASO in vivo и увеличивает эффективность доставки ASO, поэтому является весьма подходящим для получения конъюгата по изобретению.

В дополнение к этому, гидрофобный материал предпочтительно имеет молекулярную массу 250-1000. В частности, используемый в настоящем изобретении гидрофобный материал может представлять собой стероидное производное, производное глицерида, эфир глицерина, полипропиленгликоль, С₁₂-С₅₀ ненасыщенный или насыщенный углеводород, диацил фосфатидилхолин, жирную кислоту, фосфолипид, липополиамин или тому подобное, но не ограничивается этим, при этом специалистам в данной области техники понятно, что может использоваться любой гидрофобный материал, подходящий для целей настоящего изобретения.

В частности, стероидное производное может быть выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестерил формиата, холестанил формиата и холестанил амина, и производное глицерида может быть выбрано из числа моно-, ди- и три-глицеридов, при этом жирная кислота в триглицериде может быть С₁₂-С₅₀ ненасыщенной или насыщенной жирной кислотой.

Гидрофобный материал используется для формирования наночастицы посредством гидрофобного взаимодействия. Из числа гидрофобных материалов пригодными для использования при получении конъюгата настоящего изобретения являются, в частности, углеродная цепь и холестерин, поскольку они могут быть легко присоединены на стадии получения ASO.

Кроме того, ковалентная связь, показанная как X или Y в формуле 5, может быть неразрушающейся связью или разрушающейся связью. В данном описании неразрушающаяся связь включает, но не ограничивается этим, амидную связь или фосфатную связь, а разрушаемая связь включает, но не ограничивается этим, дисульфидную связь, связь, разрушаемую кислотой, сложноэфирную связь, ангидридную связь, биодеградируемую связь или связь, разрушаемую ферментативным путем.

Конъюгат ASO-полимер согласно настоящему изобретению может иметь структуру, в которой гидрофильные материалы связываются с одним из 5′ и 3′ концов ASO, а гидрофобный материал связывается с другим концом.

Способ получения конъюгата ASO-полимер, имеющего гидрофильный материал, присоединенный к 3′ концу ASO, может включать стадии:

(a) ковалентного связывания гидрофильного материала с твердой подложкой;

(b) синтеза ASO на твердой подложке, содержащей гидрофильный материал;

(c) ковалентного связывания гидрофобного материала с 5′ концом ASO на твердой подложке; и

(d) отделения и очистки полученного конъюгата ASO-полимер от твердой подложки.

В более предпочтительном варианте осуществления конъюгат ASO-полимер получают способом, содержащим стадии: ковалентного связывания гидрофильного материала с твердой подложкой (стекло с контролируемым размером пор (CPG)); синтеза ASO на твердой подложке (CPG), имеющей ковалентно связанный с ней гидрофильный материал, путем деблокирования, соединения, кэппирования и окисления; и ковалентного связывания гидрофобного материала с 5′ концом ASO. После завершения получения конъюгата ASO-полимер, конъюгат ASO-полимер отделяют от твердой подложки (CPG), используя обработку 28% (об/об) аммиаком на водяной бане при 60°C, причем конъюгат ASO-полимер может быть выделен и очищен от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а затем может быть измерена молекулярная масса с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF, чтобы установить, был ли получен желаемый конъюгат ASO-полимер.

В другом аспекте способ получения конъюгата ASO-полимер, содержащего связанный с 5′ концом ASO гидрофильный материал, включает стадии:

(a) синтеза ASO на твердой подложке, имеющей связанную с ней функциональную группу;

(b) ковалентного связывания гидрофильного материала с 5′ концом ASO;

(c) отделение связанного с гидрофильным материалом ASO конъюгата от твердой подложки; и

(d) ковалентного связывания гидрофобного материала с 3′ концом ASO, отделенного от твердой подложки.

В более предпочтительном варианте осуществления способ получения содержит стадии: синтеза ASO на твердой подложке (CPG) с присоединенной к ней функциональной группой; ковалентного связывания гидрофильного материала с 5′ концом ASO; обработки твердой подложки 28% (об/об) аммонием на водяной бане 60°C с целью отсоединения прикрепленного через функциональную группу конъюгата ASO-гидрофильный полимер от твердой подложки (CPG); и присоединения гидрофобного материала к ASO через функциональную группу с образованием конъюгата ASO-полимер, содержащего гидрофильный материал и гидрофобный материал, присоединенный к обоим концам ASO. Когда получение конъюгата ASO-полимер завершено, конъюгат ASO-полимер может быть отделен и очищен от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), после чего может быть измерена молекулярная масса с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF с целью установления, был ли получен желаемый конъюгат ASO-полимер.

При этом конъюгат ASO-полимер может дополнительно содержать лиганд, связанный с гидрофильным материалом.

Способ связывания лиганда с гидрофильным материалом определяется в соответствии с типом функциональной группы, присоединенной к лиганду. Например, лиганд-фосфорамидит, содержащий фосфорамидит в качестве функциональной группы, может быть связан с гидрофильным материалом таким же образом, как в процессе синтеза ASO, а лиганд, имеющий связанный с ним N-гидроксисукцинимид (NHS), может быть связан с гидрофильным материалом посредством N-гидроксисукцинимид (NHS) сложноэфирной связи.

Способ получения конъюгата ASO-полимер, содержащего лиганд, присоединенный к конъюгату ASO-полимер, имеющему гидрофильный материал, присоединенный к 3′ концу ASO, содержит стадии:

(a) связывания гидрофильного материала с твердой подложкой, имеющей присоединенную к ней функциональную группу;

(b) синтез ASO на твердой подложке, имеющей присоединенный к ней гидрофильный материал с функциональной группой;

(c) ковалентного связывания гидрофобного материала с 5′ концом ASO;

(d) отделения конъюгата ASO-полимер, полученного на стадии (с), от твердой подложки; и

(e) связывания лиганда с гидрофильным материалом конъюгата ASO-полимер, отделенного от твердой подложки.

В более предпочтительном варианте осуществления способ получения содержит стадии: связывания гидрофильного полимера с твердой подложкой, имеющей присоединенную к ней функциональную группу; синтеза ASO на твердой подложке (CPG), имеющей присоединенный к ней гидрофильный материал с функциональной группой; ковалентного связывания гидрофобного материала с концевой группой ASO; отделения полученного в результате конъюгата функциональная группа-ASO-полимер от твердой подложки (CPG); и прикрепления лиганда к концу гидрофильного полимера с помощью функциональной группы, таким образом, получения связанного с лигандом конъюгата ASO-полимер. Когда получение связанного с лигандом конъюгата ASO-полимер завершено, конъюгат ASO-полимер может быть отделен и очищен от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), после чего может быть измерена молекулярная масса с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF с целью установления, был ли получен желаемый связанный с лигандом конъюгат ASO-полимер.

В другом аспекте способ получения конъюгата ASO-полимер, содержащего лиганд, прикрепленный к конъюгату ASO-полимер, имеющему гидрофильный материал, присоединенный к 5′ концу ASO, содержит стадии:

(a) синтеза ASO на твердой подложке, имеющей присоединенную к ней функциональную группу;

(b) ковалентного связывания гидрофильного материала с концом ASO;

(c) ковалентного связывания лиганда с конъюгатом ASO-гадрофильный материал;

(d) отделения конъюгата ASO-гадрофильный материал-лиганд, имеющего прикрепленную к нему функциональную группу, от твердой подложки; и

(e) ковалентного связывания гидрофобного материала с 3′ концом ASO конъюгата, отделенного от твердой подложки.

В более предпочтительном варианте осуществления способ получения содержит стадии: синтеза ASO на твердой подложке (CPG), имеющей присоединенную к ней функциональную группу; ковалентного связывания гидрофильного материала с концевой группой ASO; ковалентного связывания лиганда С ASO-гидрофильный полимер; отделения присоединенного через функциональную группу конъюгата ASO-гидрофильный полимер-лиганд от твердой подложки (CPG); и прикрепления гидрофобного материала к отделенному конъюгату с помощью функциональной группы, таким образом, синтеза связанного с лигандом конъюгата ASO-полимер, имеющего гидрофобный материал, прикрепленный к противоположному концу от гидрофильного полимера. Когда получение связанного с лигандом конъюгата ASO-полимер завершено, конъюгат ASO-полимер может быть отделен и очищен от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), после чего может быть измерена молекулярная масса с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF с целью установления, был ли получен желаемый лиганд-связанный конъюгат ASO-полимер.

В результате, конъюгат ASO-полимер, синтезированный в настоящем изобретении, содержит и гидрофобный и гидрофильный материалы, и таким образом является по природе амфифильным. Гидрофильный фрагмент направляется к наружной стороне путем взаимодействия (такого как водородная связь) с молекулами воды in vivo, а гидрофобный материал направляется внутрь посредством гидрофобного взаимодействия, и таким образом формируется термодинамически устойчивая наночастица. Другими словами, образуется наночастица, в которой гидрофобный материал располагается в центре наночастицы, а гидрофильный материал располагается с наружной стороны ASO, чтобы защищать ASO (смотри фиг. 18). Наночастица, сформированная, как описано выше, увеличивает внутриклеточную доставку ASO и может использоваться для лечения болезней. Синтез и свойства конъюгата, эффективность внутриклеточной доставки и эффекты конъюгата далее будут подробно описаны в предоставленных ниже примерах.

В дополнение к этому настоящее изобретение обеспечивает способ генной терапии, включающий стадии: получения наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер; и доставки ASO in vitro с помощью наночастицы. Метод генной терапии не ограничивается только применением in vitro.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически эффективное количество конъюгата ASO-полимер или наночастицы, состоящей из связанного с лигандом конъюгата ASO-полимер.

Для введения композиция настоящего изобретения может содержать, в дополнение к описанному выше активному ингредиенту, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель, используемый в настоящем изобретении, должен быть совместимым с активным ингредиентом настоящего изобретения и может быть физиологическим солевым раствором, стерильной водой, раствором Рингера, забуференным раствором, раствором декстрозы, раствором мальтодекстрина, глицерином, этанолом или смесью двух или более из них. В дополнение к этому, композиция настоящего изобретения может при необходимости содержать другие общепринятые вспомогательные вещества (добавки), включая антиоксиданты, буферы и бактериостатические средства. Кроме того, композиция настоящего изобретения может быть создана в виде инъекционных форм, таких как водные растворы, суспензии или эмульсии с использованием разбавителей, диспергирующих веществ, поверхностно-активных веществ, связывающих и смазывающих веществ. В частности, композиция настоящего изобретения предпочтительно предоставляется в виде лиофилизированной композиции. Для получения лиофилизированных композиций можно использовать любой обычный метод, известный в данной области техники, при этом также может быть добавлен стабилизатор для лиофилизации.

В дополнение к этому композиция настоящего изобретения может быть включена в состав подходящих лекарственных форм, в зависимости от типа болезни или компонента, в соответствии с методом, известным в данной области техники или методом, раскрытым в справочнике по фармации Ремингтона (Mack Publishing Company, Easton PA).

Дозировка фармацевтической композиции настоящего изобретения может быть определена специалистом в данной области техники в зависимости от состояния пациента и тяжести болезни. В дополнение к этому, композиция настоящего изобретения может быть изготовлена в виде порошков, таблеток, капсул, жидкости, растворов для инъекций, мазей и сиропов, и может предоставляться в лекарственных формах или дозированных лекарственных формах, например, запаянных ампулах или флаконах.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться перорально или парентерально. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может вводиться различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, пероральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, внутримозговой, субдуральный, внутрисердечный, внутрикожный, подкожный, внутрибрюшинный, гастроинтестинальный, подъязычный и местный. Доза композиции настоящего изобретения может изменяться в зависимости от различных факторов, таких как вес тела пациента, возраст, пол, состояние здоровья и диета, время и способ введения, скорость экскреции и тяжесть болезни, и может быть легко определена специалистом в данной области техники.

Примеры

Далее, настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры. Специалистам ясно, что эти примеры приводятся только с иллюстративной целью и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: Получение материала лиганда, который может быть прикреплен

Для получения двуспиральной олиго-РНК конструкции, имеющей связанный с ней лиганд, был получен материал лиганда, который может быть соединен с двуспиральной олиго-РНК структурой.

Пример 1-1: Получение реагента 1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамин-фосфорамидит (соединение А, В и C)

Для того чтобы соединить N-ацетил-галактозамин (NAG) с двуспиральной олиго-РНК структурой, был получен 1-гекса(этиленгликоль)-NAG-фосфорамидит, как показано на следующей схеме реакции 1.

Схема реакции 1

Пример 1-1-1: Получение 1,3,4,6-тетраацетил-NAG (соединение А)

Исходный материал галактозамин гидрохлорид (Sigma Aldrich, США) (2 г, 9.27 ммоль), ацетонитрил (Samjeon, Корея) (31 мл) и триэтиламин (Sigma Aldrich, США) (15.42 мл, 111.24 ммоль) смешали вместе и нагревали с обратным холодильником (рефлюкс) в течение 1 часа. Смесь медленно охладили до комнатной температуры, затем охладили до 0°С при помощи ледяной воды, а затем по каплям добавили уксусный ангидрид (Sigma Aldrich, США) (8.76 мл, 92.70 ммоль) за 10 минут. Потом убрали ледяную воду, и остальной материал перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После завершения реакции к продукту реакции медленно добавили водный раствор бикарбоната натрия (Samjeon, Корея) до достижения нейтрального значения рН. После достижения нейтрального значения рН реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, а полученное твердое вещество отфильтровали. Фильтрат последовательно промыли этилацетатом (Samjeon, Корея) (100 мл × 2), дистиллированной водой (100 мл × 2) и этилацетатом (100 мл × 1). Твердое вещество подвергли вакуумной сушке с получением 1,3,4,6-тетраацетил-N-ацетил-галактозамина (1.82 г, 52.3%) (смотри фиг. 3).

Пример 1-1-2: Получение 3,4,6-трацетил-1-гекса(этиленгликоль)-NAG (соединение B)

Смешали вместе 1,3,4,6-тетраацетил-N-ацетил-галактозамин (1.81 г, 4.82 ммоль) полученный в примере 1-1-1, хлорид железа III (Sigma Aldrich, США) (1.02 г, 6.27 ммоль) и метиленхлорид (Samjeon, Корея) (48 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Потом к смеси добавили гекса(этиленгликоль) (Sigma Aldrich, США) (1.58 мл, 4.82 ммоль), а затем нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. После завершения реакции реакционный раствор профильтровали через целит (Sigma Aldrich, США), а фильтрат промыли метиленхлоридом (50 мл × 2). Фильтрат концентрировали при уменьшенном давлении и добавили к этилацетату (100 мл) и дистиллированной воде (100 мл), водный слой собрали. Собранный водный слой экстрагировали метиленхлоридом (100 мл × 3), а затем собрали органический слой, высушили с помощью безводного сульфата магния (Samjeon, Корея) и профильтровали. Фильтрат концентрировали при уменьшенном давлении и высушили в вакууме, получив таким образом, 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил галактозамин (2.24 г, 74.9%) (смотри фиг. 4).

Пример 1-1-3: Получение 1-гекса(этиленгликоль)-NAG-фосфорамидита (соединение C)

Смешали соединение (2.22 г, 3.71 ммоль), полученное в примере 1-1-2, метиленхлорид (37 мл) и триэтиламин (0.94 мл, 6.75 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем, к смеси добавили 2-цианоэтил N,N-диизопропилхлорфосфорамидит (Sigma Aldrich, США) (0.75 мл, 3.38 ммоль) и перемешивали в течение 45 минут. После завершения реакции реакционный раствор концентрировали при уменьшенном давлении и добавили к нему этилацетат (100 мл) и дистиллированную воду (100 мл). Органический слой собрали, высушили с помощью безводного сульфата магния и профильтровали. Фильтрат концентрировали при уменьшенной давлении и очистили с помощью колоночной хроматографии, получив таким образом, 1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил галактозамин-фосфорамидит (1.14 г, 42.2%) (смотри фиг. 5).

Пример 1-2: Получение NHS-фолата

Для того, чтобы присоединить фолат к двуспиральной олиго-РНК структуре, был получен NHS-фолат, как показано на следующей схеме реакции 2:

Схема реакции 2

Смешали исходный материал фолиевую кислоту (Sigma Aldrich, США) (3 г, 6.8 ммоль), диметилсульфоксид (Sigma Aldrich, США) (60 мл), N-гидроксисукцинимид (Sigma Aldrich, США) (0.86 г, 7.5 ммоль) и 1,3-дициклогексилкарбодиимид (Sigma Aldrich, США) (1.54 г, 7.5 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. После завершения реакции, реакционную смесь добавляли по каплям в течение 10 минут в 950 мл смеси 3:5 этилацетат: н-гексан (Samjeon, Корея), полученный твердый NHS-фолат (3.79 г) профильтровали (Robert J. Lee и Philip S. Low (1994) J. Biological Chemistry. 269: 3198-3204).

Пример 1-3: Получение пептида

Ввиду того, что пептидные соединения включают α-аминокислоту, была проведена реакция связывания между пептидным производным, имеющим такую структуру, и функциональной аминогруппой PEG. В этой реакции связывания функциональные аминогруппы, присутствующие в PEG, и пептидное производное взаимодействуют друг с другом в ходе реакции связывания с карбоновой кислотой пептида, и по этой причине, проведение замещения функциональной аминогруппы пептидного соединения защитной группой было необходимо до реакции связывания. Аминогруппа пептидного соединения замещается защитной группой 9-фторенил-метоксикарбонил (Fmoc) или трет-бутилоксикарбонил (t-BOC), чтобы устранить его реакционноспособность с карбоновой кислотой пептида, таким образом, получив пептидное соединение, способное связываться с PEG.

Пример 2: Получение двуспиральной олиго-РНК конструкции, имеющей лиганд, связанный с 5′ концом

Материал лиганда, полученный в примере 1, может быть создан в форме фосфорамидита, такого как NAG-фосфорамидит примера 1-1, так, чтобы он мог связываться с концом PEG с помощью обычного процесса химического олиго-синтеза (состоящего из деблокирования, соединения, кэппирования и окисления). Альтернативно, он может быть создан в форме NHS-лиганда, такого как NHS-фолат примера 1-2, так, чтобы он мог связываться с амин-связанным PEG с помощью сложноэфирной связи, таким образом, давая PEG-РНК структуру, имеющую лиганд, соединенный с 5′ концом РНК. Синтезированная конструкция PEG-РНК, имеющая лиганд, связанный с 5′ концом, была гибридизована с комплементраной 5′ С₂₄-РНК структурой, имеющей связанную с ней гидрофобную группу, таким образом, давая двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 5′ концом.

Пример 2-1: Получение двуспиральной олиго-РНК

В следующих примерах двуспиральная олиго-РНК против сурвивина была использована для ингибирования сурвивина. Сурвивин является белком, который обычно экспрессируется в большинстве опухолей или линий мутантных клеток, проверенных к настоящему времени, и потенциально является важной мишенью в противоопухолевой терапии (Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7): 553-62). Двуспиральная олиго-РНК сурвивина согласно настоящему изобретению состоит из смысловой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1, и комплементарной ей антисмысловой цепи, и двухцепочечный олигонуклеотид, использующийся в качестве контроля, состоит из смысловой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 2, и комплементарной к ней антисмысловой цепи. Двуспиральная олиго-РНК, использованная в этом примере, состоит из следующей нуклеотидной последовательности.

(SEQ ID NO: 1) 5′-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3′

(SEQ ID NO: 2) 5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3′

Для того, чтобы синтезировать двуспиральную олиго-РНК, была синтезирована одноцепочечная РНК путем связывания нуклеотидов фосфодиэфирными связями остова РНК с использованием трет-бутилдиметилсилил-защищенного β-цианоэтил-фосфорамидита (Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).

В этом процессе синтеза, цикл, состоящий из разблокирования, соединения, кэппирования и окисления, был повторен на твердой подложке, имеющей присоединенный к ней нуклеозид, и таким образом, получена желаемая последовательность РНК. Процесс синтеза одноцепочечной РНК был проведен с использованием синтезатора РНК (384 Synthesizer, BIONEER, Корея) (смотри фиг. 6).

Пример 2-2: Получение 5′ PEG-РНК конструкции

Была проведена реакция РНК, синтезированной в примере 2-1, с реагентом PEG фосфорамидит в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, и таким образом, получена 5′ PEG-РНК конструкция (смотри фиг. 7).

Пример 2-3: Синтез конструкции PEG-РНК, имеющей лиганд на 5′ конце

Пример 2-3-1: Получение NAG-PEG-PHK конструкции с использованием N-ацетил галактозамин (NAG) фосфорамидита

Конструкция 5′ PEG-РНК, синтезированная в примере 2-2, вступала в реакцию с реагентом NAG фосфорамидитом (синтезированным в примере 1-1) в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы связать N-ацетил-галактозамин (NAG) с PEG-РНК конструкцией с помощью фосфодиэфирной связи. Лиганд N-ацетил-галактозамин может обеспечить одну или более молекул N-ацетил-галактозамина для PEG использования дендримерного линкера.

Пример 2-3-1-1: Получение моно-NAG-PEG-PHK конструкции

Конструкция PEG-РНК, синтезированная в примере 2-2, вступала в реакцию с реагентом NAG фосфорамидитом (синтезированным в примере 1-1) в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы связать N-ацетил-галактозамин (NAG) с PEG-РНК конструкцией с помощью фосфодиэфирной связи, и таким образом получить 5′ моно-NAG-PEG-PHK структуру (смотри фиг. 8).

Пример 2-3-1-2: Получение тройной NAG-PEG-PHK конструкции

PEG-РНК конструкция, синтезированная в примере 2-2, вступала в реакцию с дендримерным фосфорамидитом (Trebler Phosphoramidte, Glen research, США), и затем реагировала с реагентом NAG фосфорамидитом (синтезированным в примере 1-1) в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы связать три NAG с PEG-PHK конструкцией через фосфодиэфирную связь, и таким образом, получить 5′ тройную-NAG-PEG-PHK конструкцию (смотри фиг. 9).

Пример 2-3-2: Получение фолат-PEG-PHK конструкции

Конструкция PEG-РНК, синтезированная в примере 2-2, вступала в реакцию с амин-фосфорамидитом в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы связать аминогруппу с PEG-РНК конструкцией через фосфодиэфирную связь, и таким образом, получить амин-PEG-РНК-конструкцию. Синтезированная амин-PEG-РНК-конструкция была соединена с NHS-фолатом (синтезированным в примере 1-2) через сложноэфирную связь, чтобы синтезировать 5′ фолат-PEG-РНК-конструкцию (смотри фиг. 10).

Пример 2-3-3: Получение пептид-PEG-PHK конструкции путем модификации амина и пептидного соединения

Была проведена реакция связывания между карбоксильной группой защищенного пептидного соединения, полученного в примере 1-3, и аминогруппой PEG конструкции амин-PEG-PHK, полученной в примере 2-3-2, с использованием ВОР (бензотриазлол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфоний гексафторфосфата) (Sigma Aldrich, США) и НОВТ (1-гидроксибензотриазола) (Sigma Aldrich, США). После реакции связывания продукт реакции обработали пиперидином (Sigma Aldrich, США) для удаления защитной группы, таким образом, получив 5′ пептид-PEG-двуспиральную олиго-РНК конструкцию.

Пример 2-4: Получение 5′ С₂₄-РНК конструкции

Конструкция РНК, комплементарная РНК-последовательности 5′ лиганд-PEG-двуспиральной олиго-РНК конструкции примера 2-3, была синтезирована с помощью метода синтеза РНК примера 2-1, а затем обработана С₂₄ тетракозановым реагентом, содержащим дисульфидную связь, в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы соединить С₂₄ с РНК конструкцией посредством фосфодиэфирной связи, таким образом, получив 5′ С₂₄-РНК конструкцию (смотри фиг. 11).

Пример: 2-5: Восстановление и гибридизация

Каждую из одноцепочечных РНК, синтезированных в примерах 2-1, 2-2, 2-3 и 2-4, обработали 28% (об/об) аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить синтезированные РНК и РНК-конструкции от CPG с последующим снятием защитных групп. Незащищенные 5′ лиганд-PEG-двуспиральные РНК-конструкции и 5′ С₂₄-двуспиральные олиго-РНК-конструкции обработали 10:3:4 (об/об/об) смесью N-метилпирролидона, триэтиламина и триэтиламин тригидрофторида в сушильном шкафу при 70°C, чтобы удалить 2′TBDMS (трет-бутилдиметилселил).

РНК отделяли от реактантов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), и молекулярную массу РНК измеряли с помощью MALDI-TOF MS (SHIMADZU, Япония), чтобы установить, соответствовали ли РНК желаемым нуклеотидным последовательностям и двуспиральным олиго-РНК конструкциям.

Затем, для того, чтобы получить двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую связанный с ней лиганд, связанная с лигандом PEG-РНК смысловая РНК и антисмысловая РНК были смешаны друг с другом в одинаковых количествах, и данную смесь добавили к 1X буферу для гибридизации (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетата калия, 2 мМ ацетата магния, рН 7.0-7.5) и дали возможность прореагировать в водяной бане с постоянной температурой при 90°C в течение 3 минут, а затем дали возможность прореагировать при 37°C, таким образом, получив желаемую двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 5′ концом каждой из цепей. Полученная двуспиральная олиго-РНК, имеющая лиганд, связанный с 5′ концом, была подвергнута электрофорезу для подтверждения гибридизации цепей.

Пример 3: Получение двуспиральной олиго-РНК конструкции, имеющей лиганд, присоединенный к 3′ концу

Амин-CPG синтезировали в 3′ амин-PEG-PHK с использованием реагента PEG фосфорамидита, и затем связали с NHS-лигандом, таким как NHS-фолат примера 1-2 через сложноэфирную связь, и таким образом, получили PEG-двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 3′ концом. Синтезированную PEG-двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 3′ концом, соединили с гидрофобным материалом С₂₄, чтобы образовалась конструкция PEG-PHK-С₂₄, имеющая лиганд, связанный с 3′ концом. PEG-PHK-C₂₄ гибридизовали с комплементарной РНК, чтобы синтезировать двуспиральную олиго-РНК-конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 3′ концом.

Пример 3-1: Получение 3′ амин-PEG-PHK конструкции

Амин-CPG обработали реагентом полиэтиленгликоль фосфорамидит в соответствии с обычным процессом синтеза РНК, чтобы синтезировать 3′ CPG-амин-PEG. 3′ CPG-амин-PEG синтезировали в 3′ CPG-амин-PEG-PHK конструкцию, имеющую желаемую последовательность РНК согласно процессу синтеза РНК примера 2-1 (смотри фиг. 12).

Пример 3-2: Получение 3′ амин-PEG РНК-С₂₄ конструкции

3′ CPG-амин-PEG-PHK конструкцию, синтезированную в примере 3-1, обработали С₂₄ тетракозановым реагентом, содержащим дисульфидную связь согласно обычному процессу синтеза РНК, чтобы соединить С₂₄ с РНК через фосфодиэфирную связь, таким образом, получив 3′ амин-PEG РНК-С₂₄ конструкцию (смотри фиг. 13).

Пример 3-3: Получение PEG РНК-C₂₄ конструкции, имеющей лиганд, связанный с 3′ концом

3′ амин-PEG-PHK-C₂₄ конструкцию, синтезированную в примере 3-2, обработали 28% аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить синтезированную 3′ амин-PEG-двуспиральную олиго-РНК конструкцию и 3′ амин-PEG-РНК-С₂₄ конструкцию от CPG, с последующим снятием защитной группы. Незащищенную 3′ амин-PEG-РНК-C₂₄ конструкцию обработали 10:3:4 (об/об/об) смесью N-метилпирролидона, триэтиламина и триэтиламин тригидрофторида в сушильном шкафу при 70°C, чтобы удалить 2′ TBDMS (трет-бутилдиметилселил). Отделенную 3′ амин-PEG-РНК-С₂₄ структуру соединили с материалом лиганда, таким как NHS-лиганд, с помощью сложноэфирной связи, таким образом, синтезировав PEG-PHK-C₂₄ конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 3′ концом.

Пример 3-3-1: Получение 3′ фолат-PEG-PHK конструкции

Структуру амин-PEG-RNA-C₂₄, синтезированную в Примере 3-2, соединили с NHS-фолатом (синтезированным в примере 1-2) с помощью сложноэфирной связи, чтобы синтезировать 3′ фолат-PEG-РНК-C₂₄ структуру (фиг. 14).

Пример 3-4: Получение комплементарной РНК конструкции

Была синтезирована одноцепочечная РНК, комплементарная последовательности 3′ лиганд-PEG-РНК-C₂₄ конструкции примера 3-3, согласно методу синтеза РНК, представленному в примере 2-1. Синтезированные одноцепочечные РНК обработали 28% аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить синтезированные РНК от CPG, с последующим снятием защитных групп. Незащищенные РНК обработали 10:3:4 (об/об/об) смесью N-метилпирролидона, триэтиламина и триэтиламин тригидрофторида в сушильном шкафу при 70°C, чтобы удалить 2′ TBDMS (2′трет-бутилдиметилселил).

Пример 3-5: Отжиг

Продукты реакции, РНК и 3′ лиганд-PEG РНК-С₂₄ конструкция, были отделены от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC; LC-20A Prominence, SHIMADZU, Япония), а молекулярная масса выделенных веществ была измерен с помощью MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Япония), чтобы установить, соответствовали ли они желательной нуклеотидной последовательности и 3′ лиганд-PEG РНК-С₂₄ конструкцию.

Затем, для того, чтобы получить двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую соединенный с ней лиганд, связанная с лигандом PEG-РНК смысловая РНК и антисмысловая РНК были смешаны друг с другом в одинаковом количестве, и данную смесь добавили к 1X буферу для отжига (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетата калия, 2 мМ ацетата магния, рН 7.0-7.5) и дали возможность прореагировать в водяной бане с постоянной температурой при 90°C в течение 3 минут, а затем дали возможность прореагировать при 37°C, таким образом, получив желаемую двуспиральную олиго-РНК конструкцию, имеющую лиганд, связанный с 3′ концом каждой из цепей. Полученная двуспиральная олиго-РНК, имеющая лиганд, связанный с 3′ концом, была подвергнута электрофорезу для подтверждения гибридизации цепей.

Пример 4: Образование наночастиц, состоящих из двуспиральных олиго-РНК конструкций с прикрепленным к ним лигандом

Двуспиральные олиго-РНК конструкции с лигандом на 5′ конце и двуспиральные олиго-РНК конструкции, имеющие лиганд на 3′ конце, синтезированные в примерах 2 и 3, образуют наночастицу (т.е., мицеллу), состоящую из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций посредством гидрофобного взаимодействия между гидрофобными материалами, соединенными с концами двуспиральных олиго-РНК (смотри фиг. 1). Было проведено измерение размера и критической концентрации мицелл (CMC), а также анализ наночастицы, состоящей из 5′ фолат-лиганд-двуспиральной олиго-РНК (синтезированной в примере 2), с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), чтобы подтвердить образование наночастицы.

Пример 4-1: Измерение размера наночастицы, состоящей из 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций

Размер наночастиц определяли посредством измерения. дзета-потенциала. Конкретнее, 5′ фолат-двуспиральную олиго-РНК структуру растворяли в 1,5 мл DPBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко) в концентрации 50 мкг/мл и затем гомогенизировали с помощью ультразвука (Wiseclean, DAIHAN, Корея) (700 W; амплитуда: 20%). Размер гомогенизированных наночастиц измеряли с помощью прибора Zetasizer (Nano-ZS, MALVERN, GB) при следующих условиях: индекс рефракции: 1.459, показатель поглощения: 0.001, температура растворителя PBS (фосфатно-буферный солевой раствор: 25°C, вязкость при температуре: 1.0200; и индекс рефракции: 1.335. При каждом измерении снимали 20 показателей, каждое измерение повторяли три раза.

Было обнаружено, что размер наночастиц (фолат-SAMiPHK), состоящих из фолат-связанных двуспиральных олиго-РНК конструкций, составлял около 100-200 нм. Более низкое значение коэффициента полидисперсности (PDI) показывает более равномерное распределение частиц. Было определено, что значение PDI фолат-SAMiPHK составляет менее, чем 0,4, что подтверждает, что были образованы наночастицы, имеющие относительно одинаковый размер. Было обнаружено, что размер наночастиц, состоящих из таких конструкцию, подходит для захвата клетками эндоцитозом (Nanotoxicology: nanoparticals reconstruct lipids.Nat Nanotechnol. 2009 Feb; 4(2): 84-5) (смотри фиг. 15(A)).

Пример 4-2: Измерение критической концентрации мицелл наночастиц, состоящих из двуспиральных олиго-РНК конструкций

Амфифильный материал, содержащий и олеофильную группу и гидрофильную группу в молекуле, может действовать как поверхностно-активное вещество. При растворении поверхностно-активного вещества в водном растворе гидрофобные молекулы двигаются по направлению внутрь, чтобы избежать контакта с водой, и гидрофильные молекулы двигаются по направлению наружу, таким образом, образуя мицеллу. Концентрация, при которой формируется мицелла, определяется как критическая концентрация мицелл (CMC). Способ измерения CMC с использованием флуоресцентного красителя основан на быстром изменении наклона на графике интенсивности флуоресценции флуоресцентного красителя до и после образования мицеллы.

Для измерения критической концентрации мицелл наночастиц, состоящих из фолат-связанных двуспиральных олиго-РНК конструкций, в качестве флуоресцентного красителя использовали 0,04 мМ DPH (1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен, Sigma Aldrich, США). 1 нмоль/мкл 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК, синтезированных в примере 2, серийно разбавляли DPBS от 0,0977 мкг/мл до 50 мк/мл, таким образом, получая 180 мкл каждого образца 5′ фолат-двуспиральной олиго-РНК конструкций. Для приготовления образца добавили 20 мкл 0,04 мМ DPH в метаноле и метанола отдельно в качестве контроля и хорошо перемешали. Затем провели гомогенизацию с использованием соникатора (Wiseclean, DAIHAN, Корея), так же, как описано в примере 4-1 (700 W; амплитуда: 20%). Дали возможность каждому из образцов прореагировать при комнатной температуре и в защищенных от света условиях в течение 24 часов, а затем измерили интенсивность флуоресценции (возбуждение: 355 нм, излучение: 428 нм, верхний показатель). Измеренную интенсивность флуоресценции использовали для определения относительной интенсивности флуоресценции. Была вычислена относительная интенсивность флуоресценции ([интенсивность флуоресценции образца, содержащего DPH]-[интенсивность флуоресценции образца, содержащего только метанол]) при той же самой концентрации и графически показана на Y-оси в виде функции log значения концентрации 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций (ось X) (смотри фиг. 15(B)).

Интенсивность флуоресценции, измеренная при различных концентрациях, увеличивается по мере увеличения концентрации, и точка, в которой концентрация увеличивается быстро, является CMC концентрацией. Таким образом, диапазон низкой концентрации, при котором флуоресценция не увеличивалась, и диапазон высокой концентрации, при котором интенсивность флуоресценции увеличивалась, были разделены на несколько точек, чтобы провести линии тренда, при этом значение на оси X, при котором две линии тренда пересекались друг с другом, было определено как CMC концентрация (фиг. 15(B)). Измеренная CMC фолат-двуспиральной олиго-РНК конструкции была очень низкой (1.33 мк/мл), означая, что фолат-SAMiPHK легко может образовывать мицеллы при очень низкой концентрации.

Пример 4-3: Исследование двуспиральной олиго-РНК конструкции с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ)

Морфологию наночастиц, образованных фолат-двуспиральными олиго-РНК конструкциями, исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ).

Точнее говоря, фолат-двуспиральные олиго-РНК конструкции растворили в DPBS (физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко) до окончательной концентрации 100 нг/мл, а затем гомогенизировали соникатором (Wiseclean, DAIHAN, Корея) (700 W; амплитуда: 20%). Наночастицы, образованные фолат-двуспиральными олиго-РНК конструкциями, исследовали с помощью негативного окрашивания материалом с высокой электронной плотностью. Размер наночастиц, исследованных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), был сходен с размером наночастиц, измеренных в примере 4-1, что означает, что наночастицы легко образовывались.

Пример 5; Доставка in vitro связанных с лигандом двуспиральных РНК конструкций

Для того, чтобы проверить, демонстрируют ли наночастицы (фолат-SAMiPHK) состоящие из 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций, синтезированных в примере 2, улучшенные эффекты двуспиральных олиго-РНК in vitro, клетки линии KB, сверхэкспресирующие фолатный рецептор, культивировали в присутствии или в отсутствие фолата без трансфекции. В результате было обнаружено, что присоединенный лиганд увеличивал эффективность внутриклеточной доставки SAMiPHK, и что SAMiPHK проявлял ингибирование экспрессии гена-мишени.

Пример 5-1: Культивирование линии опухолевых клеток

Клетки носоглоточной эпидермальной карциномы человека (линия клеток KB), купленные в Американской коллекции типовых культур (АТСС), культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фолат (Gibco, США), с добавлением 10% (об/об) FBS, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при условиях 37°C и 5% (об/об) CO₂.

Пример 5-2: Трансфекция линии опухолевых клеток фолат-SAMiPHK

Опухолевые клетки (1,3×10⁵ клеток/лунку), выращенные в примере 5-1, культивировали в среде RPMI-1640 без фолата в 6-луночных планшетах в течение 18 часов при условиях, описанных в примере 5-1, затем среду удаляли и добавляли такое же количество среды Opti-MEM в каждую лунку.

Наночастицы (SAMiPHK-Sur), состоящие из двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащие последовательность SEQ ID NO: 1, которые ингибируют экспрессию гена-мишени сурвивина, наночастицы (SAMiPHK-Con), состоящие из двуспиральных олиго-РНК-полимерных конструкций, содержащих контрольную последовательность SEQ ID NO: 2, и наночастицы (Folate-SAMiPHK-Sur), состоящие из связанных с фолатным лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1, растворяли в DPBS в концентрации 50 мкг/ мл в соответствии с методом, описанным в примере 4-1, и гомогенизировали ультразвуком, таким образом, получая гомогенизированные наночастицы, состоящие из таких конструкций.

Были созданы условия с избыточным количеством фолата в Opti-MEM среде (для этого к среде был дополнительно добавлен фолат для содержания 1 мМ фолата), и условия, при которых фолат дополнительно не добавлялся. Затем, клетки обработали 200 нМ каждого из образцов и культивировали при условиях 37°C и 5% (об/об) СО₂ в течение 48 часов.

Пример 5-3: Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина

Тотальную РНК экстрагировали из линии трансфицированных клеток примера 5-2, синтезировали в кДНК, а затем количественно определяли относительный уровень экспрессии сурвивина с помощью ПЦР в режиме реального времени в соответствии с методом, описанным в Корейской открытой патентной публикации №2009-0042297.

SAMiPHK-Con - это тестовая группа, обработанная наночастицами, состоящими из двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащих контрольную последовательность SEQ ID NO: 2, и SAMiPHK-Sur - это тестовая группа, обработанная наночастицами, состоящими из двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина). Фолат-SAMiPHK-Sur - это тестовая группа, обработанная наночастицами, состоящими из фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1 (последовательность сурвивина).

Степень ингибирования экспрессии целевой мРНК представляла собой уровень экспрессии гена-мишени в тестовой группе, обработанной каждым из SAMiPHK-Sur и фолат-SAMiPHK-Sur, относительно уровня экспрессии гена-мишени в тестовой группе, обработанной SAMiPHK-Con, и определялась посредством относительного количественного определения (смотри фиг. 16).

В том случае, когда в среде присутствовало избыточное количество фолата, можно было наблюдать, что фолатный рецептор в линии клеток KB был насыщен избыточным количеством фолата, и таким образом, эффект оказания содействия внутриклеточной интернализации фолатным лигандом, связанным с SAMiPHK, был скрыт, показывая, что фолатный лиганд влияет на эффективность внутриклеточной доставки SAMiPHK, чтобы играть решающую роль в ингибировании мРНК экспрессии гена-мишени.

В случае с группой, обработанной SAMiPHK-Sur, не наблюдалось значительного различия в ингибировании гена-мишени между наличием и отсутствием фолата, однако, в случае с группой, обработанной фолат-SAMiPHK-Sur, ингибирование экспрессии гена-мишени было в два раза выше при отсутствии фолата, чем в присутствии фолата. Другими словами, когда имелось избыточное количество фолата, не наблюдалось изменения ингибирующего эффекта экспрессии гена-мишени присоединенным фолатным лигандом, однако, при отсутствии фолата наблюдалось увеличение ингибирующего эффекта экспрессии гена-мишени присоединенным фолатным лигандом.

Таким образом, видно, что наночастицы, состоящие из связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций, демонстрируют увеличенную эффективность внутриклеточной доставки и повышенное ингибирование гена-мишени в клетках со сверхэкспрессией рецептора лиганда.

Пример 6: In vivo доставка связанной с лигандом двуспиральной олиго-РНК конструкции

Для того, чтобы проверить, увеличивают ли наночастицы (фолат-SAMiPHK), состоящие из 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций, синтезированных в примере 2, эффект двуспиральных олиго-РНК в условиях in vivo, наночастицы вводили мышам с опухолью из клеток линии KB, сверхэкспрессирующих фолатный рецептор, и были исследованы эффекты доставленных фолат-SAMiPHK и SAMiPHK на ингибирование экспрессии гена-мишени в опухолевой ткани.

Пример 6-1: Получение модели KB-ксенотрансплантата

Клетки линии KB, культивированные в примере 5-1, подкожно вводили безтимусным мышам 5-недельного возраста (BALB/C nu) в количестве 1×10⁶ клеток. Наблюдали за ростом опухоли после инъекции, измеряя длину и ширину опухоли с 2-дневными интервалами, и было отмечено, что опухоль вырастала до объема около 150-200 мм³ через 2 недели после инъекции.

Пример 6-2: Связанные с лигандом двуспиральные олиго-РНК конструкции и введение связанных с лигандом двуспиральных олиго-РНК конструкций

Для введения моделям KB-ксенотрансплантатов, полученным в примере 6-1, 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций, содержащие последовательность SEQ ID NO: 1, синтезированные в примере 2, и двухцепочечные РНК конструкции, не имеющие связанного с ними лиганда, были гомогенизированы, как описано в примере 4-1, при этом были получены гомогенизированные наночастицы, состоящие из двуспиральных олиго-РНК конструкций. Гомогенизированные наночастицы вводили один раз в хвостовую вену мышей с KB-ксенотрансплантатом (n=4) в дозе 5 мг/кг веса тела), и опухолевую ткань собирали через 48 или 72 часа после введения. Тотальную РНК экстрагировали из собранной опухолевой ткани и синтезировали в кДНК, а затем количественно определяли относительный уровень экспрессии сурвивина с помощью ПЦР в режиме реального времени в соответствии с методом, описанным в Корейской открытой патентной публикации №2009-0042297.

На фиг. 17, PBS - тестовая группа с введением одного растворителя в качестве отрицательного контроля, SAMiPHK - тестовая группа с введением наночастиц, состоящих из двуспиральных олиго-РНК конструкций, не имеющих связанного с ними лиганда, и фолат-SAMiPHK - тестовая группа с введением наночастиц, состоящих из 5′ фолат-двуспиральных олиго-РНК конструкций.

Ингибирущий эффект на экспрессию гена-мишени SAMiPHK был выше через 72 часа после введения, чем через 48 часов после введения. Ингибирование экспрессии гена-мишени в группе с введением связанной с лигандом конструкции (Фолат-SAMiPHK) составляло 160% через 48 часов после введения и 120% через 72 часа после введения.

Таким образом, видно, что двухцепочечная РНК конструкция, имеющая связанный с ней фолатный лиганд, быстро доставляется in vivo в опухолевые клетки-мишени, сверхэкспрессирующие фолатный рецептор, так что эффект двуспиральных олиго-РНК улучшается, причем этот эффект сохраняется даже с течением времени.

Пример 7: Получение конъюгата ASO-полимер

В примерах настоящего изобретения был использован ASO сурвивина, для ингибирования сурвивина (Biol. Proced. Online 2004; 6(1): 250-256). Сурвивин является белком, который обычно экспрессируется в большинстве опухолей или линий мутантных клеток, исследованных к настоящему времени, и потенциально является важной мишенью противоопухолевой терапии (Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8): 917-921, 1997).

ASO, используемые в следующих примерах, представляют собой сурвивин-специфические последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 3, и контрольную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 4.

(SEQ ID NO: 3) сурвивин ASO (ISIS 23722), 5-TGTGCTATTCTGTGAATT-3

(SEQ ID NO: 4) перетасованный (scrambled) контроль (ISIS 28598), 5-TAAGCTGTTCTATGTGTT-3

Последовательности ASO были синтезированы путем соединения нуклеотидов фосфодиэфирными связями остовов ДНК с использованием β-цианоэтилфосфорамидита (Shina et al. Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984).

В процессе синтеза ASO цикл, состоящий из деблокирования, соединения, кэппирования и окисления, был повторен на твердой подложке (CPG) с присоединенным к ней нуклеозидом, и, таким образом, получена желательная последовательность ДНК.

Конкретнее, на стадии деблокирования, являющейся первой стадией, CPG, имеющую соединенный с ней нуклеозид, обрабатывают 3% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) для удаления ДМТ (4,4′-диметокситритила). На стадии соединения, которая является следующей стадией, цепи нуклеотидов соединяют друг с другом путем реакции связывания между 5′-гидроксильной группой, образованной на CPG в предыдущей стадии, и мономером нуклеозид фосфорамидита, имеющим желаемую последовательность. На стадии кэппирования, являющейся третьей стадией, 5′-гидроксильная группа, которая не прореагировала на стадии соединения, блокируется, для того, чтобы ограничить формирование нуклеотидной цепи, имеющей нежелательную последовательность нуклеотидов, на стадии соединения следующего цикла. На стадии кэппирования непрореагировавшая 5′-гидроксильная группа подвергается ацетилированию обработкой уксусным ангидридом и N-метилимидазолом. На стадии окисления, которая является завершающей стадией, фосфотетраэфирная связь между 5′-гидроксильной группой и фосфорамидитом, образованная на стадии соединения, превращается в фосфодиэфирную связь. На этой стадии окисления фосфотетраэфирную связь обрабатывают 0,02 M окисляющим раствором (0.02 M-I2 в ТНР/пиридин/Н₂О), чтобы превратить фосфат в фосфат. Ряд процессов синтеза ASO был проведен с использованием синтезатора ДНК (384 Synthesizer, BIONEER, Корея).

В процессе синтеза конъюгата ASO-полимер (3′PEG-ASO-5′липид), ASO был синтезирован с помощью стадий деблокирования, соединения, кэппирования и окисления из 3′ PEG-CPG подложки, имеющей гидрофильный материал PEG на 3′ конце и С₂₄ гидрофобный материал тетракозан, содержащий дисульфидную связь, присоединенный к 5′ концу, таким образом, был получен желательный конъюгат ASO-полимер (смотри Корейскую открытую патентную публикацию №2009-0042297).

Кроме того, с целью получения 3′лиганд-PEG-ASO-5′липида PEG был присоединен к CPG, имеющей функциональную группу, такую как соединенная с ней аминогруппа, с использованием реагента PEG фосфорамидита с помощью процесса, состоящего из стадий деблокирования, соединения, кэппирования и окисления, а С₂₄ гидрофобный материал тетракозан, содержащий дисульфидную связь, был присоединен к 5′ концу, и таким образом, получен 3′-функциональная группа-PEG-ASO-5′-липид, к которому может быть присоединен желаемый липид. После завершения синтеза продукт реакции обработали 28% (об/об) аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить конъюгат ASO-полимер, к которому может быть присоединен лиганд, от CPG. Затем, лиганд был соединен с конъюгатом с помощью функциональной группы, и таким образом получен конъюгат ASO-полимер (3′ лиганд-PEG-ASO-5′липид).

При этом, для того, чтобы синтезировать конъюгат ASO-полимер (3′липид-ASO-5′PEG), ASO был синтезирован на CPG, имеющей функциональную группу, такую как аминогруппа, с помощью процесса, состоящего из стадий деблокирования, соединения, кэппирования и окисления, и PEG был присоединен к 5′ концу с использованием PEG фосфорамидита, и таким образом был получен конъюгат функциональная группа-ASO-гидрофильный полимер. После завершения синтеза конъюгата функциональная группа-ASO-гидрофильный полимер продукт реакции обработали 28% (об/об) аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить конъюгат функциональная группа-ASO-гидрофильный полимер от CPG, и затем гидрофобный материал был соединен с конъюгатом через функциональную группу, и таким образом был получен конъюгат ASO-полимер, имеющий присоединенные к нему желательные гидрофильный и гидрофобный материалы. Затем, конъюгат ASO-полимер был отделен и очищен от реактантов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Япония), а молекулярная масса ASO и конъюгата ASO-полимер была измерена с помощью MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Япония), чтобы установить, была ли получена нужная нуклеотидная последовательность.

Пример 8: Синтез конъюгата ASO-полимер, модифицированного фосфотиоатом

Использованный в этом примере ASO был получен путем замещения фосфатной группы остова ДНК фосфотиоатной группой с получением S-олиго и связывания этих S-олиго фосфотиоатными связями.

Конкретнее, ASO, содержащий S-олиго, был синтезирован с помощью процесса, включающего стадии деблокирования, соединения, кэппирования и окисления, при этом стадия окисления проводилась путем обработки 0,1 M сульфидирующим реагентом вместо 0,02 M окисляющего раствора. С помощью этого процесса синтеза ASO были синтезированы модифицированные фосфотиоатом ASO, имеющие последовательности SEQ ID NOS: 3 и 4 (Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). Остальные этапы процесса синтеза, использованные в этом примере, были одинаковыми с использованными в примере 7.

Для того, чтобы синтезировать ASO, в котором 4 нуклеотида на обоих концах (5′ и 3′ концах) были модифицированы 2-ОСН₃ (метокси), был синтезирован нуклеозид на участке, модифицированном в форме 2′-ОСН₃-ДНК, с использованием 2′-OCH₃-DNA-цианоэтил фосфорамидита [rA(Bz), rC(Ас), rG(ibu), rU], чтобы заместить основную цепь ДНК фосфотиолатом, и затем, как описано выше, основная цепь ДНК была синтезирована путем соединения S-олиго через фосфотиолатные связи.

Для того, чтобы получить фосфотиолат-модифицированный коннъюгат ASO-полимер, конъюгат ASO, модифицированный фосфотиолатом, был синтезирован на 3′PEG-CPG подложке с помощью цикла, содержащего стадии деблокирования, соединения, кэппирования и окисления, как известно в данной области техники (смотри Корейскую открытую патентную публикацию №2009-0042297), и затем С₂₄ гидрофобный материал тетракозан, содержащий дисульфидную связь был присоединен к 5′ концу, и таким образом был получен желаемый модифицированный фосфотиолатом конъюгат ASO-полимер.

Кроме того, для того, чтобы присоединить лиганд к концу гидрофильного материала модифицированного фосфотиолатом конъюгата ASO-полимер, функциональная группа, к которой может быть присоединен лиганд, была присоединена к 3′ CPG, и затем гидрофильный материал был соединен с CPG, была проведена описанная выше реакция, и таким образом получен конъюгат ASO-полимер, к которому может быть присоединен лиганд.

После завершения синтеза конъюгата ASO-полимер продукт реакции был обработан 28% (об/об) аммонием на водяной бане при 60°C, чтобы отделить ASO и конъюгат ASO-полимер от CPG. Затем, конъюгат ASO-полимер был выделен и очищен от реагентов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Япония), и молекулярная масса ASO и конъюгата ASO-полимер была измерен с помощью MALDI TOF-MS (SHIMADZU, Япония), чтобы установить была ли получена нужная нуклеотидная последовательность (смотри фиг. 19).

Пример 9: Оценка стабильности конъюгата ASO-полимер при условиях, имитирующих условия in vivo

Для того, чтобы проверить, была ли увеличена стабильность конъюгатов ASO-полимер, синтезированных и выделенных в примерах 7 и 8, по сравнению с исходными ASO, не имеющими присоединенного к ним полимера, был проведен следующий эксперимент. ASO, не имеющий присоединенного к нему полимера, и конъюгат ASO-полимер инкубировали в среде, содержащей 30 и 50% (об/об) FBS (фетальной бычьей сыворотки), которая имитировала условия in vivo, в течение 0, 3, 5, 7 и 10 дней, а затем исследовали деградацию конъюгата ASO-полимер сравнительно с исходным ASO с помощью электрофореза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

В результате, конъюгат ASO-полимер был стабильным независимо от концентрации FBS, даже если PEG была отделена от ASO с течением времени, тогда как стабильность ASO, не имеющий соединенного с ним полимера, начинал убывать через 3 дня.

Пример 10: Исследование физических свойств наночастицы, состоящей из конъюгатов ASO-полимер

Конъюгаты ASO-полимер образуют наночастицу, состоящую из конъюгатов ASO-полимер, путем взаимодействия между гидрофобными материалами, присоединенными к концам ASO (смотри фиг. 18). Размер и критическая концентрация мицелл (CMC) наночастиц, состоящих из конъюгатов ASO-полимер, измеряли посредством измерения дзета-потенциала.

Пример 10-1: Измерение наночастиц, состоящих из конъюгатов ASO-полимер Размер наночастиц, состоящих из конъюгатов ASO-полимер, полученных в примере 8 и содержащих последовательность SEQ ID NO: 3, был измерен посредством измерения дзета-потенциала. Конкретнее, 50 мкг конъюгатов ASO-полимер растворили в 1 мл DPBS (фосфатно-буферный солевой раствор Дульбекко), и затем гомогенизировали ультразвуком (Wiseclean, DAIHAN, Корея) (700 W; амплитуда: 20%). Размер гомогенизированных наночастиц был измерен с помощью устройства для измерения дзета-потенциала (Nano-ZS, MALVERN, Англия) при следующих условиях: индекс рефракции: 1.454, индекс абсорбции показатель поглощения: 0.001, температура воды как растворителя: 25°C. При каждом измерении снимали 20 показателей, каждое измерение повторяли три раза.

Было обнаружено, что наночастицы, образованные конъюгатами ASO-полимер, имели размер 100-200 нм и коэффициент полидисперсности (PDI) менее, чем 0,4 (смотри фиг. 20(A)). Более низкое значение коэффициента полидисперсности (PDI) показывает более равномерное распределение частиц. Таким образом, видно, что наночастицы, образованные из конъюгатов ASO-полимер, имеют относительно однородный размер, подходящий для поглощения клетками путем эндоцитоза (Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4: 84-85, 2009).

Пример 10-2: Измерение критической концентрации мицелл, состоящих из конъюгатов ASO-полимер

Амфифильный материал, содержащий и олеофильную группу и гидрофильную группу в молекуле, может действовать как поверхностно-активное вещество. При растворении поверхностно-активного вещества в водном растворе гидрофобные молекулы двигаются по направлению внутрь, чтобы избежать контакта с водой, и гидрофильные молекулы двигаются по направлению наружу, таким образом, образуя мицеллу. Концентрация, при которой формируется мицелла, определяется как критическая концентрация мицелл (CMC). Способ измерения CMC с использованием флуоресцентного красителя основан на быстром изменении наклона на графике интенсивности флуоресценции флуоресцентного красителя до и после образования мицеллы.

Для измерения критической концентрации мицелл наночастиц, состоящих из конъюгатов ASO-полимер, в качестве флуоресцентного красителя использовали 0,04 мМ DPH (1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен, Sigma Aldrich, США). 1 нмоль/мкл конъюгатов ASO-полимер, содержащих последовательность SEQ ID NO: 3, серийно разбавляли DPBS от 0,0977 мкг/мл до 50 мк/мл, таким образом, получая 180 мкл каждого образца конъюгатов ASO-полимер. Для приготовления образца добавили 20 мкл 0,04 мМ DPH в метаноле и метанола отдельно в качестве контроля и хорошо перемешали. Затем провели гомогенизацию с использованием соникатора (Wiseclean, DAIHAN, Корея), так же, как описано в примере 10-1 (700 W; амплитуда: 20%). Дали возможность каждому из гомогенизированных образцов прореагировать при комнатной температуре в защищенных от света условиях в течение 24 часов, а затем измерили интенсивность флуоресценции (возбуждение: 355 нм, излучение: 428 нм, верхнее снятие показаний). Измеренную интенсивность флуоресценции использовали для определения относительной интенсивности флуоресценции. Была вычислена относительная интенсивность флуоресценции ([интенсивность флуоресценции образца, содержащего DPH]-[интенсивность флуоресценции образца, содержащего только метанол]) при той же самой концентрации и графически показана на Y-оси в виде функции log значения концентрации конъюгатов ASO-полимер (ось X) (смотри фиг. 20(В)).

Интенсивность флуоресценции, измеренная при различных концентрациях, увеличивается по мере увеличения концентрации, и точка, в которой концентрация увеличивается быстро, является CMC концентрацией. Таким образом, диапазон низкой концентрации, при котором флуоресценция не увеличивалась, и диапазон высокой концентрации, при котором интенсивность флуоресценции увеличивалась, были разделены на несколько точек, чтобы провести линии тренда, при этом значение на оси X, при котором две линии тренда пересекались друг с другом, было определено как CMC концентрация. Измеренная CMC конъюгатов ASO-полимер была очень низкой (1.56 мк/мл), означая, что наночастицы, образованные из конъюгатов ASO-полимер, могут легко образовывать мицеллы при очень низкой концентрации.

Пример 11: Ингибирование экспрессии гена-мишени в линии опухолевых клеток с помощью конъюгата ASO-полимер и трансфицирующего реагента

Каждый из числа ASO, не имеющего соединенного с ним полимера, и конъюгата ASO-полимер, полученного в примере 8, был трансфицирован в линию клеток колоректального рака человека (SW480), а затем были проанализированы паттерны экспрессии сурвивина в трансфицированных опухолевых клетках.

Пример 11-1: Культивирование линии опухолевых клеток

Клетки колоректального рака человека (SW480), полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), культивировали в среде для роста (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США), с добавлением 10% (об/об) FBS, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при условиях 37°C и 5% (об/об) диоксида углерода (CO₂).

Пример 11-2: Трансфекция опухолевых клеток конъюгатом ASO-полимер

ASO, не омеющий связанного с ним полимера, и конъюгат ASO-полимер, полученный в примере 8, были трансфицированы в клетки колоректального рака человека (SW480), затем были исследованы паттерны экспрессии сурвивина в трансфицированных опухолевых клетках.

Опухолевые клетки, выращенные в примере 11-1, культивировали в среде для роста (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США) в 6-луночном планшете при плотности клеток 1.3×10⁵ в течение 18 часов при условиях, описанных в примере 11-1, затем среду удаляли, и к каждой лунке добавляли 800 мкл среды Opti-MEM (модифицированная минимальная среда Игла, GIBCO/Invitorgen; США).

При этом 2 мкл Lipofectamine™ 2000 и 198 мкл среды Opti-MEM смешали и дали возможность прореагировать при комнатной температуре в течение 5 минут. Продукт реакции обработали 25 пмоль/мкл каждого из конъюгатов ASO-полимер, полученных в примерах 7 и 8, до окончательной концентрации 10, 50 и 100 нМ, и затем дали возможность прореагировать при комнатной температуре в течение 20 минут, таким образом получив, растворы для трансфекции.

Затем, 200 мкл каждого раствора для трансфекции добавили в каждую лунку, содержащую опухолевые клетки и Opti-MEM, потом клетки культивировали в течение 6 часов, с последующим удалением среды Opti-MEM. Затем, в каждую лунку добавили 2,5 мл ростовой среды (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США), и культивировали клетки в течение 24 часов при условиях 37°C и 5% (об/об) диоксида углерода (СО₂).

Пример 11-3: Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина

Тотальную РНК экстрагировали из трансфицированных клеток примера 11-2 и синтезировали в кДНК, а затем уровень мРНК гена сурвивина был относительно количественно определен с помощью ПЦР в режиме реального времени в соответствии с методом, описанным в Корейской открытой патентной публикации №2009-0042297. (смотри фиг. 21).

Чтобы проанализировать ингибирующие экспрессию гена-мишени эффекты ASO, не имеющего конъюгированного с ним полимера, и конъюгата ASO-полимер, клетки были трансфицированы каждым из ASO и конъюгатом ASO-полимер вместе с трансфицирующим реагентом, и затем были проанализированы уровни экспрессии мРНК гена сурвивина в клетках. В результате, было обнаружено, что ингибирование экспрессии гена сурвивина конъюгатом ASO-полимер было сходно с действием ASO, не имеющим конъюгированного с ним полимера, что говорит о том, конъюгированный полимер не затрагивает механизм действия ASO.

Пример 12: Ингибирование экспрессии гена-мишени в линии опухолевых клеток с помощью конъюгата ASO-полимер

Каждый из конъюгатов ASO-полимер, полученных в примерах 7 и 8, был трансфицирован в клетки колоректального рака человека (SW480), а затем были проанализированы паттерны экспрессии сурвивина в трансфицированной линии опухолевых клеток.

Пример 12-1: Культивирование линии опухолевых клеток

Линию клеток колоректального рака человека (SW480), полученную из Американской коллекции типовых культур (АТСС), культивировали в среде для роста (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США), с добавлением 10% (об/об) FBS, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при условиях 37°C и 5%(об/об) диоксида углерода (СО₂).

Пример 12-2: Трансфекция опухолевых клеток конъюгатом ASO-полимер

Линию опухолевых клеток, выращенных в примере 12-1, культивировали в среде для роста (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США) в 6-луночном планшете при плотности клеток 1.3×10⁵ в течение 18 часов при условиях, описанных в примере 5-1, затем среду удаляли и к каждой лунке добавляли 800 мкл среды Opti-MEM.

100 мкл среды Opti-MEM и 5, 10 или 100 мкл (500 нМ, 1 мкМ или 10 мкМ) каждого из конъюгатов ASO-полимер (1 нмоль/мкл), полученных в примерах 1 и 2, смешивали и гомогенизировали ультразвуком (Wiseclean, DAIHAN, Корея) таким же образом, как описано в примере 4-1 (700 W; амплитуда: 20%), таким образом, получив растворы для трансфекции, содержащие гомогенизированные наночастицы, образованные из конъюгатов ASO-гидрофобный материал.

Затем, к каждой лунке, содержащей опухолевые клетки и Opti-MEM, добавили 100 мкл каждого раствора для трансфекции, и клетки культивировали в течение 24 часов, потом добавили 1 мл 20% FBS-содержащей среды (среда Лейбовица L-15, GIBCO/Invitorgen; США). Затем, клетки дополнительно культивировали в течение 24 часов при условиях 37°C и 5% (об/об) двуокиси углерода (СО₂). Таким образом, клетки культивировали всего в течение 48 часов после обработки конъюгатом ASO-полимер.

Пример 12-3: Определение относительного количества мРНК гена сурвивина

Тотальную РНК экстрагировали из линии трансфицированных клеток примера 12-2, синтезировали в кДНК, а затем уровни мРНК гена сурвивина были относительно количественно определены с помощью ПЦР в режиме реального времени в соответствии с методом, описанным в Корейской открытой патентной публикации №2009-0042297.

Сравнили ингибирование экспрессии мРНК гена сурвивина не имеющим конъюгированного с ним полимера ASO и конъюгатом ASO-полимер при условиях без содержания трансфекционного реагента. В результате, видно, что ASO-полимер ингибировал экспрессию гена-мишени при относительно низкой концентрации по сравнению с неконъюгированным ASO при условиях без содержания трансфекционного реагента.

Таким образом, видно, что конъюгаты ASO-полимер, синтезированные в настоящем изобретении, или наночастицы, состоящие из конъюгатов ASO-полимер, доставляются в клетки даже в условиях без содержания трансфекционного реагента, таким образом, что ASO ингибирует экспрессию гена-мишени.

Промышленная применимость

Как описано выше, новая конструкция олигонуклеотида согласно настоящему изобретению и содержащая его фармацевтическая композиция может очень эффективно и полезно использоваться для лечения рака и инфекционных болезней.

Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на характерные особенности, специалистам в данной области техники ясно, что это описание представляет только предпочтительный вариант осуществления и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, фактический объем настоящего изобретения будут определяться прилагаемыми пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая конструкцию терапевтическое средство-полимер для доставки олигонуклеотида, наночастицу для доставки олигонуклеотида, содержащую вышеуказанное терапевтическое средство-полимер, конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер для доставки антисмыслового олигонуклеотида, наночастицу для доставки антисмыслового олигонуклеотида, содержащую вышеуказанный конъюгат ASO-полимер и способ получения конъюгата ASO-полимер. Изобретение расширяет арсенал средств, позволяющих обеспечить доставку олиго-РНК в организм. 5 н. и 22 з.п. ф-лы, 21 ил., 12 пр.

1. Конструкция терапевтическое средство-полимер для доставки олигонуклеотида со структурой согласно следующей формуле (1), содержащая соединенный с ней лиганд:
Формула 1
L-A-X-R-Y-B
в которой А представляет собой гидрофильный материал; В представляет собой гидрофобный материал; X и Y каждый независимо друг от друга представляет собой простую ковалентную связь; R представляет собой олигонуклеотид; и L является рецептор-специфичным лигандом, обладающим способностью усиливать интернализацию клеткой-мишенью путем рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), который выбран из фолата, N-ацетилгалактозамина и маннозы.

2. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 1, в которой олигонуклеотид содержит двухспиральную олиго-РНК.

3. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 2, в которой двуспиральная олиго-РНК состоит из 19-31 нуклеотидов.

4. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 1, в которой гидрофобный материал имеет молекулярную массу 250-1,000.

5. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 4, в которой гидрофобный материал выбирают из группы, состоящей из производного стероидов, производного глицеридов, эфира глицерина, полипропиленгликоля, С₁₂-С₅₀ ненасыщенного или насыщенного углеводорода, диацил-фосфатидилхолина, жирной кислоты, фосфолипида и липополиамина.

6. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 5, в которой стероидное производное выбирают из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестеринформиата, холестанилформиата и холестаниламина.

7. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 5, в которой производное глицерида выбирают из числа моно-, ди- и триглицеридов.

8. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 1, в которой гидрофильный материал имеет молекулярную массу 200-10000.

9. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 8, в которой гидрофильный материал выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона и полиоксазолина.

10. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 1, в которой ковалентная связь является неразрушаемой связью или разрушаемой связью.

11. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 10, в которой неразрушаемая связь является амидной связью или фосфатной связью.

12. Конструкция терапевтическое средство-полимер по п. 10, в которой разрушаемую связь выбирают из группы, состоящей из дисульфидной связи, связи, разрушаемой кислотой, сложноэфирной связи, ангидридной связи, биодеградируемой связи или связи, разрушаемой ферментативным путем.

13. Наночастица для доставки олигонуклеотида, содержащая конструкцию терапевтическое средство-полимер по любому из пп. 1-12.

14. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер для доставки антисмыслового олигонуклеотида со структурой, представленной следующей формулой 5:
Формула 5
A-X-R-Y-B
в которой один из А и В является гидрофильным материалом, а другой является гидрофобным материалом, X и Y каждый, независимо друг от друга, представляют собой простую ковалентную связь, а R представляет собой ASO.

15. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 14, в котором ASO состоит из 10-50 олигонуклеотидов.

16. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 14, в котором гидрофильный материал имеет молекулярную массу 200-10000.

17. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 16, в котором гидрофильный материал выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона и полиоксазолина.

18. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 14, в котором гидрофобный материал имеет молекулярную массу 250-1,000.

19. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 18, в котором гидрофобный материал является или С₁₂-С₅₀ углеводородом или холестерином.

20. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 14, в котором ковалентная связь является неразрушаемой связью или разрушаемой связью.

21. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 20, в котором неразрушаемая связь является амидной связью или фосфатной связью.

22. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид (ASO)-полимер по п. 20, в котором разрушаемую связь выбирают из группы, состоящей из дисульфидной связи, связи, разрушаемой кислотой, сложноэфирной связи, водородной связи, биодеградируемой связи или связи, разрушаемой ферментативным путем.

23. Конъюгат антисмысловой олигонуклеотид ASO-полимер по п.14, где конъюгат дополнительно содержит лиганд, соединенный с гидрофильным материалом конъюгата ASO-полимер.

24. Способ получения конъюгата ASO-полимер, данный способ содержит стадии:
(a) ковалентного присоединения гидрофильного материала к твердой подложке;
(b) синтеза ASO на твердой подложке, содержащей гидрофильный материал;
(c) ковалентного присоединения гидрофобного материала к 5′ концу ASO на твердой подложке; и
(d) отделения и очистки полученного конъюгата ASO-полимер от твердой подложки.

25. Способ получения конъюгата ASO-полимер, данный способ содержит стадии:
(a) синтеза ASO на твердой подложке, имеющей присоединенную к ней функциональную группу;
(b) ковалентного присоединения гидрофильного материала к 5′ концу ASO;
(c) отделения связанного с гидрофильным материалом конъюгата ASO от твёрдой подложки; и
(d) ковалентного присоединения гидрофобного материала к 3′ концу ASO, отделенного от твердой подложки.

26. Наночастица для доставки антисмыслового олигонуклеотида, содержащая конъюгат ASO-полимер, по любому из пп. 14-23.

27. Наночастица по п.26, дополнительно содержащая лиганд, который связан с конъюгатом ASO-полимер.