СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИФАБУТИНА В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЯХ Российский патент 2016 года по МПК G01N27/26 G01N33/15 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области фармацевтики, в частности к способам количественного анализа лекарственных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известен способ определения рифабутина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (EUROPEAN PHARMACOPOEIA 6th EDITION).

В статье Domingo Blanco Gomis et al. High speed liquid chromatography for in-process control of rifabutin. // Analytica Chimica Acta., 2005, 531: 105-10 приведены характеристики способа определения рифабутина методом ВЭЖХ: диапазон линейности градуировочного графика 5÷50 мг/л, предел количественного определения - 0,4 мг/л. Недостаток этого способа состоит в узком диапазоне линейности градуировочного графика.

Общий недостаток известных способов определения рифабутина методом ВЭЖХ состоит в том, что они не позволяют определять количество рифабутина и белков/аминокислот в образце за один этап (по одной хроматограмме).

Из статьи Medikondu Kishore, М. Jayaprakash, T. Vijayabhaskara Reddy. Development of new spectrophotometric methods for the quantitative determination of rifabutin in pharmaceutical formulation. // International Journal of Pharma. Research and Development. 2010, 2(10):49-5 известен способ определения рифабутина методом спектрофотометрии. Недостаток этого способа состоит в низкой чувствительности, недостаточной селективности, невозможности определения примесного состава.

Между тем, в связи с разработкой новых препаратов рифабутина возникает задача точного и быстрого определения количественного содержания рифабутина и вспомогательных компонентов в фармацевтических композициях сложного состава, в частности, в композициях, содержащих рифабутин, солюбилизированный альбумином (см., например, ЕА 013569), которая не может быть решена известными способами без устранения указанных недостатков.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача настоящего изобретения состоит в разработке экспрессного и экономичного способа, который позволял бы количественно определять рифабутин и такие компоненты, как альбумин и аминокислоты, в один этап в широком диапазоне концентраций методом нормировки по площадям пиков.

Технический результат состоит в том, что, как неожиданно было установлено, метод капиллярного зонного электрофореза позволяет одновременно количественно определять и рифабутин и компоненты, подобные альбумину и аминокислотам, в широком диапазоне концентраций последних, при этом диапазон линейности градуировочного графика намного выше, чем у ранее применявшихся методов, основанных на ВЭЖХ, что позволяет сократить количество измерений стандартных растворов при построении градуировочного графика, избежать применения сложных математических моделей при обработке результатов измерений, исключить необходимость в сильном разбавлении пробы. Кроме того, разрешающая способность капиллярного зонного электрофореза в отношении обычных примесей рифабутина выше, чем у методов, основанных на ВЭЖХ.

Предложен способ определения рифабутина методом капиллярного зонного электрофореза. Способ основан на прямой регистрации в ультрафиолетовой области спектра пиков на электрофореграмме, соответствующих катионной или анионной формам рифабутина. Варьирование кислотности используемых растворов ведущих электролитов и введение в их состав раствора гидроксипропил-β-циклодекстрина позволяют решать следующие задачи: количественное определение рифабутина с высокой эффективностью, одновременное определение рифабутина и альбумина на одной электрофореграмме, установление количества примесей в рифабутине с одновременным определением их общего процентного содержания методом нормировки.

Поставленная задача решена благодаря тому, что в предложенном способе определения рифабутина в образце с неизвестным содержанием рифабутина и, необязательно, других компонентов (в анализируемом образце), в котором используют:

(а) прибор для проведения капиллярного зонного электрофореза, оснащенный термостатируемой камерой для капилляра, капилляром, оптическим детектором, средствами записи результатов измерений, средствами ввода образца;

(б) электролит, в котором

капилляр заполняют электролитом (б), вводят анализируемый образец в капилляр с помощью средств ввода образца, измеряют и записывают электрофореграмму (величину или изменение поглощения в зависимости от времени осуществления электрофореза) посредством оптического детектора, характеризующийся тем, что в нем содержание рифабутина и, необязательно, других компонентов в анализируемом образце определяют по зависимости площади пиков рифабутина и, необязательно, других компонентов на электрофореграммах, полученных в тех же условиях, с применением растворов с заранее известными концентрациями рифабутина и, необязательно, других компонентов в качестве анализируемых образцов.

В одном из частных вариантов осуществления упомянутые другие компоненты представляют собой альбумин.

В еще одном частном варианте осуществления упомянутый другой компонент представляет собой N-ацетил-L-триптофан.

В другом частном варианте осуществления термостатирование капилляра осуществляют при значении температуры, выбранном из диапазона 15÷30°С, предпочтительно из диапазона 19÷25°С, особенно предпочтительно при температуре 20°С.

В предпочтительной форме осуществления термостатирование капилляра в способе осуществляют с точностью ±0,5°С, особенно предпочтительно с точностью ±0,1°С и выше.

В еще одной предпочтительной форме осуществления напряжение на капилляре составляет от +15 до +25 киловольт, предпочтительно +20 киловольт.

В одной из предпочтительных форм осуществления в способе используют прибор (а) с гидродинамическим вводом пробы.

В другой предпочтительной форме осуществления анализируемый образец вводят при 30 бар в течение 5 с.

В одной из форм осуществления в качестве электролита (б) используют буфер с рН 9,0÷10,7, предпочтительно 10,0 с общей молярной концентрацией 0,01÷0,1, предпочтительно 0,05 М.

В предпочтительной форме осуществления в качестве электролита (б) используют карбонатный буфер.

В еще одной форме осуществления перед применением электролит (б) и/или анализируемый образец центрифугируют при 10000÷30000 g, предпочтительно при 16000 g, по меньшей мере, 1 минуту, предпочтительно, по меньшей мере, 4 минуты.

В другой форме осуществления поглощение измеряют при длине волны 220÷310 нанометров, предпочтительно 254 нанометра.

В еще одной форме осуществления в качестве электролита используют ацетатный буфер с рН 4,7, который содержит гидроксипропил-β-циклодекстрин в количестве 10 мМ.

В другой форме осуществления количество рифабутина и/или других компонентов определяют методом нормировки. Метод нормировки заключается в нахождении суммы площадей всех пиков, которую принимают за 100%, и в определении доли площади, которая приходится на каждый пик в отдельности.

Предлагаемый способ может применяться для входного и выходного контроля рифабутина в фармацевтических композициях и субстанциях.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 представлена электрофореграмма определения рифабутина в лекарственном средстве «Микобутин». Система капиллярного электрофореза «Капель-105М» (см. пример 1 ниже).

На фиг. 2 представлена электрофореграмма лекарственной водорастворимой наносомальной лекарственной формы рифабутина на основе человеческого сывороточного альбумина (лиофилизат). Система капиллярного электрофореза «Капель-105М» (см. пример 3 ниже).

На фиг. 3 представлена электрофореграмма модельного раствора субстанции рифабутина, производитель Luohe Nanjiecun Pharmaceutical Group Pharmacy Co., LTD, Китай. На электрофореграмме пик основного вещества и 5 примесей разделены (см. пример 5 ниже).

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

ПРИМЕР 1

Определение содержания рифабутина в лекарственном средстве «Микобутин» (Pfizer Italia S.r.L., Италия).

К навеске содержимого капсулы (10÷20 мг) добавляют 1 мл этилового спирта и центрифугируют, используя центрифугу типа 5415R (Eppendorf, Германия). Условия центрифугирования (16000 g, 15°С, 5 мин). Далее аликвотную часть (10÷100 мкл) надосадочного раствора переносят во входную пробирку прибора и доводят дистиллированной водой до общего объема жидкости 500 мкл.

Использовали систему капиллярного электрофореза «Капель 105М», оборудованную спектрофотометрическим детектором. Используется кварцевый капилляр (внутренний диаметр 75 мкм, эффективная длина 50 см). Программное обеспечение «Эльфоран». Термостатирование капилляра +20°С; напряжение на капилляре +20 кВ; ввод пробы гидродинамический, 30 бар, 5 с. Время анализа - 10 мин. Используют водный раствор ведущего электролита: карбонатный буфер рН 10, общая молярная концентрация 0,05 М. Перед применением раствор электролита центрифугируют, используя центрифугу типа 5415R (Eppendorf, Германия). Условия центрифугирования (16000 g, 15°С, 5 мин). Срок хранения ведущего электролита - не более 3 суток.

Градуировку проводили по модельным растворам стандартного образца рифабутина (European Pharmacopeia Reference Standard), градуировочный график строили по 5 точкам. Метрологические характеристики способа приведены в таблице 1. Результаты определения приведены в таблице 2. Контролем служило определение рифабутина в той же пробе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Электрофореграмма определения рифабутина в лекарственном средстве «Микобутин» приведена на фиг. 1.

ПРИМЕР 2

Определение содержания рифабутина в лекарственном средстве «Микобутин» (ООО «Озон», Россия).

Аналогично примеру 1.

ПРИМЕР 3

Определение содержания рифабутина в водорастворимой наносомальной лекарственной форме рифабутина на основе человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) (лиофилизат).

Аналогично примеру 1. Отличается тем, что пробоподготовка проводится по следующей схеме: содержимое флакона с лиофилизатом количественно переносят в мерную колбу объемом 250 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор в количестве 500 мкл переносят во входную пробирку прибора.

Электрофореграмма пробы показана на фиг. 2. На пробе присутствуют три пика, относящиеся к рифабутину, альбумину и N-ацетил-L-триптофану. Идентификацию пиков проводили по рифабутину (European Pharmacopeia Reference Standard), лиофилизованному порошку человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) (Sigma-Aldrich, США) и N-ацетил-L-триптофану (European Pharmacopeia Reference Standard, Sigma-Aldrich, США). Градуировку для рифабутина проводили аналогично примеру 1. Градуировку по альбумину проводили по лиофилизованному порошку человеческого сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США). График строили по 5 точкам. Метрологические характеристики для способа определения альбумина: коэффициент корреляции линейной зависимости 0,9998, область линейности градуировочного графика от 5 и 1100 мкг/мл, предел количественного определения 0,05 мкг/мл. Эффективность определения ЧСА в примере соответствует 14200 теоретическим тарелкам. Результат определения ЧСА в образце - 109 мг.

ПРИМЕР 4

Определение содержания субстанция рифабутина, производитель Luohe Nanjiecun Pharmaceutical Group Pharmacy Co., LTD, Китай.

Аналогично примеру 1. Отличается тем, что 12 мг порошка субстанции (точная навеска) растворяют в 5 мл этилового спирта. Для анализа во входную пробирку прибора переносят аликвотную часть спиртового раствора (от 10 до 100 мкл) и доводят дистиллированной водой до общего объема жидкости 500 мкл.

ПРИМЕР 5

Определение общего содержания примесей в субстанции рифабутина, производитель Luohe Nanjiecun Pharmaceutical Group Pharmacy Co., LTD, Китай.

Аналогично примеру 4. Отличается тем, что используется ацетатный буфер с рН 4,7, содержащий гидроксипропил-β-циклодекстрин (10 мМ). Для анализа во входную пробирку прибора переносят аликвотную часть спиртового раствора не менее 20 мкл и доводят дистиллированной водой до общего объема жидкости 500 мкл. Определение проводят при длине волны 254 нм; время анализа - 20 мин. Результаты определения приведены в таблице 2. Контролем служило определение общего процентного содержания примесей методом нормировки в той же пробе по методу ВЭЖХ. Определяли также общее процентное содержание примесей в стандартном образце рифабутина (European Pharmacopeia Reference Standard), оно составило 0,36%. Электрофореграмма пробы показана на фиг. 3.

Изобретение относится к области фармацевтики, в частности к способам количественного анализа лекарственных средств. Способ касается определения рифабутина в образце с неизвестным содержанием рифабутина и, необязательно, других компонентов (анализируемом образце), в котором используют: (а) прибор для проведения капиллярного зонного электрофореза, оснащенный термостатируемой камерой для капилляра, капилляром, оптическим детектором, средствами записи результатов измерений, средствами ввода образца; (б) электролит; в котором капилляр заполняют электролитом (б), вводят анализируемый образец в капилляр с помощью средств ввода образца, измеряют и записывают электрофореграмму (величину или изменение поглощения в зависимости от времени осуществления электрофореза) посредством оптического детектора, характеризующийся тем, что в нем содержание рифабутина и, необязательно, других компонентов в анализируемом образце определяют по зависимости площади пиков рифабутина и, необязательно, других компонентов на электрофореграммах, полученных в тех же условиях, с применением растворов с заранее известными концентрациями рифабутина и, необязательно, других компонентов в качестве анализируемых образцов. Метод капиллярного зонного электрофореза позволяет одновременно количественно определять и рифабутин, и компоненты, подобные альбумину и аминокислотам, в широком диапазоне концентраций последних, при этом диапазон линейности градуировочного графика намного выше, чем у ранее применявшихся методов, основанных на ВЭЖХ, что позволяет сократить количество измерений стандартных растворов при построении градуировочного графика, избежать применения сложных математических моделей при обработке результатов измерений, исключить необходимость в сильном разбавлении пробы. 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Способ определения рифабутина в образце с неизвестным содержанием рифабутина и, необязательно, человеческого сывороточного альбумина и N-ацетил-L-триптофана в анализируемом образце, в котором используют:
(а) прибор для проведения капиллярного зонного электрофореза, оснащенный термостатируемой камерой для капилляра, капилляром, оптическим детектором, средствами записи результатов измерений, средствами ввода образца;
(б) электролит, в качестве которого используют карбонатный буфер или ацетатный буфер с рН 4,7, который содержит гидроксипропил-β-циклодекстрин в количестве 10 мМ;
капилляр заполняют электролитом (б), вводят анализируемый образец в капилляр с помощью средств ввода образца, измеряют и записывают электрофореграмму (величину или изменение поглощения в зависимости от времени осуществления электрофореза) посредством оптического детектора, характеризующийся тем, что в нем содержание рифабутина и, необязательно, других компонентов в анализируемом образце определяют по зависимости площади пиков рифабутина и, необязательно, других компонентов на электрофореграммах, полученных в тех же условиях, с применением растворов с заранее известными концентрациями рифабутина и, необязательно, других компонентов в качестве анализируемых образцов.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что термостатирование капилляра осуществляют при значении температуры, выбранном из диапазона 15÷30°С, предпочтительно из диапазона 19÷25°С, особенно предпочтительно при температуре 20°С.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в нем термостатирование капилляра осуществляют с точностью ±0,5°С, особенно предпочтительно с точностью ±0,1°С и выше.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем напряжение на капилляре составляет от +15 до +25 киловольт, предпочтительно +20 киловольт.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем используют прибор (а) с гидродинамическим вводом пробы.

6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в нем анализируемый образец вводят при 30 бар в течение 5 с.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем в качестве электролита (б) используют буфер с рН 9,0÷10,7, предпочтительно 10,0, с общей молярной концентрацией 0,01÷0,1, предпочтительно 0,05 М.

8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем перед применением электролит (б) и/или анализируемый образец центрифугируют при 10000÷30000 g, предпочтительно при 16000 g, по меньшей мере, 1 минуту, предпочтительно, по меньшей мере, 4 минуты.

9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем поглощение измеряют при длине волны 220÷310 нанометров, предпочтительно 254 нанометра.

10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в нем количество рифабутина и/или других компонентов определяют методом нормировки.