СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОБЪЕКТА ПУТЕМ ПОСТРОЕНИЯ ЕГО ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКОГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ Российский патент 2008 года по МПК G01N27/447 

Изобретение относится к областям медицины, экологии, токсикологии и пищевой промышленности, а в частности, к способам получения характеристических профилей различных биологических объектов (моча, плазма и сыворотка крови, структуры мозга, слезная жидкость) и объектов природного происхождения (чай, вино, листья, хвоя) на основе одновременного определения конкретных групп биологически активных веществ методами капиллярного зонного или мицеллярного электрофореза. Химические образы, специфичные для каждого объекта, и использование их для выявления отклонений от «нормы» основаны на сравнении характеристических профилей, соответствующих некоторому объекту («норма»). В профильном анализе не менее важным является число пиков и их соотношение, кроме того, для диагностики наряду с известными пиками химических соединений можно использовать информацию о неизвестных веществах.

Наиболее успешно заявляемое изобретение может быть использовано для проведения экспресс-диагностики различных патологий, связанных с работой сердечно-сосудистой, эндокринной и нервной систем (по профилю и соотношениям компонентов биологических объектов), например, гипертензия характеризуется повышенным содержанием норадреналина и/или адреналина, феохромоцитома - повышенным содержанием дофамина. Получение характеристического профиля продукта питания (чай, кофе, вино, кока-кола) по полифенольным соединениям дает возможность выявления фальсификации (при проведении идентификации сортов), контроля качества и способов хранения исследуемого продукта. Кроме того, изменение концентрации полифенолов в растительном сырье (листья, хвоя) - диагностический маркер неблагоприятной экологической ситуации.

Проведение многокомпонентного химического анализа возможно хроматографическими и электрофоретическими методами. Процедура получения характеристического профиля должна быть стандартизирована.

Известен способ получения стероидных профилей в режиме капиллярной электрохроматографии с детектором с лазер-индуцированной флуоресценцией (ЛИФ) и масс-спектрометрическим детектированием (Amy H. Que et al. Steroid profiles determined by capillary electrochromatography, laser-induced fluorescence detection and electrospray-mass spectrometry // J.Crom. A. 2000. V.887. P.379-391).

Известный способ осуществляется с помощью дорогостоящей аппаратуры и требует предварительной дериватизации стероидных гормонов - реакцией с дансилгидразином, что значительно увеличивает общее время анализа.

Известен способ построения алгоритма диагностики эндокринных заболеваний на основе стероидных профилей мочи, полученных в режиме капиллярной газовой хроматографии (Е.Н. Орлов, Н.Н. Николаев, Е.М. Антипов, Л.А. Чмож, О.В. Макаров. Диагностическое значение стероидных профилей мочи // Пробл. эндокр. 1995. Т.41. №2. С.35-38; Е.Н.Орлов, Е.М. Антипов, Н.Н. Николаев. Некоторые аспекты получения стероидных профилей мочи // Вопросы медицинской химии. 1993. №5. С.7-9).

Известен способ определения стероидного профиля методом высокоэффективной газовой хроматографии (ВЭГХ) с использованием аналитического комплекса LZD-STEROIDS на базе газового хроматографа (http://lzi.com.ua).

В известных способах осуществляют предварительный перевод стероидных гормонов в более летучие и стабильные производные, что требует дополнительных затрат времени и усилий.

Известен способ получения «отпечатков пальцев» экстракта из листьев гинкго (Ginkgo biloba) (Yi-Bing Ji et al. Development, optimization and validation of a fingerprint of Ginkgo biloba extracts by high-performance liquid chromatography // J.Chrom. A. 2005. V.1066. P.97-104; A.M. van Nederkassel et al. Development of a Ginkgo biloba fingerprint chromatogram with UV and evaporative light scattering detection and optimization of the evaporative light scattering detector operating conditions // J.Chrom. A. 2005. V.1085. P.230-239).

В известном способе используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с довольно редким детектором светорассеяния для идентификации и оценки качества данной биологически активной добавки (Ginkgo biloba).

Известен способ получения «отпечатков пальцев» лекарственного растения Сафлор (Flos carthami) методом капиллярного зонного электрофореза с УФ-детектированием с целью идентификации и оценки соответствия лекарственного растения, используемого в китайской медицине для лечения гиперимии, сердечно-сосудистых заболеваний, тромбоза и высокого содержания холестерина (Y. Sun et al. Fingerprint analysis of Flos Carthami by capillary electrophoresis // J.Chrom. B. 2003. V.792. P.147-152).

Совокупность существенных признаков известного способа наиболее близка к заявляемому и поэтому он выбран в качестве прототипа.

В известном способе используют метод капиллярного зонного электрофореза, получают характеристический электрофоретический профиль неизвестных органических соединений, идентификацию электрофоретических сигналов не проводят.

Известный способ осуществляется с помощью дорогостоящей аппаратуры. Предварительное концентрирование не используется.

Техническим результатом, полученным при осуществлении заявляемого способа, является экспрессность, простота, информативность (т.к. заявляемый способ предполагает идентификацию характеристических компонентов), повышение эффективности и селективности разделения характеристических компонентов объекта, и что наиболее важно, снижение предела обнаружения, позволяющее получать электрофоретические профили на уровне нг/мл.

Сущность заявляемого способа идентификации объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля заключается в алгоритме проведения многокомпонентного анализа биологических объектов (включая нейтральные и ионогенные компоненты пробы, относящиеся к разным классам органических веществ) в режимах зонного или мицеллярного капиллярного электрофореза с использованием различных вариантов on-line и off-line обогащения пробы для повышения чувствительности детектирования аналитов.

Оптимизация условий электрофоретического анализа заключается в выборе состава, рН и концентрации буферного электролита, концентрации комплексообразующих агентов и органических растворителей и органических добавок, влияющих на разрешение, эффективность и чувствительность метода.

Комплексообразователи используются как при электрофоретическом разделении, так и в процессе пробоподготовки.

Концентрирование компонентов пробы on-line (стэкинг) осуществляется непосредственно в кварцевом капилляре в процессе электрофоретического разделения; off-line - в ходе пробоподготовки, твердофазной или жидкостной экстракции.

В этом заключается совокупность существенных признаков, обеспечивающая достижение технического результата.

Заявляемый способ идентификации объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля осуществлен методом капиллярного электрофореза на отечественной системе «КАПЕЛЬ-105» с фотометрическим детектором (190-400 нм) с использованием капилляра длиной 500-700 мм, диаметром 50-75 мкм, напряжение на электродах 18-22 кВ.

Ниже приведены примеры реализации способа согласно изобретению.

ПРИМЕР 1.

Характеристический профиль чая получают на основе одновременного определения кофеина, важнейших полифенолов (катехина, эпикатехина, эпигаллокатехина, эпигаллокатехин галлата, галлокатехин галлата, эпикатехин галлата) и галловой кислоты в режиме мицеллярного капиллярного электрофореза с использованием прибора «Капель 105» (ООО «НПФ ЛЮМЭКС», г.Санкт-Петербург) с УФ детектором (длина волны 210 нм). В состав рабочего электролита входит: 20-30 ммоль/л фосфатного буферного раствора (рН 6.0-7.5), 22-28 ммоль/л додецилсульфата натрия (ПАВ, в качестве мицеллообразователя, увеличивающего селективность разделения аналитов за счет специфических взаимодействий) и 3-8%-ный раствор ацетонитрила (органическая добавка, повышающая эффективность и разрешение, а также снижающая время анализа в 2 раза). В данном случае имеет место стэкинг с усилением поля, основанный на разнице в электропроводности зоны пробы и рабочего электролита (состав пробы).

Пробоподготовку проводят следующим образом. Отбирают пробу анализируемого образца чая, вносят ее в термостойкий сосуд и заливают кипящей водой (температура в пределах 80-90°С). Сосуд помещают в водяную баню на 5-10 мин, образующийся чайный настой периодически помешивают. Полученный водный экстракт отбирают, остужают, центрифугируют и фильтруют. Ориентируясь на содержание искомых компонентов выше 200 мг/л, при приготовлении анализируемого образца, разбавляют фильтрат в 2-5 раз. Затем приготовленный раствор чайного настоя вводят в капилляр общей длиной 600 мм, диаметром 75 мкм. Время ввода - 10 с, давление - 30 мбар.

Для проведения количественного определения компонентов пробы строится градуировочная зависимость площади пика от концентрации аналита по каждому компоненту пробы. Погрешность определения составляет 5-10%.

На фигурах 1 и 2 представлены характеристические электрофоретические профили экстрактов зеленого чая (образец X) и черного чая (образец Y) соответственно. Проведена идентификация компонентов: 1 - кофеин, 2 - катехин, 3 - эпигаллокатехин, 4 -эпигаллокатехин галлат, 5 - эпикатехин, 6 - галловая кислота, 7 - галлокатехин галлат, 8 - эпикатехин галлат.

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет быстро и с высокой достоверностью проводить идентификацию образца (с целью выявления сортности и качества продукции) по характеристическому профилю и осуществлять количественное определение кофеина, катехинов и галловой кислоты.

ПРИМЕР 2

Характеристический профиль мочи для диагностики психических, нервных и опухолевых заболеваний, получают на основе определения органических ароматических соединений с амино-группами (дофамин, норадреналин, адреналин, метанефрин, норметанефрин) в режиме капиллярного зонного электрофореза с использованием прибора «Капель 105» (ООО «НПФ ЛЮМЭКС», г.Санкт-Петербург) с УФ-детектированием. В состав рабочего электролита входит: 1%-ный раствор уксусной кислоты, 30-40 ммоль/л триэтаноламина. С целью снижения пределов обнаружения аналитов используют: концентрирование в ходе твердофазной экстракции на модифицированном обращенно-фазовом сорбенте С18 и стэкинг с большим вводом пробы 80-90 с под давлением 30 мбар.

Для анализа собирают суточную мочу с консервантом - раствор соляной кислоты (10 мл 6 н раствора HCl). 10 мл суточной мочи пропускают через картридж С18 (масса сорбента С₁₈ 500 мг), модифицированный раствором додецилсульфата натрия (40 ммоль/л). Патрон промывают дистиллированной водой (2×2 мл). Сорбировавшиеся амины элюируют 95%-ным раствором метанола. Для концентрирования аналитов элюат выпаривают досуха и перерастворяют в 500 мкл метанола для ввода в систему капиллярного электрофореза КЭ-УФ.

Для проведения количественного определения компонентов пробы строится градуировочная зависимость площади пика от концентрации аналита по каждому компоненту пробы. Погрешность определения составляет 10-15%.

На фигурах 3, 4 представлены характеристические электрофоретические профили экстрактов мочи 2-х пациентов. Проведена идентификация маркеров нервных и опухолевых заболеваний: 9 - дофамин, 10 - норадреналин, 11 - норметанефрин, 12 - адреналин, 13 - метанефрин. Сравнение ведут относительно электрофореграммы, представленной на фигуре 3. Согласно количественной обработке полученных электрофореграмм концентрация дофамина (9) (фигура 4) в 2 раза превышает уровень нормы (фигура 3), при этом фиксируется значительное повышение концентрации метанефрина (13), все это говорит о патологии - опухоль хромаффинных клеток надпочечников «феохромоцитома».

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет быстро и с высокой достоверностью проводить идентификацию образца по характеристическому профилю и осуществлять на его основе диагностику различных заболеваний.

Проведенные научные исследования над заявляемым способом показали, что он может быть применим для идентификации образца по электрофоретическому профилю и использован в областях медицины, экологии, токсикологии, пищевой промышленности.

Способ может быть использован в медицине, экологическом мониторинге, токсикологии и пищевой промышленности, для идентификации объектов (физиологических жидкостей и тканей, растительных и пищевых продуктов) и выявления на основе полученных результатов патологий (биологические объекты) и/или фальсификаций (продукты питания). Способ идентификации сложного объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля по биологически активным соединениям в режимах капиллярного зонного или мицеллярного электрофореза с УФ-детектированием включает концентрирование компонентов пробы сначала в режиме off-line - в ходе пробоподготовки (твердофазной или жидкофазной экстракции), а затем on-line (стэкинг) - непосредственно в кварцевом капилляре в процессе электрофоретического разделения с использованием комплексообразующих агентов, как при пробоподготовке, так и при электрофоретическом разделении. Идентификация объекта основана на сравнении характеристических профилей соответствующих некоторому объекту с «нормой». Изобретение обеспечивает экспрессность, простоту и информативность, а также повышение эффективности и селективности разделения характеристических компонентов объекта и снижение предела обнаружения, позволяющее получать электрофоретические профили на уровне. 4 ил.

Способ идентификации сложного объекта путем построения его характеристического электрофоретического профиля по биологически активным соединениям в режимах капиллярного зонного или мицеллярного электрофореза с УФ-детектированием, отличающийся тем, что проводят концентрирование компонентов пробы сначала в режиме off-line - в ходе пробоподготовки (твердофазной или жидкофазной экстракции), а затем on-line (стэкинг) - непосредственно в кварцевом капилляре в процессе электрофоретического разделения, с использованием комплексообразующих агентов, как при пробоподготовке, так и при электрофоретическом разделении, а идентификация объекта основана на сравнении характеристических профилей, соответствующих некоторому объекту с «нормой».