СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ГЕТЕРОПЛАЗМИИ МУТАЦИЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА Российский патент 2016 года по МПК G01N33/50 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома различных клеток и тканей.

В патологии человека известна ассоциация различных заболеваний с соматическими мутациями митохондриального генома, возникающими в процессе онтогенеза. Митохондриальные мутации ассоциируются с различными патологиями (например, стеноз коронарных сосудов, некоторые формы диабета и глухоты, инфаркт миокарда, кардиомиопатии).

Выявлены некоторые мутации митохондриального генома лейкоцитов крови человека, ассоциированные с атеросклерозом, ишемической болезнью сердца и гипертонической болезнью и обладающие высокой диагностической значимостью в отношении риска развития этих заболеваний.

Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу. Он отличается выраженной нестабильностью, поэтому в нем нередки как наследуемые, так и соматические мутации, возникающие в течение жизни индивида. Пенетрантность и экспрессивность таких мутаций варьируют в широких пределах от семьи к семье и между родственниками по материнской линии и зависят от многих факторов, но главным образом от генотипа и степени гетероплазмии (смеси мутантных и нормальных молекул ДНК).

Система репарации ДНК в митохондриях действует значительно менее эффективно, чем система репарации ядерной. Это приводит к ускоренному (примерно в 10 раз более высокому, чем в ядерной ДНК) накоплению мутаций в митохондриальной ДНК (мтДНК). Мутации мтДНК могут накапливаться в определенной ткани, не затрагивая при этом другие ткани. Как правило, мутации в митохондриальных генах, кодирующих митохондриальные тРНК и белки-компоненты дыхательной цепи, приводят к нарушению синтеза белка в митохондриях, снижают эффективность окислительного фосфорилирования и продукцию АТФ. Однако для своего фенотипического выражения мутация мтДНК должна накопиться в достаточной мере, чтобы превысить определенный пороговый уровень (степень) гетероплазмии. При этом фенотипическое выражение мутации зависит от степени гетероплазмии. Как правило, для возникновения митохондриальной патологии требуется высокое содержание мутантной мтДНК в определенной ткани, превышающее 50-60%. Однако получены данные, что степень гетероплазмии определенных мутаций мтДНК, не превышающая 30-40%, уже значительно повышает риск развития таких возрастных хронических заболеваний, как гипертрофия левого желудочка, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца.

Поскольку степень гетероплазмии мтДНК может значительно варьировать в разных тканях, возникает необходимость создания способов, позволяющих точно измерять содержание мутантной ДНК в анализируемых образцах.

Известны способы детекции и количественного определения степени гетероплазмии, включающие:

- секвенирование ДНК по Сэнгеру (Irwin J.A., Saunier J.L., H., Strouss K.М., Sturk K.A., Diegoli T.M., Parson W., Parsons T.J. Investigation of heteroplasmy in the human mitochondrial DNA control region: a synthesis of observations from more than 5000 global population samples. //J. Mol. Evol. - 2009. - Vol. 68. - pp. 516-527),

- высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) (Meierhofer D., Mayr J.A., Ebner S., Sperl W., Kofler B. Rapid screening of the entire mitochondrial DNA for low-level heteroplasmic mutations. // Mitochondrion. - 2005. - Vol. 5. - pp. 282-296),

- пиросеквенирование (Sazonova M., Budnikov E., Khasanova Z., Sobenin I., Postnov A., Orekhov A. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome. // Atherosclerosis. - 2009. - Vol. 204. - pp. 184-190),

- анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM - high resolution melt profiling) (Dobrowolski S.F., Hendrickx A.T., van den Bosch B.J., Smeets H.J., Gray J., Miller Т., Sears M. Identifying sequence variants in the human mitochondrial genome using high-resolution melt (HRM) profiling. // Hum. Mutat. - 2009. - Vol. 30. - pp. 891-898),

- гель-электрофорез с временным температурным градиентом (TTGE - temporal temperature gradient gel electrophoresis) (Wong L.J., Chen T.J., Tan D.J. Detection of mitochondrial DNA mutations using temporal temperature gradient gel electrophoresis. // Electrophoresis. - 2004. - Vol. 25. - pp. 2602-2610),

- амплификацию рефракторной мутационной системы (ARMS - amplification refractory mutation system) (Bai R.K., Wong L.J.C. Detection and quantification of heteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis: a single-step approach. // Clin. Chem. - 2004. - Vol. 50. - pp. 996-1001),

- эндонуклеазный метод с использованием Surveyor nuclease (Bannwarth S., Procaccio V., Paquis-Flucklinger V. Surveyor Nuclease: a new strategy for a rapid identification of heteroplasmic mitochondrial DNA mutations in patients with respiratory chain defects. // Hum. Mutat. - 2005. - Vol. 25. - pp. 575-582),

- секвенирование следующего поколения (Zaragoza M.V., Fass J., Diegoli M., Lin D., Arbustini E. Mitochondrial DNA variant discovery and evaluation in human cardiomyopathies through next-generation sequencing. // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - p.12295).

Каждое из вышеупомянутых решений обладает определенными недостатками. Например, подходы HRM, HPLC и эндонуклеазный метод хороши для идентификации гетероплазмии, но обладают недостаточной разрешающей способностью для количественного измерения степени гетероплазмии мтДНК. Стратегии пиросеквенирования и секвенирования следующего поколения обладают высокой точностью для количественного определения степени гетероплазмии, однако это дорогостоящие процедуры, эффективные лишь для массового анализа большого числа образцов. Среди известных решений задачи количественного определения степени гетероплазмии, основанные на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), минисеквинирование SnapShot обладает недостаточным разрешением при измерении содержания мутантного аллеля ниже 5%. Стратегии ARMS, которые подразумевают использование интеркалирующего флуоресцентного красителя CYBR Green для количественного определения содержания мутантного аллеля путем проведения аллель-специфического ПЦР в режиме реального времени и определения степени гетероплазмии, в отличие от пиросеквенирования и секвенирования следующего поколения не являются дорогостоящими, но являются оптимальными только для анализа небольших выборок.

Задачей изобретения является создание эффективного способа определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома, простого и доступного для использования в клинической практике.

Технический результат заключается в упрощении и доступности способа определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома.

Это достигается тем, что в заявляемом способе определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома лейкоцитов крови или других клеток по мутациям, локализованным в кодирующих участках мтДНК путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, согласно изобретению полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймеров и TaqMan зондов, вычисляют значение ΔCt - разность пороговых циклов для кривых плавления зондов по комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК; определяют коэффициент эффективности амплификации по формуле E=(R2/R1)^1/C(t), где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы, и рассчитывают степень гетероплазмии мутаций митохондриального генома G по формуле G(%)=100/(l+E^ΔCt).

Осуществление способа

Проводят измерения степени гетероплазмии митохондриального генома лейкоцитов крови или других клеток по мутациям, локализованным в кодирующих участках митохондриального генома с использованием праймеров и TaqMan зондов. Для определения нуклеотидных последовательностей зондов и праймеров используют Кембриджскую последовательность мтДНК человека, версия J01415.2, идентификационный номер GenBank NC_012920 gi: 251831106.

TaqMan зонд подбирают строго на последовательность, содержащую мутантный нуклеотид, с расположением по центру или с небольшими отклонениями от идеального положения. Допускаются последовательности разной длины, но разница температур между праймерами не должна превышать 0,8 градуса; праймер должен садиться на участок, свободный от случайных мутаций; праймер должен садиться на участок, наиболее близко расположенный к месту посадки зонда; праймеры не должны образовывать гибридных структур, димеров и шпилек; зонд должен садиться, по возможности, центральной частью на мутацию; температура плавления зонда должна быть на 3-8 градусов выше, чем у праймера; температура отжига должна быть не менее 63 градусов, зонды не должны образовывать гибридных структур, димеров и шпилек.

Учитывая наличие двух аллелей митохондриального генома (нормального и мутантного) в одной пробе в неизвестном соотношении, доли мутантного аллеля определяют сравнительным анализом пороговых циклов кривых амплификации двух зондов - на нормальный и мутантный участки мтДНК. Пороговый цикл C(t) - это порядковый номер цикла амплификации, в котором флюоресценция от расщепленного зонда превысила значение фоновой флюоресценции, то есть появляется аналитический сигнал. Пороговый цикл обратно коррелирует с логарифмом начального количества ДНК в пробе.

Экспоненциальная стадия ПЦР описывается уравнением Pn=Р0*Еn, где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0

- исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент, Е

- эффективность амплификации.

В идеальных условиях Е=2, то есть на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта. Логарифмирование обеих частей уравнения преобразует его к виду n=-(1/log E)*logP0+logPn/log Е. Пороговым циклом (threshold cycle, C(t)) является такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(t)=const.

Для n=C(t) последнее уравнение принимает вид:

C(t)=-(1/log E)*logP0+logPC(t)/log Е.

Таким образом, значение C(t) прямо пропорционально логарифму количества субстрата, что позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность амплификации и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Выбор уровня пороговой флуоресценции (threshold) позволяет сравнивать результаты различных экспериментов лишь при условии, что PC(t)=const. Таким образом, уровень пороговой флуоресценции PC(t) должен быть одинаков для всех сравниваемых образцов. Репортерная флуоресценция наиболее точно отвечает зависимости, описанной в последнем уравнении, лишь в самом начале детекции экспоненциальной фазы роста флюоресценции. На более поздних этапах вклад стохастических эффектов в кинетику реакции становится все более значительным. Поэтому пороговый уровень флуоресценции выбирают в самом начале экспоненциальной фазы, когда стохастические процессы не столь существенны.

Существует три основных способа выбора уровня пороговой флуоресценции: 1) «на глаз», 2) по превышению над стандартным отклонением кинетической кривой, 3) по второй производной кинетической кривой.

При выборе «на глаз» за пороговый уровень выбирают минимальный уровень флуоресценции, который во всех проведенных с данной парой праймеров реакциях соответствует началу экспоненциальной фазы. Хотя пороговый уровень должен быть как можно ниже, при его достижении реакция амплификации должна уже упорядочиться. На первом цикле экспоненциальной фазы погрешность определения репортерной флуоресценции обычно достаточно высока, в том числе и из-за того, что выбор базовой линии «на глаз» также имеет определенную погрешность.

Выбор порога по превышению над стандартным отклонением кинетической кривой - это установка порога таким образом, чтобы превышение порогового уровня над базовым уровнем (threshold over baseline) было достаточно малым, но уже статистически достоверным. Обычно выбирают значения в диапазоне 8-10 стандартных отклонений. Поскольку стандартное отклонение - это усредненная величина по всей кинетической кривой, то недостатком такого метода является то, что в ряде случаев порог может оказаться слишком низким (когда реакция еще не упорядочилась) или, наоборот, слишком высоким (когда величина стандартного отклонения оказывается высокой).

Перечисленных недостатков лишен способ выбора порога по второй производной кинетической кривой. Однако он программно реализован далеко не во всех приборах. В данном способе из всех изменений уровня флуоресценции за пороговый уровень выбирается наиболее резкий скачок, соответствующий абсолютному максимуму второй производной. Этот способ наименее чувствителен к способу выбора базовой линии и различиям условий реакции. Если управляющая программа прибора способна выбирать порог по второй производной, этим методом рекомендуется пользоваться во всех случаях. Начальная концентрация ДНК в пробе измеряется на АНК (анализаторе нуклеиновых кислот), а на определенном цикле амплификации расчет количества ДНК производят согласно приведенным выше формулам накопления флуоресценции. Расчет доли мутантного ампликона основан на формуле, описывающей ПЦР амплификацию в экспоненциальной фазе реакции:

Xn=X0*(E+l)ⁿ (уравнение 1),

где Xn - количество ПЦР продукта в цикле n, Х0 - начальное количество ДНК, Е - эффективность амплификации. При ПЦР реакции с использованием флуоресцентного красителя накопление данного красителя пропорционально накоплению ПЦР продукта и уравнение (1) может быть представлено как:

Rn=R0*(E+l)ⁿ (уравнение 2).

Таким образом, начальная флуоресценция определяется как:

R0=Rn/(E+l)ⁿ (уравнение 3),

где Rn - интенсивность флуоресценции в цикл n, R0 - теоретическая начальная флуоресценция, которая пропорциональна начальному количеству вносимого ДНК.

Проводится измерение C(t) - точки, в которой флуоресценция достигает значений выше фоновых величин. Далее в уравнении (3) заменяют n на C(t):

R0=RCt/(E+l)^C(t) (уравнение 4).

RCt представляет собой пороговый уровень флюоресценции, который устанавливается для каждой реакции или может быть общим для всех сравниваемых реакций. В этом случае уравнение (4) приобретает вид:

R0=l/(E+l)^C(t) (уравнение 5).

Амплификационная эффективность (Е) каждой реакции подсчитывается по уравнению:

E=(R2/Rl)^1/(Ct2-Ct1) (уравнение 6).

При правильной постановке реакции изменение эффективности равно единице (Е=1). После реакции ПЦР в реальном времени для определения специфичности проведенной реакции выполняется анализ кривых плавления. На специфичность реакции указывает наличие одного специфического пика плавления. Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет сигмоидную форму, описываемую уравнением логистической регрессии. В ней можно выделить три стадии: инициацию, когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой; экспоненциальную стадию, в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР; плато или стадию насыщения.

Расчет степени гетероплазмии с помощью ПЦР-РВ осуществляется следующим образом. Существует теоретическая зависимость соотношения долей нормы и мутации в определении степени гетероплазмии митохондриального генома от ΔCt. Степень гетероплазмии отрицательно коррелирует со значением цикла амплификации. Так как степень гетероплазмии выражается в процентах, то чем меньше значение цикла, тем больше гетероплазмия.

Расчет степени гетероплазмии (G%) производят при помощи вычисления значения ΔCt (разница в циклах между графиками). При этом вводят в расчет параметр эффективности реакции (Е), который вычисляют по формуле: E=(R2/R1)^1/ΔCt, где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы.

Расчет степени гетероплазмии производят по формуле:

G%=100/(l+E^ΔCt).

Примеры осуществления способа

Пример 1. Расчет степени гетероплазмии мутаций мтДНК на примере мутации С3256Т. В качестве входных значений используется Excel-файл выходных данных амплификатора нуклеиновых кислот, содержащий сведения об образцах, каналах детекции и пороговых циклах.

Вычисляют значение ΔCt (разность пороговых циклов для кривых плавления зондов по комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК). Вычисляют коэффициент эффективности амплификации по формуле E=(R2/R1)^1/C(t), где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы. Рассчитывают степень гетероплазмии (G%) по формуле G%=100/(l+E^ΔCt).

R1=334716

R2=l233900

C(t)=2

ΔCt=3,12

E=(1233900/334716)^1/2=l,92

G%=100/(1+1,92^3,12)=11,5%

Итоговый процент гетероплазмии образца по мутации С3256Т составил 11,5%.

Пример 2. Расчет степени гетероплазмии мутаций мтДНК на примере мутации G12315A. В качестве входных значений используется Excel-файл выходных данных амплификатора нуклеиновых кислот, содержащий сведения об образцах, каналах детекции и пороговых циклах.

ΔCt=2,54

R1=204013

R2=958658

C(t)=4

Е=(958658/81842)^1/4=1,85

G%=100/(1+1,85^2,54)=17,3%

Итоговый процент гетероплазмии образца по мутации G12315A составил 17,3%.

Пример 3. Расчет степени гетероплазмии мутаций мтДНК на примере мутации G13513A. В качестве входных значений используется Excel-файл выходных данных амплификатора нуклеиновых кислот, содержащий сведения об образцах, каналах детекции и пороговых циклах.

ΔCt=6,33

R1=272737

R2=1566982

C(t)=3

Е=(1566982/272737)^1/3=1,79

G%=100/(1+1,79^6,33)=2,5%

Итоговый процент гетероплазмии образца по мутации G13513A составил 2,5%.

Пример 4. Расчет степени гетероплазмии мутаций мтДНК на примере мутации G13513A. В качестве входных значений используется Excel-файл выходных данных амплификатора нуклеиновых кислот, содержащий сведения об образцах, каналах детекции и пороговых циклах.

ΔCt=l,22

R1=248404

R2=1845587

C(t)=3

E=(1845587/248404)^1/3=l,95

G%=100/(1+1,95^1,22)=30,7%

Итоговый процент гетероплазмии образца по мутации G13513A составил 30,7%.

Пример 5. Расчет степени гетероплазмии мутаций мтДНК на примере мутации G15059A. В качестве входных значений используется Excel-файл выходных данных амплификатора нуклеиновых кислот, содержащий сведения об образцах, каналах детекции и пороговых циклах.

ΔCt=5,29

Rl=83579

R2=1022031

C(t)=4

E=(1022031/83579)^1/4=1,87

G%=100/(1+1,87^5,29)=3,5%

Итоговый процент гетероплазмии образца по мутации G15059A составил 3,5%.

Таким образом, применение двухканальной системы детекции с использованием TaqMan зондов и формулы расчета степени гетероплазмии делает заявляемый способ простым и доступным для использования в клинической практике.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома. Проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени, вычисляют значение ΔCt, определяют коэффициент эффективности амплификации и рассчитывают степень гетероплазмии мутаций митохондриального генома по формуле. Изобретение обеспечивает простой и доступный для использования в клинической практике способ определения гетероплазмии мутаций митохондриального генома. 5 пр.

Способ определения степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома лейкоцитов крови или других клеток по мутациям, локализованным в кодирующих участках мтДНК путем проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, отличающийся тем, что полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймеров и TaqMan зондов, вычисляют значение ΔCt - разность пороговых циклов для кривых плавления зондов, комплементарных нормальным или мутантным участкам ДНК; определяют коэффициент эффективности амплификации по формуле E=(R2/Rl)^1/C(t), где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы, и рассчитывают степень гетероплазмии мутаций митохондриального генома (G) по формуле: G(%)=100/(l+E^ΔCt).