Способ многопараметрического определения предрасположенности к атеросклерозу и его клиническим проявлениям Российский патент 2018 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения степени индивидуального генетического риска атеросклероза и его клинических проявлений, таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС) и инфаркт миокарда (ИМ).

При заболеваниях и патологиях человека имеется связь с различными дефектами митохондриального генома (точечными мутациями в кодирующих областях генов ферментов, транспортных РНК и рибосомальных РНК). В последние годы установлено, что некоторые мутации митохондриального генома ассоциированы с хроническими неинфекционными заболеваниями, например атеросклерозом и его клиническими проявлениями - ишемической болезнью сердца, инфарктом миокарда.

Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу. Он отличается выраженной нестабильностью, поэтому в нем нередки как наследуемые, так и соматические мутации, возникающие в течение жизни индивида. Митохондриальная ДНК накапливает мутации более чем в десять раз быстрее по сравнению с ядерным геномом; это связано с тем, что мтДНК лишена защитных гистонов, а ее окружение богато реактивными формами кислорода, являющимися побочным продуктом метаболических процессов, протекающих в митохондриях; кроме того, восстановительные механизмы мтДНК малоэффективны по сравнению с ядерной ДНК. Пенетрантность и экспрессивность мутаций мтДНК варьируют от семьи к семье и между родственниками по материнской линии и зависят от многих факторов, но главным образом от генотипа и степени гетероплазмии (смеси мутантных и нормальных молекул ДНК).

Как правило, патогенные мутации в митохондриальных генах приводят к нарушению синтеза белка в митохондриях, снижают эффективность окислительного фосфорилирования и продукцию АТФ. Для своего фенотипического выражения патогенная мутация мтДНК должна накопиться в достаточной мере, чтобы превысить определенное пороговое значение гетероплазмии (показателя, характеризующего долю мутантных молекул мтДНК в общем пуле мтДНК в клетке или ткани). Фенотипическое проявление мутации зависит от степени гетероплазмии. Как правило, для возникновения выраженной митохондриальной патологии требуется высокое содержание мутантной мтДНК в определенной ткани, превышающее 50-60% от общего пула мтДНК. При этом степень гетероплазмии определенных патогенных мутаций мтДНК, не превышающая 20-40%, уже значительно повышает риск развития таких хронических неинфекционных заболеваний, как гипертрофия левого желудочка, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца.

Известен способ диагностики предрасположенности к ишемической болезни сердца, заключающийся в сравнении количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК в образце крови больного субъекта с аналогичным уровнем в образце крови контрольного субъекта, не страдающего атеросклерозом. При этом определяют количественную степень повреждений митохондриальной ДНК методом количественной ПЦР, где ДНК обрабатывают гликозилазой FAPY до указанного уровня ПЦР-амплификации.

(Патент РФ №2243558, МПК G01N 33/48, опубл. 27.12.2004 г.)

Однако в известном решении исследуются крупные приобретенные делеции митохондриальной ДНК, то есть качественные изменения, что недостаточно для обеспечения точности диагностики.

Известен также способ оценки генетического риска атеросклероза, взятый за прототип, на основе определения вариантов митохондриального генома, заключающийся в выявлении варианта мтДНК A1811G, свидетельствующего о высоком генетическом риске, и вариантов мтДНК Т204С, G8251A, Т10238С, G12501A, свидетельствующих о низком генетическом риске.

(Патент РФ №2592233, МПК G01N 33/50, опубл. 20.07.2016 г.)

Однако данный способ не описывает количественные показатели гетероплазмии, суммарную мутационную нагрузку митохондриального генома, пороговые значения и диагностические характеристики, описываемые в заявляемом изобретении.

Задачей изобретения является создание эффективного способа многопараметрического определения предрасположенности к атеросклерозу и его клиническим проявлениям, позволяющего на ранних этапах выявлять развитие болезни и принимать адекватные меры для профилактики и своевременного лечения.

Технический результат изобретения заключается в повышении точности и эффективности способа.

Технический результат достигается тем, что в заявляемом способе многопараметрического определения предрасположенности к атеросклерозу и его клиническим проявлениям на основе определения вариантов митохондриального генома в крови пациента, согласно изобретению определяют степени гетероплазмии мтДНК по мутациям 652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insA/C/AC, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G, вычисляют степень суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома по формуле, и при значении данного показателя выше 40,3 балла судят об индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Осуществление способа.

В заявляемом способе генетической диагностики атеросклероза у пациента берут кровь, выделяют ДНК из клеток крови, определяют степень гетероплазмии мтДНК по мутациям 652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insA/C/AC, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G.

Вычисляют степень суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома по формуле

G = [652ins/delG]*2,195-[A750G]*3,134-[A1555G]*0,212+[С3256Т]*0,502-[Т3336С]*0,160-[С5178А]*0,792+[8516insA/C/AC]*0,057+[8528insA]*0,059+[8930insG]*0,078-[G9477A]*0,004+[10958insC]*0,014+[A12308G]*0,126+[G12372A]*0,038+[13047insC]*0,090+[13050insC]*0,146+[C14766T]*0,034+[G15059A]*0,051+[A15326G]*0,059,

где G - суммарная мутационная нагрузка митохондриального генома, а в квадратных скобках указаны показатели степени гетероплазмии по отдельным мутациям, и при величине суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома выше 40,3 баллов определяют индивидуальную генетическую предрасположенность к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Было обследовано 450 человек, а именно 223 человека без клинических признаков атеросклероза и 227 больных ишемической болезнью сердца (ИБС), в том числе 82 больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда. Количественная диагностика атеросклероза была проведена с помощью ультрасонографии сонных артерий с последующим измерением толщины интимо-медиального слоя общих сонных артерий и размера атеросклеротических бляшек. К здоровым лицам относили тех участников исследования, у которых отсутствовало патологическое утолщение интимо-медиального слоя общих сонных артерий и отсутствовали возвышающиеся поражения. К больным атеросклерозом относили тех участников исследования, у которых имелось патологическое утолщение интимо-медиального слоя общих сонных артерий в сочетании с возвышающимися поражениями, занимающими не менее 10% просвета сонных артерий. Цельную кровь брали утром натощак в количестве 5 мл и выделяли из нее ДНК методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Степень гетероплазмии мтДНК по 18 мутациям (652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insА/С/АС, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G) определяли с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием одной пары праймеров и двух зондов (на нормальный и мутантный участки мтДНК) для каждой мутации, вычисляя значение ΔCt (разность пороговых циклов для кривых плавления зондов, комплементарным нормальным или мутантным участкам ДНК), определяя коэффициент эффективности амплификации по формуле E=(R2/Rl)^1/C(t), где R1 и R2 - уровни флуоресценции в начале и в конце экспоненциальной фазы и рассчитывая степень гетероплазмии G по формуле G(%)=100/(1+E^ΔCt). После этого рассчитывали суммарную мутационную нагрузку митохондриального генома по эмпирической формуле G=[652ins/delG]*2,195-[A750G]*3,134-[A1555G]*0,212+[С3256Т]*0,502-[Т3336С]*0,160-[С5178А]*0,792+[8516insA/C/AC]*0,057+[8528insA]*0,059+[8930insG]*0,078-[G9477A]*0,004+[10958insC]*0,014+[A12308G]*0,126+[G12372A]*0,038+[13047insC]*0,090+[13050insC]*0,146+[C14766T]*0,034+[G15059A]*0,051+[A15326G]*0,059,

где G - суммарная мутационная нагрузка митохондриального генома, а в квадратных скобках указаны показатели степени гетероплазмии по отдельным мутациям.

У лиц с отсутствием клинических проявлений атеросклероза (ИБС или ИБС в сочетании с перенесенным инфарктом миокарда) среднее значение суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома составило 30,4 усл. ед. (SD=11,3), у больных ИБС без инфаркта миокарда в анамнезе - 42,1 усл. ед. (SD=9,4), у больных ИБС с перенесенным инфарктом миокарда - 47,9 усл. ед. (SD=9,9) (ANOVA, р<0,001). Определение пороговых значений суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома проводили методом построения характеристических кривых операторского теста (ROC-кривых). В качестве оцениваемого реального состояния использовали наличие атеросклероза сонных артерий (размеры атеросклеротической бляшки более 10% от просвета сосуда), или наличие ИБС, или наличие ИБС в сочетании с перенесенным инфарктом миокарда. По координатным точкам ROC-кривой пороговое значение суммарной мутационной нагрузки для каротидного атеросклероза (стеноз более 10%) составило 38,0 баллов. Площадь под кривой составила 0,707±0,024 (р<0,001), 95% доверительный интервал 0,659-0,754. По координатным точкам ROC-кривой пороговое значение суммарной мутационной нагрузки для выраженного и гемодинамически значимого каротидного атеросклероза (стеноз более 30%) составило 44,7 балла. Площадь под кривой составила 0,836±0,034 (р<0,001), 95% доверительный интервал 0,769-0,902. По координатным точкам ROC-кривой пороговое значение суммарной мутационной нагрузки для ИБС составило 37,5 баллов. Площадь под кривой составила 0,814±0,020 (р<0,001), 95% доверительный интервал 0,775-0,853. По координатным точкам ROC-кривой пороговое значение суммарной мутационной нагрузки для ИБС в сочетании с перенесенным инфарктом миокарда составило 41,1 баллов. Площадь под кривой составила 0,794±0,023 (р<0,001), 95% доверительный интервал 0,749-0,839. По 4 оцениваемым реальным состояниям среднее пороговое значение суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома было определено равным 40,3 балла. В отношении диагностики каротидного атеросклероза количество истинно положительных результатов составило 182 случая, истинно отрицательных 144 случая, ложноположительных 45 случаев, ложноотрицательных 79 случаев. Чувствительность генодиагностики составила 69,8%, специфичность - 76,2%. В отношении диагностики выраженного каротидного атеросклероза с наличием гемодинамически значимых стенозов количество истинно положительных результатов составило 43 случая, истинно отрицательных 317 случаев, ложноположительных 83 случая, ложноотрицательных 9 случаев. Чувствительность генодиагностики составила 82,7%, специфичность - 79,3%. В отношении диагностики ИБС количество истинно положительных результатов составило 177 случаев, истинно отрицательных 171 случай, ложноположительных 52 случая, ложноотрицательных 50 случаев. Чувствительность генодиагностики составила 78,0%, специфичность - 76,7%. В отношении диагностики инфаркта миокарда количество истинно положительных результатов составило 72 случая, истинно отрицательных 240 случаев, ложноположительных 128 случаев, ложноотрицательных 10 случаев. Чувствительность генодиагностики составила 87,9%, специфичность - 65,3%.

Примеры осуществления способа

Пример 1. Мужчина, 56 лет, значение суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома составляет 15,6 баллов (существенно ниже порогового значения; нет генетической предрасположенности к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 0,75 мм (соответствует возрастной норме, нет предрасположенности к атеросклерозу), атеросклеротические бляшки не выявлены, ИБС нет, инфаркта миокарда в анамнезе нет. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Пример 2. Мужчина, 58 лет, значение суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома составляет 54,0 балла (существенно выше порогового значения; есть генетическая предрасположенность к атеросклерозу). Толщина интимо-медиального слоя общих сонных артерий 1,00 мм (существенно выше возрастной нормы, есть предрасположенность к атеросклерозу), выявлены атеросклеротические бляшки со стенозированием более 20% просвета сосудов, ИБС есть, инфаркта миокарда в анамнезе нет. Результаты генодиагностики соответствуют реальной клинической картине.

Таким образом, заявляемый способ позволяет на ранних этапах выявлять развитие болезни и принимать адекватные меры для профилактики и своевременного лечения.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для определения степени индивидуального генетического риска атеросклероза, ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда. Изобретение основано на измерении степени гетероплазмии мтДНК по мутациям 652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insА/С/АС, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G. Измеренные показатели гетероплазмии используют в качестве переменных величин в формуле, по которой рассчитывают степень суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома. При превышении порогового значения данного показателя, принятого равным 40,3 балла, диагностируют наличие атеросклероза и индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.

Способ многопараметрического определения предрасположенности к атеросклерозу и его клиническим проявлениям на основе определения вариантов митохондриального генома в крови пациента, отличающийся тем, что определяют степени гетероплазмии мтДНК по мутациям 652ins/delG, A750G, A1555G, С3256Т, Т3336С, С5178А, 8516insA/C/AC, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A и A15326G, вычисляют степень суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома по формуле

G = [652ins/delG] * 2,195 - [A750G] * 3,134 - [A1555G] * 0,212 + [С3256Т] * 0,502 - [Т3336С] * 0,160 - [С5178А] * 0,792 + [8516insA/C/AC] * 0,057 + [8528insA] * 0,059 + [8930insG] * 0,078 - [G9477A] * 0,004 + [10958insC] * 0,014 + [A12308G] * 0,126 + [G12372A] * 0,038 + [13047insC] * 0,090 + [13050insC] * 0,146 + [C14766T] * 0,034 + [G15059A] * 0,051 + [A15326G] * 0,059,

где G - суммарная мутационная нагрузка митохондриального генома, а в квадратных скобках указаны показатели степени гетероплазмии по отдельным мутациям, и при значении данного показателя выше 40,3 балла судят об индивидуальной генетической предрасположенности к атеросклерозу, ишемической болезни сердца и инфаркту миокарда.