НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ КРОНА И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЯЗВЕННОГО КОЛИТА ПУТЕМ ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРНЫХ УЧАСТКОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2016 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине для диагностики воспалительных заболеваний кишечника.

Воспалительные заболевания кишечника представлены двумя основными формами - болезнь Крона и язвенный колит. Оба этих заболевания относятся к хроническим с аутоиммунным компонентом, манифестирующим в трудоспособном возрасте. Вследствие сложностей диагностики обеих форм на ранних стадиях пациенты с такой патологией попадают в поле зрения гастроэнтеролога обычно уже на поздних стадиях, имея явно выраженные симптомы и тяжелое протекание болезни вплоть до необходимости скорейшего оперативного вмешательства с невозможностью органосохраняющих операций. Диагностика на ранних стадиях обеспечивает высокую вероятность выхода в ремиссию и сохранение качества жизни наряду со снижением затрат на лечение как со стороны государства, так и со стороны граждан.

Согласно современным представлениям состав микробиоты кишечника человека при данных заболеваниях претерпевает существенные изменения. При этом состав микробиоты может измениться еще до наступления клинических признаков заболевания. Таким образом, определяя наличие определенных бактериальных маркеров в микробиоте кишечника, можно спрогнозировать начало развития патологии и ее течение. В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики воспалительных заболеваний кишечника, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида бактерий. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида микроорганизма. Благодаря высокой специфичности ПЦР происходит амплификация исключительно ДНК искомого микроорганизма - любая сопутствующая флора не может оказать влияние на эффективность диагностики.

Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения.

В патенте РФ 2362808 (C1) [1] описан способ диагностики общего дисбаланса микробиоты при помощи ПЦР в реальном времени. На основе ПЦР подсчитывается общая численность бактерий, численность представителей непатогенных и условно-патогенных видов. Для того чтобы признать отсутствие дисбаланса микробиоты авторы предлагают использовать следующий критерий: численность непатогенных видов должна в 1000 раз превышать численность условно-патогенных видов. В случае, если представленность условно-патогенных микроорганизмов в 10 и более раз выше, чем представленность непатогенных видов, авторы предлагают диагностировать выраженную степень дисбаланса микробиоты. К недостаткам данного метода также можно отнести низкую чувствительность: он позволяет диагностировать стадии заболевания, когда микробитный состав уже значительно изменился, а именно значительно возросло число патогенных организмов.

В патенте РФ 2391667 (А) [2] описан способ ранней диагностики воспалительных заболеваний кишечника на основе детекции антител к дрожжам Saccharomyces cerevisiae и антител к бактерицидному белку, увеличивающему проницаемость клеток наряду с эндоскопическим, электрофизиологическим, морфологическим исследованием и исследованием слизистой оболочки толстой кишки. Авторы предлагают диагностировать раннюю стадию дивертикулярной болезни в случае, если наряду с морфологическими и электрофизиологическими показателям концентрация антител к бактерицидному белку, увеличивающему проницаемость клеток, находится в диапазоне от 4 до 18 ЕД/мл и антител к Saccharomyces cerevidiae от 7 до 22 ЕД/мл. К недостаткам подобного подхода, основанного на применении антител, относятся его высокая стоимость, трудоемкость и возможные погрешности при получении антител.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа заявляемого изобретения, является техническое решение по заявке на патент WO 2012080753 (A1) [3], в котором описан способ диагностики болезни Крона за счет селективной гибридизации олигонуклеотидов к последовательностям, встречающимся у представителей Proteobacteria и Flavobacteriaceae. Повышенное связывание праймеров, свидетельствующее о повышенной представленности бактерий из данных таксонов, является, по мнению авторов, индикатором заболевания. Предлагается брать образцы из желудочно-кишечного тракта людей. В патенте приведены последовательности четырех подобных праймеров. Недостатком описанного способа является его вероятная низкая специфичность и чувствительность вследствие наблюдения изменений на очень высоком таксономическом уровне (типов и семейств). Изменения состава микробиоты на таких высоких уровнях предполагает значительную выраженность заболевания. В сравнении с этим в заявляемом изобретении использовались праймеры на гены Е. coli, которые, как было показано, коррелируют с развитием заболевания, что позволит проводить диагностику на ранних этапах заболевания, когда изменения еще не затронули микробиотный состав в целом.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение присутствия бактериальных генов являющихся маркерами развития болезни Крона и неспецифического язвенного колита, а именно генов, кодирующих бета-лактамазу, фимбриальный белок, 3 гипотетических белка и ген LrgA. Данный результат достигается путем использования при постановке ПЦР-набора синтетических олигонуклеотидов для выявления маркерных участков ДНК микроорганизма Escherichia coli. Система детекции маркерных участков генов включает в себя праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′-GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′ и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры с интеркалирующим красителем, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Nonidet Р40, 20 мМ MgCl₂). В каждую пробирку при постановке реакции амплификации добавляется образец бактериальной ДНК, выделенной из образца кала человека. В случае наличия в ДНК специфических маркеров, комплементарных праймерам, происходит наработка ПЦР-продукта и возрастание уровня флуоресценции, что фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами. Интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве образующегося продукта.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированными фрагментами, последовательности которых комплементарны указанным праймерам, и позволяющие синтезировать продукт длинной 105-206 пар нуклеотидов при добавлении их в реакционную смесь

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Осуществление изобретения

1) Из биологического материала (кал человека) выделяется бактериальная ДНК с помощью набора реагентов, предназначенных для этих целей (набор реагентов для выделения ДНК из кала человека не является предметом данного патента).

2) На 1 определение генетических маркеров заболевания для 1 образца используется 6 пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I.

3) Во все подготовленные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

4) Во все подготовленные пробирки (кроме пробирок K- (отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п. 1 ДНК.

5) В пробирку, маркированную K-, вносится 1 мкл чистой воды.

6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец.

7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации. Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

Источники информации

1. Патент RU 2362808. Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности.

2. Патент RU 2201636. Способ ранней диагностики дивертикулярной болезни ободочной кишки.

3. Заявка на патент WO 2012080753. Способ диагностики болезни Крона.

Изобретение относится к биохимии. Описан набор синтетических олигонуклеотидов для выявления маркерных участков генов бактерий кишечника человека, ассоциированных с развитием воспалительных заболеваний кишечника (болезни Крона и неспецифического язвенного колита) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Данный набор включает специфичные олигонуклеотиды к фрагментам генов микроорганизма Escherichia coli, а именно праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′-GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′

В качестве флуоресцентной метки используется интеркалирующий краситель SYBR GREEN I. Предлагаемое изобретение является достоверным способом обнаружения присутствия в микробиоте кишечника человека маркеров, ассоциированных с развитием болезни Крона и неспецифического язвенного колита.

Набор синтетических олигонуклеотидов для диагностики болезни Крона и неспецифического язвенного колита путем выявления маркерных участков бактериальной ДНК методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:

1. 5′-TATGAGCAGTCGCTTACCCG-3′ и 5′-GTCGTCGGTATGTCCTGCTT-3′

2. 5′-CGTTAACCCGCTGTGGTAGT-3′ и 5′-CTACCGAGCCATCTTCCAGC-3′

3. 5′-GCGTTCAGAGCAAAACCCAG-3′ и 5′-TAAAAGACGGGAAGCAGCCA-3′

4. 5′-GGGCCGATATACAGGTGGTG-3′ и 5′-TCCTCAGGCATAAAGACGGC-3′

5. 5′- GTATCTCGTCTCCTGGCTGC-3′ и 5′-GCCAGCCATCCACCAGTAAT-3′

6. 5′-GTATAGATCCGTCAGGTGCAT-3′ и 5′-ACCTTCTGTTCCTGAAGCCC-3′
и интеркалирующий краситель SYBR GREEN I для детекции в режиме реального времени.