ШТАММ МОЛОЧНОКИСЛОЙ БАКТЕРИИ, ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ПРОДУКТ ПИТАНИЯ, НАПИТОК, А ТАКЖЕ КОРМ, КОТОРЫЕ СОДЕРЖАТ ШТАММ МОЛОЧНОКИСЛОЙ БАКТЕРИИ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 A61P31/12 A61P31/16 A61P37/04 A23K10/16 A23K10/18 A23L33/135 A23L2/52 C12R1/225 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новой молочнокислой бактерии, принадлежащей к виду Lactobacillus paracasei, лекарственному средству, продукту питания или напитку, а также корму, которые содержат эту молочнокислую бактерию.

Уровень техники

Известно, что некоторые молочнокислые бактерии обладают профилактическим действием и защитным действием против различных инфекционных заболеваний (непатентный документ 1). Также известно, что эти эффекты молочнокислых бактерий основаны на активации клеточно-опосредованного иммунитета хозяина, стимуляции секреции IgA из слизистой оболочки, например оболочки желудочно-кишечного тракта и органов дыхания (непатентный документ 1), и так далее. Например, сообщалось, что молочнокислые бактерии, принадлежащие к виду Lactobacillus casei, вызывают продуцирование цитокинов, таких как IL-12 (интерлейкин-12) и IFN-γ (интерферон-γ), иммунокомпетентными клетками хозяина, активируя клеточно-опосредованный иммунитет хозяина и в результате защищая хозяев от инфекции вирусом гриппа и так далее (непатентные документы 2-4).

IL-12 и IFN-γ представляют собой цитокины, обладающие способностью индуцировать дифференциацию необученных хелперных T-клеток в хелперные Т-клетки 1 типа (Th1), способностью активировать клетки - естественные киллеры (NK-клетки) - и способностью стимулировать фагоцитоз таких клеток, как макрофаги, и они вовлечены в защитный ответ против инфекции, вызванной вирусами или бактериями, а также противоопухолевый ответ хозяев. Вследствие этого для того чтобы иметь возможность использовать сильные профилактические свойства и защитные свойства молочнокислых бактерий против инфекционных заболеваний, важно использовать молочнокислую бактерию, обладающую сильной, вызывающей продуцирование IL-12 активностью. В качестве таких молочнокислых бактерий известны бактерии штамма FERM BP-11313 Lactobacillus paracasei, которые демонстрируют высокую способность к выживанию в кислых условиях и превосходную способность вызывать продуцирование IL-12 (патентный документ 1; в этом литературном источнике данный штамм также называют «штамм MCC1375»).

Также было высказано предположение об участии клеточных стенок молочнокислых бактерий в индукции продуцирования IL-12 молочнокислыми бактериями (патентный документ 2) и сообщалось, что при обработке молочнокислых бактерий ферментом, расщепляющим клеточную стенку, (N-ацетилмурамидазой), нарушается их способность вызывать продуцирование IL-12 (непатентный документ 5). Также было высказано предположение, что РНК, содержащиеся в молочнокислых бактериях, принимают участие в индукции продуцирования IL-12 молочнокислыми бактериями, и сообщалось, что, если мертвые клетки молочнокислых бактерий, убитых нагреванием, обработать РНКазой, способность к индукции продуцирования IL-12 в значительной степени нарушается (непатентный документ 6). На сегодняшний день также предложены иммуностимуляторы, в которых используется РНК молочнокислых бактерий как таковая (патентные документы 3 и 4).

Поскольку в организме человека содержатся ферменты, расщепляющие клеточную стенку, такие как лизоцим, имеющий N-ацетилмурамидазную активность в отношении бактерий, считается, что молочнокислые бактерии, поступающие в организм, подвергаются воздействию этих ферментов. Кроме того, РНКазы существуют повсеместно в окружающей среде, и они чрезвычайно устойчивы к высокой температуре. Вследствие этого они часто загрязняют продукты, и они не инактивируются стерилизацией или тому подобным и могут сохраняться в продуктах. Более того, поскольку РНКазы также существуют в организме человека, например в слюне и пищеварительных соках, считается, что молочнокислые бактерии также подвергаются действию РНКаз после того, как они поступают в организм пероральным путем.

Даже если молочнокислые бактерии изначально имеют высокую IL-12-индуцирующую активность, они могут не сохранять и не проявлять достаточную IL-12-индуцирующую активность в живом организме, поскольку они подвергаются действию ферментов, расщепляющих клеточную стенку (N-ацетилмурамидазы) и РНКаз, присутствующих в слюне или пищеварительных соках. Считается, что секретируемые количества этих расщепляющих клеточную стенку ферментов и РНКаз различаются у разных людей, и существует твердая убежденность в том, что такими различиями, вероятно, объясняется разница в эффектах, наблюдаемая среди отдельных людей.

Литература предшествующего уровня техники

Патентные документы

патентный документ 1: Международная публикация патента WO 2012/133827

патентный документ 2: Японский опубликованный патент (Kokai) № 2009-155221

патентный документ 3: Международная публикация патента WO 2009/005124

патентный документ 4: Международная публикация патента WO 2011/027829

Непатентные документы

непатентный документ 1: Delcenserie, V. et al., Curr. Issues Mol. Biol. (2008) 10: 37-54

непатентный документ 2: Hori T. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. (2002) 9: 105-108

непатентный документ 3: Takeda, K. et al., Clin. Exp. Immunol. (2006) 146: 109-115

непатентный документ 4: Ogawa, T., Clin. Exp. Immunol. (2006) 143: 103-109

непатентный документ 5: Shida, K. et al., J. Dairy Sci. (2006) 89: 3306-3317

непатентный документ 6: Inoue, R. et al., FEMS Immnol. Med. Microbiol. (2011) 61: 94-102.

Сущность изобретения

Цель, достигаемая с помощью изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление молочнокислой бактерии, полезной для профилактики и защиты от различных инфекций, то есть молочнокислой бактерии, обладающей высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью или иммуностимулирующей активностью, причем эти активности предпочтительно не снижаются с легкостью в организме человека, и так далее.

Средства для достижения цели

Для достижения вышеуказанной цели авторы настоящего изобретения настойчиво искали такие целевые молочнокислые бактерии и обнаружили новый штамм Lactobacillus paracasei, отличающийся высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью. Таким образом, они осуществили настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение относится к штамму MCC1849 Lactobacillus paracasei (NITE BP-01633).

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему данный штамм.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного лекарственного средства лекарственное средство предназначено для иммуностимуляции.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного лекарственного средства лекарственное средство предназначено для борьбы с вирусами.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного лекарственного средства, предназначенного для борьбы с вирусами, лекарственное средство предназначено для борьбы с вирусом гриппа.

Настоящее изобретение также относится к продукту питания или напитку, которые содержат данный штамм.

Настоящее изобретение также относится к корму, который содержит данный штамм.

Настоящее изобретение также относится к стимулирующему продуцирование IL-12 средству, которое содержит данный штамм.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного стимулирующего продуцирование IL-12 средства средство находится в форме продукта питания или напитка.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует количества IL-12, продуцируемого в клетках селезенки мыши в присутствии молочнокислых бактерий. Штаммы молочнокислых бактерий указаны по горизонтальной оси, и по вертикальной оси указаны средние значения и стандартные отклонения (S. D.) для продуцируемого количества IL-12.

Фиг. 2 демонстрирует предотвращающее инфекцию вируса гриппа действие штамма MCC1849.

На фиг. 2(a) приведены показатели в баллах симптомов, определяемых после инфицирования. Символ * указывает на наличие статистически значимого различия между двумя группами в день наблюдения.

На фиг. 2(b) приведены концентрации вируса в легких. Символ * указывает на наличие статистически значимого различия между двумя группами. Статистический анализ проводили с использованием критерия Даннетта.

Варианты осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробно.

Настоящее изобретение относится к штамму MCC1849 Lactobacillus paracasei (NITE BP-01633), который представляет собой новый штамм молочнокислой бактерии, принадлежащий к виду Lactobacillus paracasei. Этот штамм далее в настоящем документе также называют «молочнокислой бактерией по настоящему изобретению» или «штаммом по настоящему изобретению» или просто «штаммом MCC1849».

Молочнокислая бактерия по настоящему изобретению была выделена из человеческих экскрементов в качестве исходного источника. Бактериологические характеристики данного штамма приведены далее в примере 1. Этот штамм был депонирован 6 июня 2013 г. в депозитарии патентуемых микроорганизмов независимого административного учреждения, Национального института технологии и оценки, NITE № 122, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan, под регистрационным номером NITE P-01633, и депозит получил статус международного депозита в соответствии с положениями Будапештского договора 31 января 2014 г. с присвоением регистрационного номера NITE BP-01633.

Молочнокислая бактерия по настоящему изобретению не ограничена вышеуказанным депонированным штаммом, и она может относиться к штамму, по существу эквивалентному депонированному штамму. Такой по существу эквивалентный штамм представляет собой штамм, принадлежащий к виду Lactobacillus paracasei, обладающий стимулирующей продуцирование IL-12 активностью на уровне, сопоставимом с тем, который характерен для депонированного штамма, и предпочтительно демонстрирующий снижение стимулирующей продуцирование IL-12 активности в меньшей степени по сравнению с той, которая характерна для депонированного штамма, даже после обработки расщепляющим клеточную стенку ферментом или РНКазой. Более того, по существу эквивалентный штамм дополнительно имеет гомологию нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, составляющую 98% или более, предпочтительно 99% или более, более предпочтительно 100% относительно нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК вышеуказанного депонированного штамма, и предпочтительно имеет такие же бактериологические характеристики, что и вышеуказанный депонированный штамм. Кроме того, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению может относиться к штамму, полученному из депонированного штамма или штамма, по существу эквивалентного депонированному штамму, в результате мутагенной обработки, генной рекомбинации, отбора естественным образом мутировавшего штамма или тому подобного, при условии сохранения активности, описанной в настоящем изобретении.

Штамм MCC1849 обладает более высокой стимулирующей продуцирование IL-12 (интерлейкина-12) активностью по сравнению с известными молочнокислыми бактериями. Хотя стимулирующая продуцирование IL-12 активность молочнокислых бактерий, как правило, значительно снижается при обработке расщепляющим клеточную стенку ферментом, таким как N-ацетилмурамидаза, или РНКазой, штамм MCC1849 отличается меньшим снижением стимулирующей продуцирование IL-12 активности даже после обработки расщепляющим клеточную стенку ферментом или РНКазой. Стимулирующую продуцирование IL-12 активность можно измерять методом, описанным в разделе «Примеры».

Бактерии штамма MCC1849 можно легко размножать, например, путем культивирования. Метод культивирования не имеет конкретных ограничений при условии, что бактерии штамма MCC1849 могут размножаться, и метод, обычно используемый для культивирования молочнокислых бактерий, при необходимости можно соответствующим образом модифицировать и использовать. Например, температура культивирования может составлять 25-50°C и предпочтительно составляет 35-42°C. Хотя культивирование можно проводить в аэробных условиях или анаэробных условиях, культивирование предпочтительно проводят в анаэробных условиях, например, с продуванием анаэробным газом, таким как газообразный диоксид углерода. Культивирование можно также проводить в микроаэробных условиях, например в стационарной жидкой культуре или тому подобном.

Среда для культивирования штамма MCC1849 не имеет конкретных ограничений, и среду, обычно используемую для культивирования молочнокислых бактерий, при необходимости можно соответствующим образом модифицировать и использовать. То есть в соответствии с характеристиками ассимиляции можно использовать в качестве источника углерода, например, сахариды, такие как галактоза, глюкоза, фруктоза, манноза, целлобиоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза, крахмал, гидролизат крахмала, и сырую мелассу. В качестве источника азота можно использовать, например, аммиак, соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и нитрат аммония, а также нитраты. Кроме того, в качестве неорганических солей можно использовать, например, хлорид натрия, хлорид калия, фосфат калия, сульфат магния, хлорид кальция, нитрат кальция, хлорид марганца, сульфат железа и так далее. Кроме того, можно также использовать органические компоненты, такие как пептон, соевая мука, обезжиренный соевый шрот, мясной экстракт и дрожжевой экстракт. Кроме того, предпочтительно можно использовать готовую среду, например среду MRS.

Что касается штамма MCC1849, можно использовать культуру, полученную в результате культивирования бактерий штамма как таковую, или можно использовать ее после разведения или концентрирования, или можно также использовать клетки, собранные из культуры. Кроме того, при условии сохранения эффекта по настоящему изобретению после культивирования можно выполнять различные дополнительные операции, такие как нагревание и лиофилизация. Такими дополнительными операциями предпочтительно являются те, которые обеспечивают высокую жизнеспособность клеток. В лекарственном средстве, продукте питания или напитке, а также корме по настоящему изобретению клетки штамма MCC1849 предпочтительно являются живыми клетками, однако они могут быть и мертвыми клетками.

Штамм MCC1849 можно использовать в качестве средства, стимулирующего продуцирование IL-12. Штамм MCC1849, стимулирующее продуцирование IL-12 средство, содержащее штамм, или композиция, содержащая что-либо из них, могут найти самое широкое применение, например, в качестве лекарственного средства, продукта питания или напитка, а также корма. Например, можно предоставлять лекарственное средство для стимуляции продуцирования IL-12, продукт питания или напиток для стимуляции продуцирования IL-12 и корм для стимуляции продуцирования IL-12.

Кроме того, средство, стимулирующее продуцирование IL-12, по настоящему изобретению можно использовать в качестве иммуностимулятора или противовирусного средства. Вирус в качестве мишени для противовирусного средства не имеет конкретных ограничений при условии, что заболевание, вызываемое данным вирусом, можно предотвращать или лечить путем стимуляции продуцирования IL-12 или иммуностимуляции, и примеры включают, например, вирусы гриппа.

Лекарственное средство по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений при условии, что оно содержит штамм MCC1849. В качестве лекарственного средства по настоящему изобретению можно использовать штамм MCC1849 как таковой, или из него можно получать фармацевтический препарат путем добавления физиологически приемлемого жидкого или твердого носителя и использовать.

Лекарственная форма лекарственного средства по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений, и конкретные примеры включают таблетку, пилюлю, порошок, раствор, суспензию, эмульсию, гранулу, капсулу, сироп, суппозиторий, инъекцию, мазь, пластырь, глазные капли, капли в нос и так далее. Кроме того, для получения фармацевтического препарата можно использовать такие добавки, как эксципиент, обычно используемый в качестве носителя фармацевтического препарата, связующее вещество, дезинтегрирующее вещество, смазывающее вещество, стабилизатор, ароматизатор, разбавитель, сурфактант и растворитель для инъекции.

Хотя содержание штамма MCC1849 в лекарственном средстве по настоящему изобретению соответствующим образом определяют в зависимости от лекарственной формы, инструкции по применению, возраста, пола пациента, типа заболевания, степени тяжести заболевания и других условий, оно, как правило, предпочтительно находится в диапазоне от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/г или от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/мл, более предпочтительно в диапазоне от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/г или от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/мл. Если клетки штамма MCC1849 являются мертвыми клетками, единицы KOE/г или КОЕ/мл можно заменять числом клеток/г или числом клеток/мл.

Кроме того, при условии сохранения эффекта по настоящему изобретению лекарственное средство, содержащее штамм MCC1849, и другое лекарственное средство, например стимулятор продуцирования IL-12, иммуностимулятор, противовирусное средство, противовоспалительное средство, противоязвенное средство или тому подобное, отличное от штамма MCC1849, можно использовать в сочетании.

Время введения лекарственного средства по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений, и его можно соответствующим образом выбирать в соответствии с видом терапии для целевого заболевания. Лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить профилактически или использовать для поддерживающей терапии. Путь введения предпочтительно определяют в соответствии с лекарственной формой, возрастом, полом пациента, другими условиями, тяжестью симптомов пациента и так далее. В любом случае лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить один раз или два или более раз в сутки, или его можно вводить один раз в несколько дней или несколько недель.

Стимулирующее продуцирование IL-12 средство по настоящему изобретению или композиция, содержащая его, включает клетки штамма MCC1849 в качестве активного ингредиента и может заметно стимулировать продуцирование IL-12 в живом организме. Повышенное содержание IL-12 активирует клеточно-опосредованный иммунитет. Таким образом, стимулирующее продуцирование IL-12 средство по настоящему изобретению способно усиливать клеточно-опосредованный иммунитет, и вследствие этого его можно использовать также в качестве иммуностимулятора. Термин «иммуностимуляция» означает стимуляцию различных иммунных реакций, и он является синонимом термина «иммунная активация». Кроме того, стимулирующее продуцирование IL-12 средство можно также использовать в качестве вызывающего продуцирование IL-12 средства.

Лекарственное средство или стимулирующее продуцирование IL-12 средство по настоящему изобретению обладает стимулирующей продуцирование IL-12 активностью или иммуностимулирующей активностью, основанной на вышеуказанной активности, и может быть использовано для профилактического или терапевтического лечения заболевания, которое может быть предотвращено или излечено путем стимуляции продуцирования IL-12 или иммуностимуляции. Термин «излечение» также означает снижение тяжести заболевания.

Конкретные примеры применения лекарственного средства по настоящему изобретению включают, например, снижение тяжести аллергии, такой как пищевая аллергия, бронхиальная астма, крапивница, ринит, поллиноз и анафилактический шок, а также повышение сопротивляемости инфекционным заболеваниям, профилактику рака, предотвращение прогрессирование рака и так далее. Кроме того, лекарственное средство или стимулирующее продуцирование IL-12 средство по настоящему изобретению можно широко использовать в качестве противоопухолевого средства, профилактического или терапевтического средства для оппортунистической инфекции или профилактического или терапевтического средства для аллергического заболевания.

Лекарственное средство по настоящему изобретению можно вводить независимо или можно использовать вместе с другим лекарственным средством, таким как иммунодепрессант.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению штамма MCC1849 в производстве стимулирующего продуцирование IL-12 средства или иммуностимулятора. Другой аспект настоящего изобретения относится к способу профилактического или терапевтического лечения заболевания, которое может быть предотвращено или излечено путем стимуляции продуцирования IL-12, который включает этап введения штамма MCC1849 или лекарственного средства по настоящему изобретению соответствующему субъекту.

В качестве другого варианта осуществления лекарственного средства по настоящему изобретению лекарственное средство по настоящему изобретению можно использовать как противовирусное средство, частности его можно использовать как средство против вируса гриппа. Средство против вируса гриппа по настоящему изобретению можно использовать для профилактического или терапевтического лечения заболевания, вызванного вирусом гриппа. Средство против вируса гриппа по настоящему изобретению способно уменьшать инфекцию или пролиферацию вируса гриппа в живом организме. Вирус в качестве мишени для противовирусного средства не имеет конкретных ограничений при условии, что заболевание, вызываемое данным вирусом, может быть предотвращено или излечено путем стимуляции продуцирования IL-12 или иммуностимуляции.

Другой аспект настоящего изобретения относится к использованию штамма MCC1849 в производстве противовирусного средства, например средства против вируса гриппа. Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу профилактического или терапевтического лечения заболевания, вызываемого вирусом, например гриппа, который включает этап введения штамма MCC1849 или лекарственного средства по настоящему изобретению соответствующему субъекту.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению не имеет конкретных ограничений при условии, что он содержит штамм MCC1849, и примеры продукта питания или напитка включают такие напитки, как безалкогольные напитки, газированные напитки, питательные напитки, напитки из фруктовых соков и содержащие молочнокислые бактерии напитки (включая концентрированные неразведенные растворы или порошки для приготовления этих напитков); замороженные десерты, такие как мороженое, шербет и ледяная стружка; кондитерские изделия, такие как леденцы, жевательная резинка, конфеты, пастилки, шоколад, таблетированные кондитерские изделия, закуски, печенье, желе, варенье, сливки, печеные кондитерские изделия; молочные продукты, такие как переработанное молоко, молочные напитки, кисломолочные напитки, питьевой йогурт и масло; хлеб; продукты для энтерального питания, жидкие продукты питания, детские смеси, напитки для спортсменов; другие функциональные продукты питания и так далее. Продукт питания может быть пищевой добавкой в форме, например, таблетки. Если продукт питания представляет собой пищевую добавку, штамм MCC1849 можно принимать так, чтобы на него не оказывали влияние другие продукты питания, с точки зрения суточного количества пищи или потребляемых калорий.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению можно получать путем добавления штамма MCC1849 к исходным материалам для продукта питания или напитка и можно получать таким же образом, как и обычные продукты питания или напитки, за исключением добавления штамма MCC1849. Штамм MCC1849 можно добавлять на любой стадии процесса производства продукта питания или напитка. Продукт питания или напиток можно также получать с помощью процесса брожения, осуществляемого штаммом MCC1849. Примеры таких продуктов питания или напитков включают напитки с кисломолочными бактериями, кисломолочные продукты и так далее.

В качестве исходного материала для продукта питания или напитка можно использовать исходный материал, используемый для получения обычных напитков и продуктов питания. Полученный продукт питания или напиток можно принимать перорально.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению включает исходные материалы для производства продукта питания или напитка, а также те, которые добавляют к продуктам питания или напиткам в ходе процесса производства продукта питания или напитка или после их производства, например пищевые добавки. Например, молочнокислую бактерию по настоящему изобретению можно использовать в качестве затравки для получения кисломолочных продуктов. Молочнокислую бактерию по настоящему изобретению можно также добавлять в кисломолочный продукт после его получения.

Хотя содержание штамма MCC1849 в продукте питания или напитке по настоящему изобретению соответствующим образом определяют в зависимости от формы продукта питания или напитка, как правило, оно предпочтительно находится в диапазоне от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/г или от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/мл, более предпочтительно в диапазоне от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/г или от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/мл продукта питания или напитка.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению можно использовать для различных вариантов применения, предполагающих использование эффектов от стимуляции продуцирования IL-12, иммуностимуляции, противовирусного действия и так далее. То есть можно предоставлять стимулирующее продуцирование IL-12 средство, иммуностимулятор и противовирусное средство, которые содержат молочнокислую бактерию по настоящему изобретению и находятся в форме продукта питания или напитка. Стимулирующее продуцирование IL-12 средство, иммуностимулятор и противовирусное средство в форме продукта питания или напитка являются синонимами для продукта питания или напитка по настоящему изобретению, содержащего стимулирующее продуцирование IL-12 средство, продукта питания или напитка по настоящему изобретению, содержащего иммуностимулятор, и продукта питания или напитка по настоящему изобретению, содержащего противовирусное средство соответственно.

Продукт питания или напиток по настоящему изобретению можно продавать в качестве продукта питания или напитка с указанием по применению, то есть для стимуляции продуцирования IL-12, для иммуностимуляции или для противовирусного действия. Кроме того, продукт питания или напиток по настоящему изобретению может иметь такое указание, как «для стимуляции продуцирования IL-12», «для иммуностимуляции», «для иммунной активации», «для борьбы с вирусами», «для борьбы с вирусом гриппа» и «для профилактики инфекционных заболеваний». Кроме того, безусловно, можно использовать указания, помимо тех, которые описаны выше, отражающие вторичный эффект, достигаемый в результате стимуляции продуцирования IL-12.

Вышеупомянутый термин «указание» включает все действия для информирования потребителей о вышеуказанном применении, и любые указания, напоминающие или проводящие аналогию с вышеуказанным применением, охвачены термином «указание» по настоящему изобретению, независимо от цели, содержания, объективного описания, средства передачи и так далее данного указания. Однако предпочтительно указание имеет такую форму, которая позволяет потребителям непосредственно понять вышеуказанное применение.

Конкретные примеры включают действия по размещению вышеупомянутых указаний по применению на товарах или упаковках товаров, относящихся к продукту питания или напитку по настоящему изобретению, действия по распределению, доставке, представлению для целей распределения или доставки или импортированию таких товаров или упаковок для товаров, на которых указано вышеупомянутое применение, размещению или распространению рекламы, прайс-листов или деловых бумаг, относящихся к товарам, на которых указано вышеупомянутое применение, или предоставлению информации, включая, например, содержание с указанием на вышеупомянутое применение, с использованием электромагнитных методов (интернет и так далее) и так далее. Указания на упаковках, контейнерах, в каталогах, брошюрах, рекламных материалах, используемых в точках продаж, таких как предприятия розничной торговли, и других документах являются особенно предпочтительными.

Указание предпочтительно является указанием, одобренным администрацией и так далее (например, указание в форме, основанной на разрешении, квалифицируемом на базе любой из различных юридических систем, которое предоставляется администрацией). Примеры указания дополнительно включают, например, указания по применению в качестве продукта здорового питания, функционального продукта питания, продукта для энтерального питания, продукта специального диетического питания, продукта питания с заявленной питательной функцией, квазилекарства и так далее, а также указания, одобренные Министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения, например указания, одобренные на основании системы специализированных продуктов для укрепления здоровья и аналогичных систем. Примеры последних включают указания по применению в качестве специализированного продукта для укрепления здоровья, указания по применению в качестве специализированного продукта для укрепления здоровья с заявленными полезными для здоровья свойствами, указания о влиянии на структуры и функции организма, указания с заявленным снижением риска заболеваний и так далее, и более конкретно типичные примеры включают указания по применению в качестве специализированного продукта для укрепления здоровья (в частности, указания о пользе для здоровья), что предусмотрено требованиями о соблюдении закона в области укрепления здоровья (Министерство здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии, постановление № 86, 30 апреля 2003 г.), и аналогичные указания.

Примеры корма по настоящему изобретению включают продукты питания для домашних питомцев, корма для сельскохозяйственных животных, корма для разводимой рыбы и так далее. Корм по настоящему изобретению можно получать путем смешивания штамма MCC1849 с обычным кормовым материалом, например злаками, пищевыми отходами, отрубями, рыбной мукой, костной мукой, маслом и жиром, сухим обезжиренным молоком, молочной сывороткой, минеральным кормом и дрожжами. Кроме того, корм можно получать с использованием процесса брожения, осуществляемого штаммом MCC1849, как в случае, например, силоса. Полученный корм можно скармливать обычным млекопитающим, скоту, разводимой рыбе, домашним питомцам и так далее.

Хотя содержание штамма MCC1849 в корме по настоящему изобретению соответствующим образом определяют в зависимости от корма и объектов, которым дают корм, оно, как правило, предпочтительно находится в диапазоне от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/г или от 1×10⁶ до 1×10¹² KOE/мл, более предпочтительно в диапазоне от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/г или от 1×10⁷ до 1×10¹¹ KOE/мл.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет дополнительно объяснено с помощью примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными ниже примерами.

Пример 1: Бактериологические характеристики штамма MCC1849

Штамм MCC1849 выделяли из образца человеческих экскрементов. Бактериологические характеристики штамма, такие как морфология клеток, подвижность, спорообразование, окрашивание по Граму, каталаза, образование газа из глюкозы и способность к сбраживанию сахаров, приведены в таблице 1. Способность к сбраживанию сахаров изучали с использованием набора для идентификации бактерий API 50CH (Sysmex Biomerieux Co., Ltd.). То есть в соответствии с методом, описанным в руководстве, прилагаемом к набору, бактерию культивировали в течение ночи, бактериальную суспензию инокулировали в среду, содержащую целевой субстрат, бактерию культивировали в инкубаторе при температуре 37°C и состояние сбраживания субстрата оценивали в дни 1 и 2 культивирования.

Бактериологические характеристики приведены в таблице 1. На основании этих результатов определили, что штамм MCC1849 относится к виду Lactobacillus paracasei.

Таблица 1
Бактериологические характеристики штамма MCC1849 Lactobacillus paracasei 1 Морфология клеток Палочка 2 Подвижность Нет 3 Спорообразование Нет 4 Окрашивание по Грамму + 5 Каталаза - 6 Образование газа из глюкозы - 7 Способность к сбраживанию сахаров (1) Контроль - (2) Глицерин - (3) Эритрит - (4) D-арабиноза - (5) L-арабиноза - (6) D-рибоза + (7) D-ксилоза - (8) L-ксилоза - (9) D-адонит - (10) Метил-β-D-ксилопиранозид - (11) D-галактоза + (12) D-глюкоза + (13) D-фруктоза + (14) D-манноза + (15) L-сорбоза - (16) L-рамноза - (17) Дульцит - (18) Инозит - (19) D-маннит + (20) D-сорбит + (21) Метил-α-D-маннопиранозид - (22) Метил-α-D-глюкопиранозид ± (23) N-ацетилглюкозамин ± (24) Амигдалин ± (25) Арбутин + (26) Эскулин цитрат железа + (27) Салицин + (28) D-целлобиоза + (29) D-мальтоза + (30) D-лактоза + (31) D-мелибиоза - (32) D-сахароза + (33) D-трегалоза + (34) Инулин + (35) D-мелезитоза + (36) D-рафиноза - (37) Крахмал - (38) Гликоген - (39) Ксилит - (40) Гентиобиоза ± (41) D-тураноза + (42) D-ликсоза - (43) D-тагатоза + (44) D-фукоза - (45) L-фукоза - (46) D-арабит - (47) L-арабит - (48) Глюконат ± (49) 2-кетоглюконат - (50) 5-кетоглюконат - + Положительные; - Отрицательные; ± Ложноположительные

Кроме того, на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма MCC1849 установлено, что штамм MCC1849 относится к виду Lactobacillus paracasei или Lactobacillus casei. Lactobacillus paracasei и Lactobacillus casei являются близкородственными видами, и было показано, что гомология нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК их стандартных штаммов составляет 99% или выше (Huang C.H., and Lee F. L., Antonie Van Leeuwenhoek, 2011, 99(2): 319-27). Определяли геномную последовательность штамма MCC1849 и гомологию подтверждали картированием прочтений, используя геном стандартного штамма Lactobacillus paracasei (ATCC 25302) или стандартного штамма Lactobacillus casei (ATCC 393) в качестве эталонного генома.

В результате штамм MCC1849 имел 85% гомологии со стандартным штаммом Lactobacillus paracasei, притом что он имел 45% гомологии со стандартным штаммом Lactobacillus casei.

Таким образом, было подтверждено, что штамм MCC1849 относится к виду Lactobacillus paracasei.

Пример 2: Оценка вызывающей продуцирование IL-12 активности с использованием клеток селезенки мыши

Эффект обработки РНКазой или обработки расщепляющим клеточную стенку ферментом на вызывающую продуцирование IL-12 активность молочнокислых бактерий оценивали, используя клетки селезенки мыши, для штамма MCC1849 Lactobacillus paracasei, описанного в примере 1, и штамма FERM BP-11313 Lactobacillus paracasei (международная публикация патента WO 2012/133827), который, как известно, обладает высокой вызывающей продуцирование IL-12 активностью, а также других штаммов молочнокислых бактерий, штамма ATCC 53103 Lactobacillus rhamnosus, штамма JCM 2012 Lactbacillus johnsonii, штамма JCM 1149 Lactobacillus plantarum и штамма ATCC 11842 Lactobacillus bulgaricus.

Штамм FERM BP-11313 депонирован как в качестве международного депозита в депозитарии патентуемых микроорганизмов Национального института технологии и оценки, NITE. Штамм JCM 2012 и штамм JCM 1149 получены из Японской коллекции микроорганизмов (JCM) независимого административного учреждения, Института физических и химических исследований (2-1, Hirosawa, Wako-shi, Saitama-ken, 351-0198). Кроме того, штамм ATCC 53103 и штамм ATCC 11842 получены из Американской коллекции типовых культур (адрес: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America).

Каждый из вышеуказанных штаммов молочнокислых бактерий культивировали в среде MRS (de Man Rogasa Sharpe) (BD Company) в течение 16 часов, клетки промывали 3 раза центрифугированием и ресуспендированием в дистиллированной воде, затем суспендировали в дистиллированной воде при плотности 10 мг (в расчете на сухую массу клеток)/мл и подвергали тепловой обработке при температуре 100°C в течение 15 минут, получая суспензию мертвых клеток молочнокислой бактерии («не обработанные ферментом»).

Каждую суспензию мертвых клеток молочнокислой бактерии центрифугировали, супернатант удаляли, осадки суспендировали в 50 мМ Трис-малатном буфере (pH 7,0), содержащем 4 мМ хлорида магния, в концентрации 10 мг (в расчете на сухую массу клеток)/мл, к суспензии добавляли N-ацетилмурамидазу (N-Acetylmuramidase SG, Seikagaku Corporation) в концентрации 5 мкг/мл и оставляли для взаимодействия при температуре 37°C на 120 минут. Затем фермент инактивировали тепловой обработкой при температуре 100°C в течение 5 минут, получая продукт, обработанный расщепляющим клеточную стенку ферментом («обработанный N-ацетилмурамидазой»).

Затем рибонуклеазу A (RNase A, Life Technologies) в концентрации 0,1 мг/мл добавляли в каждую суспензию мертвых клеток молочнокислой бактерии и проводили обработку ферментом при температуре 37°C в течение 30 минут. После обработки осадки промывали 3 раза центрифугированием и ресуспендированием в дистиллированной воде и затем вновь суспендировали в дистиллированной воде в концентрации 10 мг (в расчете на сухую массу клеток)/мл, получая обработанный РНКазой продукт «обработанный РНКазой»).

В качестве экспериментальных животных использовали самцов мышей BALB/c (Japan SLC) в возрасте 7 недель, их умерщвляли в возрасте 7-9 недель, извлекая селезенки. Клетки селезенки собирали из извлеченных селезенок, обрабатывали раствором для лизиса эритроцитов (0,144 M хлорид аммония, 17 мМ трисгидроксиметиламинометан, pH 7,65) в течение 2 минут и центрифугировали, получая клетки селезенки, свободные от фракции эритроцитов. К этим клеткам селезенки и каждому из суспензии мертвых клеток молочнокислой бактерии (не обработанных ферментом), продукта, обработанного расщепляющим клеточную стенку ферментом (обработанного N-ацетилмурамидазой), и продукта, обработанного РНКазой (обработанного РНКазой), которые были получены ранее, добавляли среду, полученную путем добавления 10% ЭБС (эмбриональная бычья сыворотка, Life Technologies), 100 МЕ/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина к среде RPMI1640 (SIGMA-ALDRICH), получая тестируемые растворы, содержащие 2,5×10⁶ клеток селезенки/мл и суспензию мертвых клеток молочнокислой бактерии в конечной концентрации 5 мкг (в расчете на сухую массу клеток)/мл, продукт, обработанный расщепляющим клеточную стенку ферментом, или продукт, обработанный РНКазой. Каждый тестируемый раствор наносили в объеме 200 мкл в лунки 96-луночного планшета для микротитрования (BD Company) и инкубировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Через 2 дня культуральный супернатант собирали и концентрацию IL-12 p70 (гетеродимер p40-p35) в культуральном супернатанте измеряли с использованием набора для измерения (Mouse IL-12 p70 DuoSet, R&D Systems).

Тест проводили в трех повторах, и результаты приведены в таблице 2 и на фиг. 1.

Таблица 2
Количество IL-12, продуцируемое клетками селезенки мыши с молочнокислыми бактериями Штамм Продуцируемое количество IL-12 (пг/мл) (среднее ±S. D.) Не обработанные ферментом Обработанные N-ацетилмурамидазой Обработанные РНКазой MCC1849 407,6±35,3 436,7±49,1 252,8±25,0 FERM BP-11313 291,8±42,6 15,7±1,5 9,1±1,8 ATCC 53103 148,5±38,7 22,1±2,9 8,5±3,2 JCM 2012 101,3±6,7 19,7±6,8 17,5±2,4 JCM 1149 63,3±15,2 20,7±2,2 14,5±3,4 ATCC 11842 47,1±1,0 8,7±2,8 11,6±5,2

Штамм MCC1849 Lactobacillus paracasei продемонстрировал более высокую вызывающую продуцирование IL-12 активность, чем штамм FERM BP-11313, который, как известно, обладает высокой вызывающей продуцирование IL-12 активностью. Вызывающие продуцирование IL-12 активности других штаммов молочнокислых бактерий были ниже, чем активности этих вышеуказанных штаммов.

При обработке N-ацетилмурамидазой или РНКазой вызывающие продуцирование IL-12 активности штаммов молочнокислых бактерий, кроме штамма MCC1849, заметно снижались. Однако штамм MCC1849 сохранял высокую вызывающую продуцирование IL-12 активность даже после того, как его подвергали вышеуказанным обработкам. Поскольку вызывающая продуцирование IL-12 активность штамма FERM BP-11313, который является штаммом того же вида, что и штамм MCC1849, нарушалась при обработке N-ацетилмурамидазой или обработке РНКазой, было продемонстрировано, что стабильность вызывающей продуцирование IL-12 активности штамма MCC1849 является не свойством, присущим виду, но свойством, присущим штамму.

Пример 3: Способность штамма MCC1849 предотвращать инфекцию вируса гриппа

Возможность предотвращения инфекции вируса гриппа путем введения штамма MCC1849 исследовали на мышах.

Штамм MCC1849 культивировали в среде MRS в течение 16 часов, клетки промывали два раза дистиллированной водой и затем суспендировали в дистиллированной воде, к суспензии добавляли сахарозу и глютамат натрия и смесь лиофилизировали. Лиофилизированные клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе при плотности 1×10¹⁰ KOE/мл, получая суспензию живых клеток штамма MCC1849.

Штамм MCC1849 культивировали в среде MRS в течение 16 часов, клетки промывали два раза PBS и один раз дистиллированной водой, затем суспендировали в дистиллированной воде и подвергали тепловой обработке при температуре 100°C в течение 30 минут. После тепловой обработки клетки промывали два раза дистиллированной водой, суспендировали в дистиллированной воде и лиофилизировали. Лиофилизированные клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе в концентрации 5 мг/мл, получая суспензию мертвых клеток штамма MCC1849.

Суспензию живых клеток (группа живых) штамма MCC1849, суспензию мертвых клеток (группа убитых нагреванием (УН)) того же штамма и физиологический солевой раствор (контрольная группа) перорально вводили в объеме 0,2 мл мышам BALB/c в течение 14 дней и затем мышей инфицировали вирусом гриппа (штамм A/PR8/34(H1N1)) через носовую полость. Через шесть дней после инфицирования оценивали общее состояние глаз (степень открытости век и состояние век), шерсти (прилегание шерсти и пилоэрекция), дыхания (неравномерное дыхание) и поведения (степень спонтанного поведения) у мышей, и результаты этих наблюдений представляли в виде баллов в соответствии со следующими критериями для оценки начального состояния заболевания.

Нормальное состояние 0 Легкая инфекция 1 Умеренная инфекция 2 Тяжелая инфекция 3 Смерть: 4

Средние показатели в баллах для этих параметров использовали в качестве показателя симптомов в баллах для каждой отдельной мыши.

Затем, через 6 дней после инфекции, легкие извлекали и концентрацию вируса в легких измеряли методом бляшкообразования с использованием клеток MDCK (клетки почки собаки).

Результаты анализа приведены в таблице 3 и на фиг. 2.

По сравнению с группой, которой не вводили штамм MCC1849 (контрольная группа), показатель симптомов в баллах был значительно снижен, и концентрация вируса в легких (титр вируса) была также значительно снижена после введения любой из суспензии живых клеток штамма MCC1849 (группа живых) и суспензии мертвых клеток штамма MCC1849 (группа УН). Данные результаты продемонстрировали, что введение штамма MCC1849 как в виде живых клеток, так и в виде мертвых клеток является эффективной профилактикой инфекции вируса гриппа.

Таблица 3
Предотвращающее инфекцию вируса гриппа действие MCC1849 Показатель симптомов в баллах
(среднее ±S. D.) Концентрация вируса в легких (×10³ KOE)
(среднее ±S. D.) Физиологический солевой раствор (контрольная группа) 1,31±1,47 215,6±109,4 Суспензия живых клеток (группа живых) 0,26±0,41 47,7±62,6 Суспензия мертвых клеток (группа УН) 0,26±0,41 24,8±44,9

Промышленная применимость

Штамм по настоящему изобретению, штамм MCC1849 Lactobacillus paracasei, обладает высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью. Стимулирующая продуцирование IL-12 активность штамма практически не снижается при обработке расщепляющим клеточную стенку ферментом или обработке РНКазой. Вследствие этого считается, что индивидуальные различия в стимулирующей продуцирование IL-12 активности, наблюдаемые среди объектов применения штамма, будут незначительными, и, таким образом, штамм является полезным в качестве иммуностимулятора. Кроме того, штамм способен уменьшать инфекцию или пролиферацию вируса гриппа и так далее и может быть использован для профилактического и терапевтического лечения инфекционных заболеваний и так далее.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus paracasei MCC1849, обладающий высокой стимулирующей продуцирование IL-12 активностью. Штамм используют в качестве ингредиента лекарственного средства для иммуностимуляции, средства против вируса гриппа, продукта питания, напитка, корма и средства, стимулирующего продуцирование IL-12. 7 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 3 пр.

1. Штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei, предназначенный для стимулирования продуцирования IL-12.

2. Лекарственное средство для иммуностимуляции, отличающееся тем, что оно содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

3. Средство против вируса гриппа, отличающееся тем, что оно содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

4. Продукт питания, отличающийся тем, что он содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

5. Напиток, отличающийся тем, что он содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

6. Корм, отличающийся тем, что он содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

7. Стимулирующее продуцирование IL-12 средство, отличающееся тем, что оно содержит штамм МСС1849 (NITE ВР-01633) Lactobacillus paracasei.

8. Стимулирующее продуцирование IL-12 средство по п. 7, отличающееся тем, что оно находится в форме продукта питания или напитка.