МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ИНФЕКЦИЙ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/74 G01N33/569 

Данное изобретение относится к способу in vitro определения уровней прокальцитонина в плазме и моче в качестве диагностического маркера для идентификации пациентов с инфекциями мочевыводящих путей, in vitro способам для выполнения такого определения, набору для диагностики пациентов с инфекциями мочевыводящих путей и полезности прокальцитонина при диагностике инфекций мочевыводящих путей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Инфекции мочевыводящих путей (UTIs) являются распространенной проблемой, часто связанной с использованием мочевыводящего катетера (Hooton ТМ et al. Clin Infect Dis. 2010 Mar 1, 50 (5):625-63), и обычно вызваны сапрофитными бактериями в кишечном тракте и наружных половых органах и, менее типично, грибками и вирусами. Такие организмы в определенных условиях могут заселять мочевыводящие пути перед мочевым пузырем через мочеиспускательный канал. Клинически, инфекция мочевых путей сопровождается лихорадкой, расстройством мочеиспускания, затрудненным мочеиспусканием, частым мочеиспусканием, неотложным позывом к мочеиспусканию и болью спины умеренного уровня.

Клинические симптомы не всегда достаточны для того, чтобы поставить диагноз, особенно в подразделениях интенсивной терапии, где пациенты часто не могут сообщить свои симптомы и различные сочетанные заболевания могут часто маскировать точный источник инфекции.

Лабораторные тесты поэтому являются необходимыми как для выделения задействованных патогенов, так и для оценки любых осложнений и идентификации конкретного лечения.

Предпочтительный способ диагностирования инфекции мочевыводящих путей представлен получением посевов мочи. Данный тест позволяет выделение бактерии, ответственной за инфекцию, и оценку чувствительности или резистентности к антибиотикам при помощи антибиотикограммы. Время для получения результатов посевов мочи, варьируется от 24 до 48 часов в зависимости от задействованных микробных видов.

До получения результатов часто производили эмпирическое лечение, основанное только на клинических исследования, которое может привести к ненадлежащему использованию антибиотикотерапии и к тому, что пациенты будут иметь полностью неудовлетворительные (негативные) посевы мочи. Поэтому очень важной является потребность в определении новых инструментов для ранней диагностики UTI, способных прогнозировать возможные осложнения и улучшить результат, в особенности в определенных "сложных" ситуациях, таких как критично больные новорожденные или пациенты.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится к способу in vitro и набору для диагностики или контроля инфекций мочевыводящих путей. Изобретение, описанное в данной заявке, основано на открытии того, что концентрация прокальцитонина в образцах мочи больных имеет прогностическое значение для диагностики инфекции мочевыводящих путей. Кроме того, изобретатели также отметили, что у пациентов с инфекцией мочевыводящих путей концентрация прокальцитонина в моче превышает концентрацию в плазме прокальцитонина, в то время как у пациентов без инфекции мочевых путей концентрация прокальцитонина в моче ниже концентрации в плазме прокальцитонина. Определение концентрации прокальцитонина в моче может быть использовано для диагностики наличия инфекции мочевыводящих путей либо путем сравнения значения концентрации в моче пациентов со стандартными значениями и/или в соответствии с соотношением между концентрацией прокальцитонина в плазме и концентрацией прокальцитонина в моче.

Таким образом, объектом данного изобретения является способ in vitro диагностики и/или контроля инфекции мочевыводящих путей, в том числе стадии, в которой определяется концентрация прокальцитонина в пробе мочи пациента.

Объектом данного изобретения является также вышеупомянутый способ, который дополнительно включает стадию, в которой концентрация прокальцитонина плазмы указанного пациента также определяется.

Объектом данного изобретения является также набор для диагностики и/или контроля и/или оценки степени тяжести in vitro инфекции мочевыводящих путей, включая аликвоты реагентов, необходимых для определения концентрации прокальцитонина в пробе мочи и, необязательно, пробе плазмы.

Объектом данного изобретения является также применение прокальцитонина для диагностики и/или контроля инфекции мочевыводящих путей.

Данное изобретение имеет преимущество, будучи способным диагностировать и/или контролировать пациента с инфекцией мочевыводящих путей, используя очень простой, неинвазивный способ, а также способ, более быстрый, чем те, которые используются в методе, известном как посев мочи. Преимущества, характеристики и способы применения данного изобретения очевидны из приведенного ниже подробного описания некоторых вариантов, представленных в качестве примера и без ограничения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Популяция с позитивным посевом мочи. Данная Фигура показывает значения PCTur (прокальцитонин в моче) и PCTpl (прокальцитонин в плазме) у 10 пациентов с инфекцией мочевыводящих путей.

Фигура 2. Популяция с негативным посевом мочи. Данная Фигура показывает значения PCTur (прокальцитонин в моче) PCTpl (прокальцитонин в плазме) у 10 пациентов без инфекции мочевыводящих путей.

Фигуры 1 и 2 показывают, что значения PCTur превышают значения PCTpl в 9 из 10 случаев в популяции с позитивным посевом мочи и отсутствуют пациенты, относящиеся к популяции с негативным посевом мочи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет способ in vitro диагностики и/или контроля инфекции мочевыводящих путей. Способ в соответствии с данным изобретением дает возможность диагностировать и/или контролировать инфекции мочевыводящих путей. Способ в соответствии с данным изобретением дает возможность диагностировать наличие или отсутствие инфекции мочевыводящих путей, оценивать (диагностировать) тяжесть инфекции относительно однократного определения (т.е. чем выше концентрация прокальцитонина, тем более тяжелая инфекция, риск напластования при первом определении) и контролировать прогресс инфекции в течение лечения инфекции.

Термин ʺинфекция мочевыводящих путейʺ в данной заявке означает инвазию мочевыводящих путей, которая обычно стерильна, микробами (бактериями, грибками и/или вирусами) в количествах, которые определяют воспалительный ответ уротелия.

Примеры микроорганизмов, которые могут вызывать инфекцию мочевыводящих путей, представляют собой Е. Coli, Proteus Mirabilis, Е. Faecalis, Saprophyticus, Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Candida albicans, и т.д. Эпидемиологические данные показывают, что в трети случаев инфекции мочевыводящих путей связаны с применением мочевыводящего катетера. Данное изобретение может быть применено как к пациентам, которые носят временные или постоянные мочевыводящие медицинские устройства (катетеры, нефростомы, цистостомы), так и к пациентам всех возрастов без таких устройств.

Способ в соответствии с данным изобретением включает стадию, в которой определяют концентрацию прокальцитонина в пробе мочи пациента. Прокальцитонин (РСТ) является предшественником кальцитонина, гормона, отвечающего за гомеостаз кальция, который вырабатывается мозговыми нейроэндокринными С-клетками щитовидной железы.

Предпочтительно способ согласно изобретению включает еще одну дополнительную стадию, в течение которой также определяют концентрацию прокальцитонина в пробе плазме указанного пациента. Определение прокальцитонина не только в моче, но и в плазме может более точно диагностировать наличие или отсутствие инфекции мочевыводящих путей у пациентов, моча и плазма которых были проанализированы. Клинические исследования, проведенные изобретателями, фактически показали, что у всех пациентов с инфекцией мочевыводящих путей значения прокальцитонина в моче выше, чем в плазме, в то время как данное значение ниже у негативных пациентов. Этот вариант исполнения может быть использован, например, у пациентов, у которых значения прокальцитонин в моче не достаточно, чтобы дать определенные указания на наличие или отсутствие инфекции мочевыводящих путей, или у пациентов сложной клинической картиной (например, возможное присутствие как инфекции мочевыводящих путей, так и системной инфекции).

В общем, для определения концентрации прокальцитонина в моче и/или плазме любой способ, хорошо известный специалистам данной области, который позволяет определение концентрации прокальцитонина в биологической жидкости, может считаться приемлемым для целей данного изобретения. Например, количественные и полуколичественные коммерческие иммуноанализы, такие как LU М Itest® РСТ хемилюминесценция, LIAISON®, BRAHMS РСТ®, TRACE: KRYPTOR®, BRAHMS РСТ, PCT®-Q. Условия анализа могут быть изменены, чтобы избежать возможных помех, вызванных компонентами мочи матрицы.

Концентрация прокальцитонина в моче и/или плазме испытуемой пробы будет определена путем инкубации пробы при приемлемых температурах и приемлемых периодах времени с первичным антителом, специфичным для прокальцитонина, суспендированным в соответствующих концентрациях в приемлемом буфере. Термин «антитело» в данной заявке относится к целому антителу или фрагменту антитела, фрагмент антитела включает, но не ограничивается приведенным, фрагменты F(ab’)2 и Fab’ или одноцепочечные антитела.

Для целей настоящей заявки термин ʺпервичные антитела, специфичные для прокальцитонинаʺ относится к любому антителу, способному селективно связывать какую-либо часть прокальцитонина.

Разработку селективных антител для определенного белка в настоящее время осуществляют с использованием традиционных методов, которые изложены в лабораторных руководствах, а также предоставляется как услуга многочисленными компаниями. Поэтому не будет необходимости в этой заявке представлять дополнительную информацию о создании антител, которые также можно заказать у соответствующих компаний.

Поэтому, чтобы создать первичные специфические антитела для прокальцитонина, любая стандартная методика будет достаточной для разработки как поликлональных, так и моноклональных антител. Дополнительно, антитела, специфичные для прокальцитонина, также доступны на рынке (например, коммерческие антитела, которые могут быть использованы, являются коммерческими антителами компания Abeam с кодами ab53897 (кроличьи поликлональные), ab90489 (мышиные моноклональные), ab24454 (HRP конъюгированные мышиные моноклональные), ab14817 (HRP конъюгированные мышиные моноклональные)) и могут быть использованы для целей данного изобретения без дополнительной информации, предоставляемой в данной заявке. Подробная информация о протоколах инкубации первичных антител хорошо известна специалистам в данной области и, в случае использования коммерческих антител, подробности приведены в инструкции поставщика. Эти протоколы инкубации включают использование соответствующих буферов, таких как ФБС (фосфатный буферный солевой раствор) или при использовании коммерческих антител, буферов, специально рекомендованных производителем.

Для того чтобы детектировать первичное антитело, оно может быть отмечено любым соединением, которое широко используется в маркировке антител и флуорофором, который может быть использован, в частности, выбран из группы, состоящей из: гидроксикумарина, аминокумарина, метоксикумарина, европия, самария, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665 или ферментов, таких как щелочная фосфатаза или пероксидаза.

Альтернативно, если используют первичное антитело, которое непосредственно не мечено, первичное антитело может быть детектировано путем использования любых меченых вторичных антител, которые избирательно распознают указанное первичное антитело. Как известно из литературы, вторичное антитело, специфичное для постоянного участка, известно также как Fc часть, первичного антитела, которое, в свою очередь, зависит от типа животного, используемого для развития первичного антитела самого по себе. Иными словами, это тип животного, которого используют для иммунизации с задействованным эпитопом (первичным антителом), которое определяет характер вторичного антитела, поэтому, например, если первичные антитела получают из кролика, вторичное будет анти-кроликовым, если иммунизированным животным является овца, вторичное антитело будет антиовечьим, если первичное антитело развилось у мыши, вторичное антитело будет анти-мышиным вторичным антителом, и т.д..

Вторичные антитела могут быть мечены любым соединением, которые широко используются в маркировке антител, и может быть использован флуорофор, который, в частности, выбирают из группы, состоящий из: гидроксикумарина, аминокумарина, метоксикумарина, европия, самария, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665 или ферментов, таких, как щелочная фосфатаза или пероксидаза.

В одном варианте исполнения концентрация прокальцитонина может быть определена с помощью анти-прокальцитонинового первичного антитела, например, поликлонального антитела, конъюгированного с флуоресцентным маркером, таким как европий, и анти-прокальцитонинового вторичного антитела, которое распознает эпитоп, отличный от распознанного первичным антителом, таким как моноклональное антитело, конъюгированное с флуоресцентным маркером, таким как XL665.

Способ в соответствии с данным изобретением может быть выполнен вручную или с помощью любого инструмента, известного специалисту в данной области, способного автоматически выполнять указанный способ, например лабораторных инструментов, таких как Kryptor BRAHMS, или других способов, используемых для определения прокальцитонина в плазме (например, LUMItest® РСТ-LIAISON®, BRAHMS PCT®-Q) могут быть использованы. В одном варианте исполнения значение концентрации прокальцитонина в моче сравнивают с одним или несколькими значениями, которые указывают на наличие или отсутствие инфекции мочевыводящих путей, для которых концентрация менее 0,05 нг/мл позволяет прогнозировать отсутствие инфекции мочевыводящих путей и/или концентрации более 0,3 нг/мл является предиктором наличия инфекции мочевыводящих путей.

В одном варианте исполнения способ согласно данному изобретению может включать дополнительную стадию, в которой значение концентрации прокальцитонина в моче сравнивают со значением концентрации прокальцитонина в плазме, где отношение между концентрацией прокальцитонина в моче и прокальцитонина в плазме более 1 является предиктором наличия инфекции мочевыводящих путей.

Объектом данного изобретения является также набор для диагностики и/или прогнозирования in vitro инфекции мочевыводящих путей, содержащий аликвоты реагентов, необходимых для определения концентрации прокальцитонина в пробе мочи и, необязательно, в пробе плазмы.

Впервые, следовательно, представлен более быстрый инструмент, который может быть использован для идентификации пациентов, которые имеют инфекцию мочевых путей и/или для контроля за течением инфекции с учетом определенных протоколов лечения.

В своей простейшей форме набор будет содержать одну или более аликвот специфических анти-кальцитониновых антител и сопроводительную листовку, например, содержащую инструкции для интерпретации результатов диагностики, и, необязательно, средства для сбора и хранения пробы мочи и/или плазмы. Для целей данного изобретения любое антитело, которое может избирательно связывать прокальцитонин, может быть включено в комплект, заявленный в данной заявке. В частности, комплект может содержать одно или более анти-прокальцитониновых антител, которые создаются, например, для различных эпитопов белков и антител, и возможно, будут в состоянии быть конъюгированными с общими маркерами антител, таких как флуорофоры или ферменты. Набор может, при необходимости, содержать использование моноклональных и/или поликлональных анти-прокальцитониновых антител на рынке. Набор также может содержать сопровождающие листовки. Эти листовки могут указывать компоненты набора и рекомендуемый протокол. Кроме того, инструкция может также содержать информацию относительно толкования значения прокальцитонина, полученного для мочи и плазмы крови, которые анализируют, и, в частности, как уже говорилось, концентрация прокальцитонина в моче менее 0,05 нг/мл является предиктором отсутствия инфекции мочевыводящих путей, концентрации более 0,3 нг/мл является предиктором наличия инфекции мочевыводящих путей, a PCTur/PCTpl отношение > 1 является предиктором наличия инфекции мочевыводящих путей, где PCTur является прокальцитонином в моче пациента и PCTpl является прокальцитонином в плазме. Набор также может содержать одну или более аликвот вторичных антителам, специфичных для первичного антитела. Вторичные антитела, как известно специалистам в данной области и, как отмечалось выше, должны быть в состоянии специфически распознавать постоянную часть использованных первичных антител, поэтому выбор используемого вторичного антитела будет зависеть от животного, иммунизированного эпитопом, который рассматривают. Вторичные антитела могут быть мечены любым соединением, которые широко используются в маркировке антител.

Набор также может содержать одну или более аликвот негативного и/или позитивного контроля. Отрицательный контроль означает любую пробу мочи или плазмы пациента, который не имеет инфекции мочевыводящих путей. В одном конкретном варианте исполнения отрицательный контроль может быть представлен пробой мочи с концентрацией прокальцитонина менее 0,05 нг/мл.

Позитивный контроль позволит анализ правильности повторной процедуры и возможную валидность использованных способов, так как он может содержать пробу плазмы или мочи пациента с инфекцией мочевыводящих путей. В частности, позитивным контролем, наиболее приемлемым, но не ограничиваемым данным изобретением, будет проба мочи с концентрацией прокальцитонина более 0,3 нг/мл.

Набор также может содержать одну или более аликвоту реагентов для детекции прокальцитонина в моче и/или плазме. Эти реагенты состоят из любого раствора, полезного для проведения различных стадий, приводящих к выявлению значения концентрации прокальцитонина в анализируемой пробе. В частности, могут быть использованы буферные растворы, например, и без ограничения, ФБС (фосфатный буферный солевой раствор); блокирующий раствор, такой как ФБС, дополненный бычьим сывороточным альбумином. Объектом данного изобретения является также применение прокальцитонина в диагностике, контроле и оценке степени тяжести инфекции мочевыводящих путей, такой как инфекции, связанные с использованием мочевыводящего катетера.

Далее приведены экспериментальные результаты и примеры, предназначенные для иллюстрации докладов, содержащихся в данном описании: данные примеры не должны рассматриваться как ограничение приведенного выше описания и последующей формулы изобретения.

Описание популяции, используемой в клиническом исследовании пациентов с подозрением на инфекцию мочевыводящих путей.

Пациенты, поступившие в отделение интенсивной терапии с подозрением на инфекцию мочевыводящих путей, были набраны для клинического исследования. Каждый пациент был одновременно подвергнут следующим анализам: стандартный анализ мочи (химический и физический осмотр) и посев мочи;

РСТ плазмы;

РСТ мочи.

На основании результатов посева мочи были зачислены 10 пациентов с положительным посевом мочи и 10 пациентов с негативным посевом мочи. В общей сложности были зачислены 20 пациентов (9 женщин и 11 мужчин), средний возраст 70 лет. Возраст отобранных пациентов варьировался от 33 до 91 года.

Каждый пациент должен был представить по крайней мере один из следующих критериев включения:

- лихорадка или гипотермия;

- лейкоцитоз/лейкопения;

- боль в пояснице и/или дизурия;

- другие необъяснимые признаки ССВО;

- лихорадка неизвестного происхождения;

- рецидивирующая инфекция мочевыводящих путей.

Критериями исключения были:

1. олигурия/анурия;

2. наличие уретеросигмостомии;

3. почечные нарушения, предотвращающие достаточном количество отобранных проб мочи;

4. печеночная недостаточность.

Посев мочи считается позитивным, если есть развитие 105 КОЕ/мл для не более чем двух микроорганизмов (полимикробная этиология в 14-30% случаев). В случае Candida spp. Значимым пороговым значением считали 10⁴ КОЕ/мл. Кроме того, для грамположительных (особенно коагулазонегативных энтерококков и стафилококков) и в случае антимикробной терапии наблюдается тенденция рассматривать количество менее чем 10⁵ КОЕ/мл как значимое.

Результаты клинического исследования

Популяция с позитивным посевом мочи, как было показано, имеет более высокие РСТ в моче, чем РСТ в плазме в 9 из 10 случаев (Фигура 1).

Среднее значение РСТ в моче составило 1,4 нг/мл, в то время как среднее значение РСТ в плазме составило 0,4 нг/мл. Значение РСТ в моче находилось в диапазоне от 0,36 до 2,54 нг/мл, в то время как значение РСТ в плазме находилось в диапазоне от 0,06 до 1,22 нг/мл.

Срединное значение РСТ в моче составляло 1,25 нг/мл и срединное значение РСТ в плазме составляло 0,24 нг/мл.

Соотношение между РСТ в моче и РСТ в плазме имело значение от 0,8 до 25,33 нг/мл, среднее значение 7,32 нг/мл и срединное значение 4,86 нг/мл. Средняя температура субъектов составляла 37,02°C, где 1 пациент имел температуру <35°C, 3 пациента >=36°C и <37°C, 4 пациента >=37°C и <38°C и 2 пациента >=38C°.

Значение лейкоцитов (nv 4,50 - 10,00×10³/мкл) находилось в диапазоне от 5,37 до 22,12×10³/мкл со средним значением 12,22×10³/мкл и срединным значением 11,55×10³/мкл.

Процентное содержание нейтрофилов (nv 40,0 - 75,0%) находилось в диапазоне от 67,3 до 88,4% со средним значением 78,8%.

Содержание креатинина у субъектов (nv 0,50 - 0,90 мг/дл) находилось в диапазоне от минимум 0,3 до максимум 2,85 мг/дл со средним значением 0,78 мг/дл.

Для расчета значения клиренса креатинина использовали следующую формулу Кокрофта-Гаулта:

○ мужчины [(140 - возраст) × масса тела (кг) / (сывороточный креатинин × 72)]

○ женщины [(140 - возраст) × масса тела (кг) / (сывороточный креатинин × 72)].

У субъектов исследования клиренс находился в диапазоне от 27 до 226,8 мл/мин со средним значением 129,16 мл/мин и срединным значением 115,4 мл/мин.

Популяция с негативным посевом мочи, как было показано, имела более низкие значения РСТ в моче, чем РСТ в плазме, для всех пациентов.

Среднее значение РСТ в моче составляло 0,6 нг/мл, в то время как среднее значение РСТ в плазме составляло 4,44 нг/мл. Значение РСТ в моче находилось в диапазоне от 0,13 до 1,38 нг/мл, в то время как значение РСТ в плазме находилось в диапазоне от 0,35 до 25,72 нг/мл.

Срединное значение РСТ в моче составляло 0,36 нг/мл и срединное значение РСТ в плазме составляло 1,36 нг/мл.

Соотношение между РСТ в моче и РСТ в плазме имело значение от 0,03 до 0,9 нг/мл, среднее значение 0,40 нг/мл и срединное значение 0,37 нг/мл.

Средняя температура субъектов составляла 37,7°C, где 1 пациент имел температуру >=36°C и <37°C, 1 пациент >=38°C и <39°C, и 8 пациентов >=38°C.

Значение лейкоцитов находилось в диапазоне от 4,27 до 39,2×10³/мкл со средним значением 12,86×10³/мкл и срединным значением 8,61×10³/мкл.

Процентное содержание нейтрофилов находилось в диапазоне от 65,5 до 93,9% со средним значением 85,5%.

Содержание креатинина у субъектов находилось в диапазоне от минимум 0,55 до максимум 1,61 мг/дл со средним значением 0,97 мг/дл.

Используя формулу Кокрофта-Гаулта, значение клиренса креатинина находилось в диапазоне от 38,4 до 169,4 мл/мин со средним значением 78,72 мл/мин и срединным значением 76,1 мл/мин.

В популяции пациентов с негативным посевом мочи значения PCTur ниже значений PCTpl наблюдали у всех 10 пациентов в популяции с негативным посевом мочи и только в 1 случае в популяции с позитивным посевом мочи. (Фигура 2). Последний пациент был единственным субъектом, у которого была зарегистрирована тяжелая почечная дисфункция, показанная значением клиренса креатинина 27 мл/мин, оцененным по формуле Кокрофта-Гаулта. Поэтому возможно накопление РСТ в плазме у субъекта с тяжелой почечной дисфункцией без надлежащей экскреции в мочу, и это привело к значению PCTpl больше значения PCTur несмотря на позитивный посев.

В популяции пациентов с позитивным посевом мочи срединные значения PCTur составляли 1,25 нг/мл, в то время как в популяции с негативным посевом мочи данное значение составляло 0,36 нг/мл, указывая на четкую дифференциацию двух групп.

Срединные значения PCTpl также демонстрируют значительное различие: в популяции с позитивным посевом мочи его значение (0,24 нг/мл) указывает на то, что большинство субъектов не имеют какой-либо иной инфекции, в то время как в популяции с негативным посевом мочи его значение (1,36 нг/мл) указывает на то, что большинство пациентов имеют бактериальную инфекцию. (Фигура 24)

Чтобы оценить, повлияло ли на точность измерения РСТ применение мочи в качестве матрицы пробы, пять проб мочи и сыворотки, каждая из которых была взята от здоровых субъектов с недетектируемыми РСТ, разбавляли рекомбинантными РСТ и измеряли в анализе KRYPTOR РСТ. Восстановление РСТ в моче было на 20-30% ниже, чем в сыворотке. Поэтому степень принижения восстановления в моче относительно невелика, и сделанные ранее выводы поддерживаются, даже если восстановление в моче и сыворотке не было идентичным. Значения РСТ в моче, определенные в клинических пробах данного изобретения, могут быть скорректированы путем их умножения на 1,25 для пояснения уменьшенного восстановления в матрице мочи.

Данные, экстраполированные из результатов клинического исследования, подвергали статистическому анализу для оценки того, может ли быть соотношение PCTur/PCTpl>1 способно диагностировать инфекцию мочевыводящих путей селективно и специфично.

Пациенты с Пациенты без Всего инфекцией инфекции Тест+ A B A+b Тест- C d C+d Всего A+с B+d Пациенты с Пациенты без Всего инфекцией инфекции Тест+ 9 0 9 Тест- 1 10 11 Всего 10 10 20

Сенситивность представляет собой вероятность того, что инфицированный пациент является позитивным к тесту и в нашем случае: Сенситивность = а/а+с=9/(9+1)=0,9 т.е. 90%.

Специфичность, с другой стороны, представляет собой вероятность того, что здоровый субъект является негативным к тесту и в нашем случае: Специфичность = d/b+d=10/(0+10)=1 т.е. 100%

Мы можем также рассчитать позитивное предикативное значение (PPV), соответствующее пропорции субъектов с позитивными тестами, имеющими инфекцию и поэтому корректно диагностированными как инфицированные: PPV=а/а+b=9/(9+0)=1 т.е. 100%.

Пример 1 Измерение прокальцитонин в плазме

Пробу крови для анализа собирали у пациента при помощи BRAH MS РСТ сенситивного KRYPTOR, набора, разработанного для доз прокальцитонина в автоматических анализах иммунофлуоресценции проб человеческой сыворотки или плазмы (ЭДТК, гепарин). Данный количественный способ использует овечье анти-прокальцитониновое поликлональное антитело, конъюгированное с флуоресцентным маркером, криптатом европия и другими веществами, такими как буфер, включая бычий альбумин, не-иммунизированный мышиный иммуноглобулин и фторид калия; моноклональное мышиное анти-прокальцитониновое антитело, также конъюгированное с флуоресцентным маркером XL665 и буфером, бычьим альбумином, мышиным иммуноглобулином, фторидом калия; и наконец, доступен готовый к употреблению разжижитель, образованный из человеческой сыворотки, Kathon, ЭДТК.

Измерение РСТ в данном анализе основано на технологии TRACE (усиленная кодированная эмиссия с временным разрешением), которая измеряет сигнал, испускаемый иммунокомплексом с временной задержкой. Пробу облучали азотным лазером при 337 нм и донор (криптат) излучал длительный флуоресцентный сигнал в миллисекундном диапазоне при 620 нм, в то время как акцептор (XL 665) генерировал краткий сигнал в диапазоне наносекунд при 665 нм. При образовании иммунокомплекса, как усиление сигнала, так и увеличенная продолжительность сигнала акцептора происходят при 665 нм и сигнал может быть измерен в микросекундах.

РСТ молекулы размещены между двумя антителами и путем измерения длины сигнала получают значение РСТ, непосредственно пропорциональное времени эмиссии сигнала.

Пример 2 Измерение прокальцитонин в моче

Пробу мочи отбирали при помощи шприца из соответствующего места дренирования мочевыводящего катетера после зажима выпуска и дезинфекции. Приблизительно 4 мл мочи переносили в соответствующую пробирку для транспортировки в аналитическую лабораторию. Определение РСТ в моче после отбора пробы выполняли в соответствии с протоколом, представленным для РСТ в плазме, как описано в Примере 1.

БИБЛИОГРАФИЯ

Hooton ТМ et al. Diagnosis, prevention, and treatment of catheter-associated urinary tract infections in adults: 2009 International Clinical Practice Guidelines from the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 2010 Mar 1; 50(5):625-63.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу диагностики бактериальной инфекции мочевыводящих путей in vitro. Способ диагностики бактериальной инфекции мочевыводящих путей in vitro у пациента, имеющего по меньшей мере один симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенной температуры или гипотермии, лейкоцитоза/лейкопении, боли в пояснице и/или дизурии, признаков синдрома системной воспалительной реакции, лихорадки неизвестной природы, рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей, включающий стадии определения концентрации прокальцитонина в пробах мочи и плазмы указанного пациента, и где величина соотношения между концентрацией прокальцитонина в моче и прокальцитонина в плазме крови более 1 является предиктором в отношении наличия инфекции мочевыводящих путей. Применение набора для диагностики бактериальных инфекций мочевыводящих путей in vitro. Вышеописанный способ позволяет эффективно диагностировать бактериальные инфекции мочевыводящих путей in vitro. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Способ диагностики бактериальной инфекции мочевыводящих путей in vitro у пациента, имеющего по меньшей мере один симптом, выбранный из группы, состоящей из повышенной температуры или гипотермии, лейкоцитоза/лейкопении, боли в пояснице и/или дизурии, признаков синдрома системной воспалительной реакции, лихорадки неизвестной природы, рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей, включающий стадии определения концентрации прокальцитонина в пробах мочи и плазмы указанного пациента, и где величина соотношения между концентрацией прокальцитонина в моче и прокальцитонина в плазме крови более 1 является предиктором в отношении наличия инфекции мочевыводящих путей.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию прокальцитонина определяют при помощи первичного антитела, специфичного для прокальцитонина.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанное первичное антитело непосредственно мечено флуорохромом, выбранным из группы, включающей: гидроксикумарин, аминокумарин, метоксикумарин, европий, самарий, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что концентрацию прокальцитонина определяют при помощи вторичного антитела, меченного соединением, выбранным из группы, включающей: гидроксикумарин, аминокумарин, метоксикумарин, европий, самарий, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанное вторичное антитело является специфичным для указанного первичного антитела.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная инфекция мочевыводящих путей связана с применением мочевыводящего катетера.

7. Применение набора, содержащего аликвоты реагентов, необходимых для определения концентрации прокальцитонина в пробе мочи, для диагностики бактериальных инфекций мочевыводящих путей in vitro.

8. Применение набора по п. 7, при котором концентрацию прокальцитонина определяют также в пробе плазмы.

9. Применение набора по п. 7, содержащего одну или более аликвот первичного антитела, специфичного для прокальцитонина.

10. Применение набора по п. 9, отличающееся тем, что указанное первичное антитело непосредственно мечено соединением, выбранным из группы, включающей: гидроксикумарин, аминокумарин, метоксикумарин, европий, самарий, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665.

11. Применение набора по п. 10, дополнительно содержащего одну или более аликвот вторичного антитела, меченного соединением, выбранным из группы, включающей: гидроксикумарин, аминокумарин, метоксикумарин, европий, самарий, FITC, Cy3, Cy5, Cy2, Cy7, XL665.

12. Применение набора по любому из пп. 8-11, отличающееся тем, что указанные реагенты содержат одну или более аликвот буферных растворов, и/или одну или более аликвот связывающих растворов, и/или одну или более аликвот реагентов для детекции меченых антител.

13. Применение набора по п. 8, дополнительно содержащего одну или более аликвот негативного контроля и/или одну или более аликвот позитивного контроля.

14. Применение набора по п. 13, отличающееся тем, что величина соотношения между концентрацией прокальцитонина в моче и прокальцитонина в плазме крови у пациента более 1 является предиктором в отношении наличия инфекции мочевыводящих путей.