Способ дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/493 G01N33/53 C07K14/79 

Изобретение относится к области медицины, а именно к урологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни путем определения в моче человека концентрации антибактериального пептид лактоферрицина.

Пиелонефрит очень часто сопровождает мочекаменную болезнь (МКБ), доброкачественную гиперплазия простаты, аномалии развития мочеполовых органов и другие урологические заболевания. Наоборот, у большого числа пациентов с уролитиазом (МКБ), нуждающихся в неотложной урологической помощи, наблюдаются почечная колика или вторичный пиелонефрит. Несмотря на многообразие методов лечения и лекарственных средств количество острых пиелонефритов и рецидивов хронического пиелонефрита увеличивается (Лопаткин Н.А., Камалов А.А., Аполихин О.И. и др. Урология. М.: ГЭОТАРМедиа, 2013; 816 с.; Аляев Ю.Г., Глыбочко П.В., Пушкарь Д.Ю. Урология. Российские клинические рекомендации. М.: ГЭОТАРМедиа, 2015; 480 с. ).

Кроме того, в последние годы изменилась и сама клиническая картина пиелонефрита, проявляющаяся в более частом выявлении малосимптомных форм болезни, несмотря на выраженные воспалительно-деструктивные изменения в органах мочевыделительной системы (МВС). В этой связи в качестве альтернативы или дополнения к антибиотикам повышенный интерес представляют антимикробные пептиды (АМП), прежде всего те, которые синтезируются лейкоцитами или эпителиальными клетками МВС (Веснина Ж.В. Новые и потенциальные биомаркеры острого повреждения почек // Клиническая лабораторная диагностика. - 2018. - Т. 63, №7. - С. 388-396.).

Доказано, что и активированные нейтрофилы, и эпителиоциты в моче секретируют такие АМП как лактоферрин, липокалин, кателицидин, α- и β-дефенсины и другие (Захарова И.Н., Османов И.М., Климов Л.Я., Касьянова А.Н., Курьянинова В.А., Лупан И.Н. Роль антимикробных пептидов в защите от инфекций мочевых путей. // Медицинский совет.-2019. - №2. - С.143-150).

Было обнаружено, что структурным участком белка лактоферрина, ответственным за бактерицидные свойства, является короткий концевой пептид, называемый лактоферрицином (Серебряков А.А., Коханов А.В., Николаев А.А. Уропротеины с антибактериальными свойствами: клинико-диагностическое значение. // Астраханский медицинский журнал. - 2020. - Т.15, №3. - С. 32-47).

По информации, содержащейся в базе данных UniProt, ЛФЦ человека состоят из 48 аминокислотных остатка и имеют молекулярную массу 5345 Да (Silva Т., Magalhães В., Maia S., Gomes P., Nazmi К., Bolscher J.G.M., Rodrigues P.N., Bastos M., Gomesa M.S. Killing of Mycobacterium avium by lactoferricin peptides: improved activity of arginine- and d-amino-acid-containing molecules. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2014. - V. 5(6). - P. 3461-3467).

Существующие способы дифференциальной диагностики МКБ от обструктивного или необструктивного пиелонефрита основаны на неинвазивных инструментальных или инвазивных лабораторных методах.

Известны способы диагностики обструктивного (пиелонефрит на фоне МКБ) или необструктивного пиелонефрита (пиелонефрит без клинических признаков МКБ) аппаратными методами с помощью ультразвукового исследования (УЗИ), компьютерной томографии (КТ), магнитнорезонансной томографии (МРТ), внутривенной урографии (Н.А. Лопаткин. Урология. Национальное руководство. Москва. 2013 г. 442-444), которые позволяют диагностировать уже развившийся гнойно-воспалительный процесс, но не позволяющий осуществлять дифференциальную диагностику МКБ и пиелонефрита на ранних доклинических стадиях при впервые возникших приступах почечной колики.

Известны способ диагностики гнойного пиелонефрита путем лабораторного обследования: общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи, проба Реберга, бактериологический посев мочи с целью выявления возбудителя, его количества и чувствительности к антибактериальным препаратам (Н.А. Лопаткин. Клинические рекомендации. Урология. 2007 г., г Москва. 178-179.). Однако лабораторные анализы указывают на степень тяжести воспалительного процесса, но не определяют наличие или отсутствие гнойного процесса, тем более не могут спрогнозировать развитие гнойного пиелонефрита.

В настоящее время для диагностики почечного повреждения и нарушений функции почек используются показатели снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ), электролитных нарушений, повышения уровня креатинина, мочевины (Бобкова И.Н., 2005; Бельков В.В., 2011; Захарова Н.Б. с соавт., 2019).

Наибольшее значение для дифференциальной диагностики урологической патологии имеют иммунохимические методы определения в моче различных белковых маркеров с помощью иммуносенсорной технологии, иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунохроматографического анализа (ИХА).

Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики бактериальной инфекции мочевыводящих путей in vitro, включающий стадию определения концентрации прокальцитонина в пробах мочи и плазмы, и если величина соотношения между концентрациями прокальцитонина в моче (PCTur) и прокальцитонина в плазме крови (PCTpl) более 1 (PCTur/PCTpl отношение > 1), то это является предиктором в отношении наличия инфекции мочевыводящих путей (патент РФ №2611371 опубл. 21.02.2017 Бюл. №6).

Недостатками прототипа являются:

- не специфичность используемого индикатора в отношении инфекционного агента;

- большое число ложноположительных и ложноотрицательных результатов;

- дороговизна процедуры анализа;

- необходимость для обследования двух жидкостей пациента;

- способ не позволяет дифференцировать пиелонефрит от МКБ.

Изобретение направлено на повышение точности и упрощение процедуры дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни путем исследования мочи человека.

Поставленная в изобретении цель достигается тем, что в моче у пациентов с подозрением на пиелонефрит и/или мочекаменную болезнь иммунохимическим методом определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина и при концентрации лактоферрицина мочи выше 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит, при концентрации лактоферрицина мочи ниже 5 нг/мл диагностируют мочекаменную болезнь и при концентрации лактоферрицина мочи от 5 до 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит на фоне мочекаменной болезни.

Иммунохимический метод регистрации антимикробного пептида лактоферрицина, основанный на реакции антиген-антитело, имеет ряд преимуществ перед спектрофотометрическими и другими методами регистрации результата измерения, к числу которых относятся универсальность, избирательность, специфичность, высокая чувствительность.

Для получения иммуногенных конъюгатов для неиммуногенного пептида лактоферрицина мы связывали его с молекулой бычьего сывороточного альбумина (БСА) как описано в работах Чехонина В.П. (Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. - М.: Медицина, 1999. - 416 с. ).

Полученные конъюгаты далее использовали для иммунизации кроликов по стандартным протоколам до получения гипериммунной поликлональной антисыворотки. После процедуры истощения (адсорбции) полученной антисыворотки препаратами БСА получали моноспецифическую антисыворотку к лактоферрицину человека. Для различных иммунохимических методов определения лактоферрицина в пробах мочи в качестве тест-системы использовали либо полученную антисыворотку, либо выделенную из нее иммуноглобулиновую фракцию, содержащую антитела против лактоферрицина человека.

Предложенный нами способ внедрен в работу урологического отделения Александро-Мариинской областной клинической больницы (АМОКБ) и ГКБ №3 г. Астрахани и использован при обследовании 38 пациентов с МКБ, 47 больных с необструктивным пиелонефритом и 64 больных обструктивным пиелонефритом.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Больной М. 55 лет, поступил 17.04.20 г. через двое суток от начала заболевания в приемное отделение городской клинической больницы №3 г. Астрахани с жалобами на тошноту, не уменьшающиеся боли в правой подвздошной области, ноющего характера.

Общее состояние больного при поступлении удовлетворительное. Температура тела 37,3°С, частота пульса 76 ударов в минуту, АД 125/75 мм рт. ст. Со стороны сердца и легких изменений нет.

Анализ крови: гемоглобин 134 г/л, эритроциты 4,8×10¹²/л, гематокрит 0,4 л/л, СОЭ 5 мм/ч, лейкоциты - 6,8×10⁹/л, эозинофилы - 2%, палочкоядерные нейтрофилы - 4%, сегментоядерные - 69%, лимфоциты - 22%, моноциты - 3%. Общий белок 62 г/л, общий билирубин - 13,3 мкмоль/л. При исследовании мочи изменений не обнаружено.

Бактериологические исследования мочи проведенное на бактериологический анализатор гемокультур Bact/Alert 3D 60, bioMerieux Inc. США не обнаружило в моче признаков бактериурии.

В лаборатории приемного отделения выполнен анализ мочи на лактоферрицин методом ИФА. Результат исследования: концентрация лактоферицина в образце мочи - 3 нг/мл (таблица).

Полученные значения лактоферрицина мочи соответствуют клиническому диагнозу: МКБ.

Пример 2. Больной Н. 45 лет, доставлен бригадой скорой помощи в приемное отделение ГБУЗ АО ГКБ №3 г. Астрахани ночью 27.01.21 г. через 12 часа от начала болевого приступа с направительным диагнозом «Острый аппендицит». Жалобы на боли постоянного характера по всему животу и в правой поясничной области, тошноту, учащенное и болезненное мочеиспускание. Была рвота; озноба не было. Аналогичный приступ болей 19 лет тому назад, других заболеваний не отмечает.

Объективно: общее состояние при поступлении удовлетворительное. Температура тела 37,3°С, частота пульса 96 ударов в минуту, ритмичный, удовлетворительного наполнения, АД 140/90 мм рт. ст. Сердце и легкие без изменений. Язык влажный, слегка обложен.

Анализ крови: лейкоциты 7,6×10⁹/л, незначительный сдвиг лейкоцитарной формулы влево. Уровень мочевины крови - 6,1 ммоль/л, креатинин - 82,4 ммоль/л, скорость клубочковой фильтрации (СКФ) расчетным методом - 62,3 мл/мин/1,73 м².

Общий анализ мочи: белок - 0,8 г/л, лейкоциты - до 30-40 в поле зрения, эритроциты - до 300 в поле зрения.

Посев мочи для бактериологического исследования взят 27.01.2021 г., результаты бактериологического исследования мочи получены 3 февраля 2021 г. - выявлен рост Е. coli.

Анализ мочи на лактоферрицин методом ИФА - 15 нг/мл (таблица).

Полученные значения лактоферицина мочи соответствуют клиническому диагнозу: Пиелонефрит.

Пример 3. Больная Ю., 64 года, доставлена в приемное отделение городской клинической больницы №3 г. Астрахани 7.09.2020 г. с жалобами на острые боли в правой подвздошной и правой поясничной области. Со слов больной в анамнезе хронический пиелонефрит свыше 10 лет.

Общий анализ крови: лейкоцитов - 14400, зозинофилов - 1%, палочкоядерных - 8%, сегментоядерных - 68%, лимфоцитов - 19%, моноцитов - 4%. Общий анализ мочи: белок - 0,3 г/л, лейкоцитов - до 30-40 в поле зрения, эритроцитов - 1-3 в поле зрения, гиалиновые цилиндры - 1-2 в поле зрения.

Бактериологическое исследование не обнаружило в моче признаков бактериурии, а анализ мочи на лактоферрицин методом ИФА выявил лактоферрицин в концентрации 8 нг/мл (таблица).

Данная концентрация лактоферрицина в моче заставляет предположить диагноз: пиелоневрит на фоне МКБ (обструктивный пиелонефрит).

Предлагаемым способом достигается упрощение и повышение точности дифференциальной диагностики МКБ от пиелонефрита, а именно:

- быстрота способа, достаточно только одного исследования, с затратой времени на исследование менее 1 часа;

- техническая простота, незначительные трудозатраты (для практического исполнения способа достаточно 1 специалиста);

- экономичность (способ не требует эксклюзивного и дорогостоящего оборудовании и реактивов, вспомогательной аппаратуры и высококвалифицированного медперсонала);

- доступность реактивов необходимых для практической реализации данного способа;

- универсальность способа (возможность определения лактоферрицина в моче любым доступным способом);

- неинвазивность способа (для анализа используется моча пациента)

Предлагаемый способ может быть использован в ургентной клинической практике урологических и приемных отделений больниц любого уровня как дополнительный тест в случаях дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни.

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни путем исследования биологической жидкости человека. В моче у пациентов с подозрением на пиелонефрит и/или мочекаменную болезнь иммунохимическим методом определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина. При концентрации лактоферрицина мочи выше 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит. При концентрации лактоферрицина мочи ниже 5 нг/мл диагностируют мочекаменную болезнь. При концентрации лактоферрицина мочи от 5 до 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит на фоне мочекаменной болезни. Способ обеспечивает возможность повышения точности и упрощения процедуры дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни за счет определения в моче человека концентрации антибактериального пептида лактоферрицина. 1 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики пиелонефрита и мочекаменной болезни путем исследования биологической жидкости человека, отличающийся тем, что в моче у пациентов с подозрением на пиелонефрит и/или мочекаменную болезнь иммунохимическим методом определяют концентрацию антибактериального пептида лактоферрицина и при концентрации лактоферрицина мочи выше 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит, при концентрации лактоферрицина мочи ниже 5 нг/мл диагностируют мочекаменную болезнь и при концентрации лактоферрицина мочи от 5 до 10 нг/мл диагностируют пиелонефрит на фоне мочекаменной болезни.