ПРОКАЛЬЦИТОНИН ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ И КОНТРОЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АНТИБИОТИКАМИ ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ С НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЖАЛОБАМИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/74 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики. В частности, настоящее изобретение касается определения прокальцитонина (РСТ) в образце, взятом из жидкости организма субъекта с неспецифическими жалобами.

Уровень техники

Пациенты, обращающиеся с неспецифическими жалобами (NSC), - хорошо известная, но плохо определяемая популяция. Их часто можно наблюдать, например, в отделениях неотложной помощи (ED). Пострадавшие часто жалуются на "плохое самочувствие", "ощущение слабости", "обессиленность", "усталость или сонливость", "головокружение", жалуются на неспособность справиться с обычными повседневными работами, отсутствие аппетита (van Bokhoven et al. 2008, J Clin Epidemiol; 61:318-22). Некоторые пациенты не могут припомнить, почему их направили в ED. Во время ухода за NSC-пациентами врачи отделений неотложной помощи сталкиваются с самыми различными диагнозами, от недостаточного домашнего ухода до острых опасных для жизни состояний (Gordon 1986. Geriatrics 41(4): 75-80). Пациенты с NSC являются наиболее проблемными для врачей отделений неотложной помощи (Chew and Birnbaumer 1999. Emerg Med Clin North Am 17(1):265-78). Кроме того, клиническая картина часто бывает размыта из-за таких факторов, как сопутствующие заболевания, одновременное назначение нескольких лекарственных средств или изменения состояния психики.

Vanapee et al. продемонстрировали, что до 20% людей пожилого возраста, поступающих в ED, не имеют специфических жалоб (Vanpee et al. 2001. Eur J Emerg Med 8(4):301-4). Кроме того, 50% людей пожилого возраста без специфических жалоб страдали от острых медицинских проблем (Rutschmann et al. 2005. Swiss Med Wkly 135(9-10):145-50).

Прокальцитонин (PCT) стал общепринятым биологическим маркером для диагностики сепсиса. РСТ отображает серьезность бактериальной инфекции и, в частности, применяются для контроля прогрессирования инфекции в сепсис, тяжелый сепсис или септический шок. Возможно применение РСТ для измерения активности связанной с инфекцией системной воспалительной реакции, для контроля успешности антибактериальной терапии и для оценки прогноза (Assicot et al. 1993. Lancet 341:515-8: Clec'h С et al. 2004. Crit Care Med 32:1166-9: Lee et al. 2004. Yonsei Med J 45:29-37: Meisner et al 2005. Curr Ovin Crit Care 11:473-480: Wunder et al. 2004. Inflamm Res 53: 158-163). Повышение уровня PCT у пациентов с сепсисом коррелируется со смертностью (Oberhoffer et al. 1999. Clin Chem Lab Med 37:363-368).

PCT уже применялся для контроля терапии с применением антибиотиков у пациентов с симптомами инфекций (например, одышка, лихорадка). У пациентов, доставляемых в отделения неотложной помощи с симптомами инфекций нижних дыхательных путей, измеряли РСТ, и только пациентов с концентрацией РСТ>0,25 нг/мл или>0,5 нг/мл лечили антибиотиками (Christ-Crain et al. 2004. Lancet 363:600-7). У пациентов с внебольничной пневмонией (CAP) лечение антибиотиками основывалось на показателях концентрации РСТ в сыворотке (настоятельно не рекомендуется при концентрации РСТ<0,1 нг/мл; не рекомендуется при концентрации РСТ<0,25 нг/мл; рекомендуется при концентрации РСТ>0.25 нг/мл и настоятельно рекомендуется при концентрации РСТ>0,5 нг/мл) (Christ-Cram et al. 2006. Am J Resp Crit Care Med 174:84- 93). РСТ-контроль значительно сократил применение антибиотиков при CAP без ущерба для результатов для пациентов. Подобным образом, РСТ-контролируемая терапия с применением таких же порогов принятия решений, как описано выше, также позволила значительно сократить применение антибиотика при первой помощи в случаях острых инфекций дыхательных путей без ущерба для результатов для пациентов (Briel et al. 2008. Arch Intern Med 168:2000-7; Burkhardt et al. 2010. Eur Resp J Express: doi: 10.1183/09031936.00163309).

Применение измерения PCT для диагностики распространенных бактериальных инфекций до нынешнего времени было ограниченным для пациентов, у которых из-за симптомов, с которыми они поступали, уже подозревалась бактериальная инфекция. На данный момент остается невыясненным, возможно ли применение РСТ также для пациентов, поступающих с неспецифическими жалобами, напрямую не указывающими на бактериальную инфекцию как возможную причину этих жалоб. У таких пациентов распространенность бактериальных инфекций неизвестна, и она может быть относительно низкой. Далеко не очевидно, что такой биологический маркер, как РСТ, позволяет распознавать в таких группах пациентов тех, которые страдают от бактериальных инфекций, со значимой чувствительностью и специфичностью, поскольку другие пациенты, не страдающие от бактериальных инфекций, многочисленны, они явно больны и могут быть очень больными. До настоящего времени РСТ-определение проводилось у пациентов с подозреваемой или имеющейся бактериальной инфекцией, поскольку вышеупомянутые пациенты обнаруживают симптомы или обращаются с жалобами, указывающими на бактериальную инфекцию. Оно никогда не практиковалось для измерения уровня РСТ с целью диагностирования распространенной бактериальной инфекции у пациента с неспецифическими жалобами.

Способ диагностики для определения этиологии воспалительного процесса путем определения концентрации РСТ и выяснения по наличию или отсутствию пептида инфекционной или неинфекционной этиологии воспаления описывается в документе ЕР 0 80 702 В1.

Неожиданно было обнаружено, что измерение уровня прокальцитонина в образце жидкости организма пациента, поступившего с неспецифическими жалобами, может применяться для контроля диагностики и лечения бактериальной инфекции у этих пациентов.

Краткое описание изобретения

Изобретение касается способа диагностирования или распознавания бактериальной инфекции у пациента, поступившего в отделение неотложной помощи с неспецифическими жалобами. Способ включает следующие этапы:

(i) обеспечение образца из организма пациента, поступившего с неспецифическими жалобами;

(ii) определение уровня прокальцитонина (РСТ) или его фрагмента длиной как минимум 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно - более 110 аминокислот в вышеупомянутом образце и

(iii) определение у вышеупомянутого пациента наличия или отсутствия бактериальной инфекции путем сравнения вышеупомянутого определенного уровня РСТ с заданным пороговым уровнем.

Изобретение также касается применения такого способа для обеспечения контроля лечения для введения антибиотика пациенту, поступившему с неспецифическими жалобами, и наблюдения за антибиотикотерапией.

Описание фигур

Фиг.1: Показатели концентрации РСТ (при поступлении) у пациентов, поступающих в ED с неспецифическими жалобами с инфекцией и без нее.

Фиг.2: Кривая ROC (кривая соотношений правильного и ложного обнаружения) для диагностики бактериальных инфекций у пациентов, поступающих в ED с неспецифическими жалобами.

Фиг.3: Распознавание пациентов с неспецифическими жалобами в ходе BANC-исследования.

Подробное описание изобретения

Изобретение касается способа диагностирования или распознавания бактериальной инфекции у пациента, поступившего с неспецифическими жалобами. Способ включает следующие этапы:

(i) обеспечение образца из организма пациента, поступившего с неспецифическими жалобами;

(ii) определение уровня прокальцитонина (РСТ) или его фрагмента длиной как минимум 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно более 110 аминокислот в вышеупомянутом образце и

(iii) определение у вышеупомянутого пациента наличия или отсутствия бактериальной инфекции путем сравнения вышеупомянутого определенного уровня РСТ с заданным пороговым уровнем.

В одном варианте осуществления изобретения бактериальная инфекция является бессимптомной (например, бактериальная инфекция, которая еще не проявила клинических симптомов, но присутствует) у пациента, поступившего с неспецифическими жалобами.

Неспецифические жалобы не ограничиваются конкретной группой, а могут быть выбраны из группы, к которой относятся жалобы на "плохое самочувствие", "ощущение слабости", "обессиленность", "усталость или сонливость", "головокружение", отсутствие аппетита, или просто жалуются на неспособность справиться с обычными повседневными работами, или пациенты могут быть неспособны припомнить, почему они были отправлены в отделение неотложной помощи.

Специфическая жалоба обычно дает ключевую информацию и позволяет получить рабочий диагноз или следовать заданному диагностическому протоколу. Специфические жалобы общепризнаны как таковые в литературе, а диагностические протоколы находят широкое применение (Siegenthaler W. Differential Diagnosis in Internal Medicine: From Symptom to Diagnosis. New York: Thieme Medical Publishers: 2007).

К специфическим жалобам относятся жалобы, при которых инфекции, в частности, бактериальные инфекции, часто рассматриваются в качестве причины жалоб. Эти специфические жалобы могут быть разными, в зависимости от бактерии или местонахождения бактериальной инфекции. Такие специфические жалобы не ограничиваются конкретной группой, а могут быть выбраны из группы, к которой относятся жалобы на головную боль, боль в конкретном участке организма (например, брюшной полости), повышенную температуру (>38°C), респираторный симптом, выбранный из группы, к которой относятся кашель, образование мокроты, одышка, учащенное дыхание и плевритическая боль в грудной клетке; один показатель во время выслушивания (например, хрипы, крепитация) и один признак инфекции (центральная температура тела >38°C, тремор) и один показатель инфекции пищеварительного тракта (тошнота, рвота, диарея).

Другие специфические жалобы изложены ниже.

Классическими симптомами бактериальной инфекции являются локализованное покраснение, жар, опухание и боль. Одним из критериев бактериальной инфекции является местная боль, боль в конкретном участке организма. Например, в случае пореза, который инфицируется бактерией, боль случается в месте инфекции. Бактериальная боль в горле часто характеризуется более выраженной болью с одной стороны горла. Ушная инфекция с большей вероятностью является бактериальной, если боль имеет место только в одном ухе.

Как было сказано выше, симптомы бактериальной инфекции отличаются по типу инфекций. Симптомы могут быть разными, в зависимости от инфицированных участков. Однако симптомы всегда ощутимы, даже при легком инфицировании участка. Когда бактериальные инфекции находятся в дыхательных путях, обнаруживаются симптомы, связанные с горлом и дыханием. Инфекция горла очень часто встречается у людей, проживающих в зонах высокого загрязнения окружающей среды. Пневмония очень часто встречается у детей и пожилых людей, у которых иммунитет очень слаб. Синусит и фарингит также встречаются у людей, страдающих от бактериальных инфекций. Окрашенные выделения из носа и головная боль обычно наблюдаются при бактериальных инфекциях в дыхательных путях.

При инфекциях в пищеварительном тракте (например, гастроэнтерите) симптомы чаще всего связаны с проблемами пищеварения. Обычно наблюдаются воспаление и боль в желудке. Диарея и рвота представляют собой другие симптомы, указывающие на инфекции в желудочно-кишечном тракте. Тошнота и обезвоживание также могут наблюдаться в результате симптомов тяжелой бактериальной инфекции.

Гнилостный или рыбный запах в области влагалища является симптомом вагинальных инфекций. Женское влагалище включает различные типы бактерий, благоприятных для органа. Однако, если бактерии этого типа вырабатываются нерегулярно, это может привести к инфекции. К симптомам бактериальной инфекции в мочевых путях относятся зуд и боль при мочеиспускании. Вагинальная инфекция и инфекции мочевых путей не следует игнорировать, поскольку они могут вызывать другие воспаления внутренних органов.

Менингит является серьезным последствием бактериальных инфекций в оболочках, покрывающих головной мозг и спинной мозг. Хотя он встречается и у взрослых, дети более восприимчивы к этой проблеме. Распространенными симптомами бактериальной инфекции при менингите являются окоченение тела и шеи, головная боль, раздражительность, высокая или пониженная температура и сыпь на коже.

Наиболее опасные бактериальные инфекции ведут к сепсису - критическому состоянию, приводящему к дисфункции органов, вызывающей смерть. Лихорадка и сильная дрожь в теле являются симптомами бактериальной инфекции при сепсисе. Пациенты с сепсисом также ощущают боль в суставах. Он требует немедленного лечения для остановки распространения инфекции на внутренние органы. В случае сепсиса пациент должен быть госпитализирован для интенсивного лечения.

Рожистое воспаление представляет собой острую бактериальную инфекцию дермы, приводящую к воспалению. У пациентов обычно развиваются симптомы, включающие сильную лихорадку, дрожание, озноб, головную боль и рвоту в течение 48 часов после первичного инфицирования. Эритематозное повреждение кожи быстро увеличивается и имеет резко ограниченный приподнятый край. Оно выглядит как красная, опухшая, теплая, затвердевшая и болезненная сыпь, подобная по консистенции апельсиновой корке. Более тяжелые инфекции могут приводить к образованию везикул, вздутий и точечных кровоизлияний с возможным некрозом кожи. Лимфатические узлы могут быть опухшими, и может возникнуть лимфедема. Иногда могут наблюдаться красные полоски, проходящие то лимфатических узлов. Инфекция может иметь место на любом участке кожи, включая лицо, руки, пальцы рук, ноги и пальцы ног, но предпочтение отдает конечностям. Жировая ткань наиболее восприимчива к инфекции, а также участки лица, как правило, вокруг глаз, ушей и щек.

Перитонит представляет собой воспаление брюшины - серозной оболочки, которая покрывает часть брюшной полости и внутренних органов. Перитонит может быть локализованным или генерализованным и может возникать в результате инфекции (часто из-за разрыва полого органа, который может случиться при травме брюшной полости или аппендиците). Основными проявлениями перитонита являются боль в брюшной полости, боль при пальпации живота и напряжение мышц стенок брюшной полости. Локализация этих проявлений зависит от того, является ли перитонит локализованным (например, при аппендиците или дивертикулите до прободения) или генерализованным для всей брюшной полости. В любом случае боль обычно начинается как генерализованная боль в брюшной полости (с участием слабо локализирующейся иннервации висцерального брюшинного слоя) и может стать локализованной впоследствии (с участием соматически иннервированного париетального брюшинного слоя). Прободение части желудочно-кишечного тракта и разрыв брюшины являются наиболее частыми причинами инфекционного перитонита.

Холангит представляет собой воспаление желчного протока. Наиболее частой причиной является бактериальная инфекция. Классическую триаду холангита составляют лихорадка, желтуха и боль в правом верхнем квадранте брюшной полости.

Холецистит представляет собой воспаление желчного пузыря и обычно проявляется как боль в правом верхнем квадранте. Она обычно сопровождается слабым проявлением лихорадки, рвотой и тошнотой.

Остеомиелит означает инфекцию костей или костного мозга. Как правило, микроорганизмы могут инфицировать кость одним или несколькими из трех основных путей: через кровоток, из смежных ограниченных участков инфекции и вследствие проникающей травмы, включая ятрогенные причины, такие, как замена суставов или внутренняя фиксация при переломах или лечение корневого канала зуба. К признакам и симптомам остеомиелита относятся лихорадка, боль в участке инфекции, опухание, теплота и покраснение по всему участку инфекции. http://en. http://wikipedia.org/wiki/Infection:

Классификация "неспецифических" жалоб предполагает субъективную оценку со стороны врача отделения неотложной помощи. Такая оценка зависит от связанных с личностью врача факторов, таких, как клинический опыт и навыки, и от определения значимости различных жалоб, которые могут влиять на дальнейшую оценку. К связанным с пациентом факторам относятся способность к словесному выражению жалоб или когнитивное состояние пациента. В целом определение NSC предназначается для уменьшения субъективности классификации пациентов и, благодаря этому, способствует проактивному ведению пациента.

Специфическая жалоба обычно дает ключевую информацию и позволяет получить рабочий диагноз или следовать заданному диагностическому протоколу. Специфические жалобы общепризнаны как таковые в литературе, а диагностические протоколы находят широкое применение (Marx J A, Hockberger R, Walls R. Rosen's Emergency Medicine: Concepts and Clinical. Sixth Edition ed. St Louis: Mosby; 2005; Siesenthaler W. Differential Diagnosis in Internal Medicine: From Symptom to Diagnosis. New York: Thieme Medical Publishers; 2007).

В отличие от специфических жалоб, NSC были определены как совокупность всех жалоб, которые не являются частью набора специфических жалоб или признаков или которые не позволяют поставить первичный рабочий диагноз. Предпочтение отдается определению NSC как жалоб, остающихся после исключения специфических жалоб, поскольку активное определение может требовать почти бесконечного перечисления возможных неспецифических жалоб. Такое длительное и сложное определение может привести к исключению некоторых пациентов с NSC, поскольку их симптомы точно не соответствуют заданному списку. Таким образом, список NSC, представленный в этой заявке, может быть неполным. Термин "рабочий диагноз" применяется в контексте представленного определения NSC для ситуаций, в которых пациенты демонстрируют NSC, но диагноз все же вероятен, с учетом фактов и полученных данных на момент поступления (например, пациент поступил со слабостью и анемичной бледностью).

На Фигуре 3 показывается процедура этого определения. В наиболее предпочтительном варианте осуществления неспецифические жалобы определяются как жалобы, ведущие к включению в соответствии с Фигурой 3. Это означает, что пациент согласно изобретению не обнаруживает одной из следующих жалоб: боли (в грудной клетке, брюшной полости, голове, ноге, суставах, спине), одышки, кашля, слабости (локализованной), характерных для инсульта симптомов, опухания конечностей (ноги, руки), диареи, дизурии, GCS<14, помрачения сознания, интоксикации, судорог, кровотечения, обморока, страха, психотических симптомов, суицидального мышления, повреждения кожи, аллергической реакции на коже, лихорадки, головокружения, учащенного сердцебиения, тошноты с рвотой, травмы. Кроме того, на вопрос, есть ли главная жалоба после первичной оценки (история, медицинский осмотр, данные ЭКГ), ведущие к стандартизированному обследованию или лечению, ответ получен отрицательный. Кроме того, у вышеупомянутого пациента ни один из основных показателей состояния организма (температура тела, пульс или частота сердечных сокращений, кровяное давление и интенсивность дыхания) не находится вне допустимых значений. К тому же, после первичной оценки рабочий диагноз не может быть поставлен, тем более, с достаточной определенностью.

В конкретном варианте осуществления изобретения из вышеупомянутой группы пациентов с NSC предпочтительно исключают пациентов, имеющих основное заболевание, причем это основное заболевание предпочтительно не является инфекцией и/или предпочтительно выбрано из группы, к которой относятся артериосклероз, сердечная недостаточность, острый коронарный синдром, коронарная болезнь сердца, инфаркт миокарда, рак, диабет, хронические желудочно-кишечные болезни, хронические болезни почек, гипертония, ортопедические болезни, включая остеопороз, и нейродегенеративные болезни, включая болезнь Альцгеймера.

Термин "уровень" в контексте настоящего изобретения означает концентрацию (предпочтительно выраженную как масса/объем;) РСТ (или фрагмента/предшественника) в образце, взятом из организма субъекта.

Термин "пациент" в контексте настоящего изобретения означает живой человеческий или отличный от человека организм, который получает или должен получать медицинскую помощь по причине болезни. Он охватывает лиц без определенного заболевания, которые исследуются на наличие признаков патологии. Таким образом, описанные авторами способы и анализы применимы к болезням как человека, так и животных.

Термин "образец" в контексте настоящего изобретения означает образец жидкости организма, полученный с целью диагностики, прогнозирования или оценки в отношении исследуемого субъекта, такого, как пациент. Предпочтительными образцами для испытания являются образцы крови, сыворотки, плазмы, спинномозговой жидкости, мочи, слюны, мокроты и плеврального выпота. Кроме того, специалистам в данной области станет понятно, что некоторые образцы для испытания лучше поддаются анализу после процедуры фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты сыворотки и плазмы.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения образец выбирают из группы, к которой относятся образец крови, образец сыворотки, образец плазмы, образец спинномозговой жидкости, образец слюны и образец мочи, или экстракт любого из вышеупомянутых образцов. Предпочтительно образец представляет собой образец крови, наиболее предпочтительно образец сыворотки или образец плазмы.

Как указывается авторами в контексте белков или пептидов, термин "фрагмент" означает малые белки или пептиды, которые являются производными от больших белков или пептидов и, таким образом, включают частичную последовательность большего белка или пептида. Вышеупомянутые фрагменты получают из больших белков или пептидов путем сапонификации одного или нескольких из их пептидных связей.

Прокальцитонин в контексте настоящего изобретения предпочтительно означает пептид, охватывающий аминокислотные остатки 1-116, 2-116 или 3-116 или их фрагменты. Таким образом, длина фрагментов прокальцитонина составляет как минимум 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно более 110 аминокислот. РСТ может включать посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, липозидирование или дериватизация. Сам РСТ является предшественником кальцитонина и катакальцина. Аминокислотная последовательность РСТ 1-116 представлена в SEQ ID NO: 1.

"Диагноз" в контексте настоящего изобретения означает распознавание и (раннее) обнаружение бактериальной инфекции у субъекта и также может включать дифференциальный диагноз.

Чувствительность и специфичность диагностического теста зависят не только от аналитического "качества" теста, а также от определения того, что составляет аномальный результат. На практике рабочие характеристические кривые (ROC-кривые) обычно рассчитывают путем построения графика зависимости переменной от ее относительной частоты в "нормальной" (т.е., практически здоровой) и "болезненной" популяциях (т.е., среди пациентов, страдающих от инфекции). В зависимости от конкретного решаемого вопроса диагностики, контрольная группа не обязательно должна состоять из "нормальных" субъектов, а может быть группой пациентов, страдающих от другой болезни или состояния, от которой отличается группа с исследуемой болезнью. Для любого конкретного маркера распределение маркерных уровней для субъектов с болезнью и без нее может частично перекрываться. В таких условиях тест не дает абсолютно различия между нормальным состоянием и болезнью со 100%-й точностью, и площадь перекрытия указывает, где тест не позволяет провести различие между нормальным состоянием и болезнью. Выбирают порог, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, каким образом изменяется маркер при конкретной болезни) тест считается аномальным, и ниже которого тест считается нормальным. Площадь под ROC-кривой является мерой вероятности того, что предпринимаемое измерение обеспечит правильное распознавание состояния. ROC-кривые могут применяться даже тогда, когда результаты теста не обязательно дают точные цифры. Возможность построения ROC-кривой существует, пока есть возможность упорядочения результатов. Например, результаты теста на "болезненных" образцах могут быть упорядочены в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Такое упорядочение может коррелировать с результатами в "нормальной" популяции и построенной ROC-кривой. Эти способы общеизвестны среди специалистов в данной области (см., например,, Hartley et al. 1982. Radiology143: 29-36). Предпочтительно порог выбирают для обеспечения площади под ROC-кривой, большей, чем приблизительно 0,5, более предпочтительно большей, чем приблизительно 0,7. Термин "приблизительно" в этом контексте означает +/- 5% от данного измерения.

Горизонтальная ось ROC-кривой представляет (1-специфичность), которая возрастает с показателем ложноположительных результатов. Вертикальная ось кривой представляет чувствительность, которая возрастает с показателем истинно положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного порогового значения может быть определено значение (1-специфичности) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под ROC-кривой является мерой вероятности того, что измеренный маркерный уровень позволит правильно распознать болезнь или состояние. Таким образом, площадь под ROC-кривой может использоваться для определения эффективности теста.

Согласно этому способу, у пациента диагностируется наличие бактериальной инфекции, когда вышеупомянутый определенный уровень РСТ превышает заданный пороговый уровень. Предпочтительно заданный пороговый уровень составляет от 0,02 до 0,5 нг/мл, более предпочтительно - от,02 нг/мл до 0,25 нг/мл, еще более предпочтительно - от 0,02 нг/мл до 0,1 нг/мл, еще более предпочтительно - от 0,02 нг/мл до 0,06 нг/мл, наиболее предпочтительно - от 0,02 нг/мл до (ниже) 0,05 нг/мл. В предпочтительном варианте осуществления у пациента диагностируется наличие бактериальной инфекции, когда вышеупомянутый определенный уровень РСТ превышает 0,1 нг/мл, предпочтительно - выше, чем 0,05 нг/мл, более предпочтительно - выше, чем 0,025 нг/мл.

Эти значения были определены в формате РСТ-теста (BRAHMS РСТ LIA sensitive), с таким же градуированием в количественном диапазоне измерений, что и при автоматизированном РСТ-анализе (BRAHMS KRYPTOR РСТ sensitive). BRAHMS РСТ LIA sensitive может количественно определять уровни РСТ в нормальной популяции, обеспечивая медианные уровни РСТ, как описывается в документе ЕР 09011073.5 ("Прокальцитонин для прогнозирования неблагоприятных явлений в бессимптомной популяции"). Вышеупомянутые значения могут быть отличными в других РСТ-анализах, если они были градуированы по-другому в сравнении с BRAHMS РСТ LIA sensitive. Вышеупомянутые значения соответственно применяются к таким по-разному градуированным РСТ-анализам, с учетом различий в градуировании. Одна из возможностей количественного определения отличия в градуировании состоит в анализе сопоставления способов (корреляции) данного РСТ-анализа с BRAHMS РСТ LIA sensitive путем измерения РСТ в образцах с применением обоих способов. Другая возможность состоит в определении при помощи данного РСТ-анализа (при условии, что этот анализ имеет достаточную аналитическую чувствительность) медианного уровня РСТ репрезентативной нормальной популяции, сравнении результатов с медианными уровнями РСТ, как описано в документе ЕР 09011073.5 ("Прокальцитонин- для прогнозирования неблагоприятных явлений в бессимптомной популяции") и пересчете градуирования на основе разницы, полученной путем такого сравнения.

Определение уровня РСТ или фрагмента или его предшественника или фрагмента в данном случае выполняют с применением способа обнаружения и/или диагностического анализа.

Как было упомянуто авторами, "анализ" или "диагностический анализ" может относиться к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может основываться на связывании обнаруживаемого аналита с одним или несколькими зондами захвата с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между молекулами захвата и молекулами-мишенями или исследуемыми молекулами, константа аффинности предпочтительно превышает 10⁸ M^-1.

В контексте настоящего изобретения "молекулы захвата" представляют собой молекулы, которые могут применяться для связывания с молекулами-мишенями или исследуемыми молекулами, т.е., аналитами (т.е., в контексте настоящего изобретения, пептидом(ами) сердечно-сосудистой системы) из образца. Молекулы захвата, таким образом, должны иметь соответствующую форму, как пространственно, так и в отношении свойств поверхности, таких, как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, присутствие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса для специфического связывания с молекулами-мишенями или исследуемыми молекулами. Таким образом, связывание может быть опосредовано, например, ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными взаимодействиями или водородной связью, или комбинацией двух или нескольких из вышеупомянутых взаимодействий между молекулами захвата и молекулами-мишенями или исследуемыми молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы захвата, например, могут быть выбраны из группы, к которой относятся молекула нуклеиновой кислоты, молекула углевод, молекула РНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно молекулами захвата являются антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к молекуле-мишени или исследуемой молекуле, а также включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные вышеупомянутых антител или фрагментов, взятых из вариантной цепи длиной как минимум 12 их аминокислот.

К оптимальным способам обнаружения относятся иммуноанализы в разных форматах, такие как, например, радиоиммунный анализ (RIA), хемилюминесцентные и флуоресцентные иммуноанализы, иммуноферментные анализы (ELISA), наборы на основе микросфер Luminex, анализы на белковых биочипах и экспресс-тесты, такие как, например, иммунохроматографические тесты на индикаторных полосках.

Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными анализами, конкурентными и неконкурентными анализами. В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ проводится в форме сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, при котором молекулу, подлежащую обнаружению и/или количественному определению, связывают с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, шариками, поверхностью лунки или другого вместилища, чипом или полоской, а второе антитело является антителом, меченным, например, красителем, радиоизотопом или реактивным или каталитически активным компонентом. Затем количество меченного антитела, связанного с аналитом, измеряют соответствующим способом. Общий состав и процедуры, применяемые при "сэндвич-анализах", являются прочно установившимися и известными специалистам в данной области (The Immunoassay Handbook Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford: 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267: Hultschig С et al., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb; 10(1);4-10. PMID: 16376134, публикация включена путем ссылки).

В особенно предпочтительном варианте осуществления анализ включает две молекулы захвата, предпочтительно антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, причем первый метящий компонент присоединяется к первой молекуле захвата, и вышеупомянутый первый метящий компонент является частью системы мечения на основе флуоресцентного или хемилюминесцентного гашения или амплификации, а второй метящий компонент вышеупомянутой системы мечения присоединяется ко второй молекуле захвата таким образом, чтобы после связывания обеих молекул захвата с аналитом возникал измеримый сигнал, позволяющий обнаруживать образовавшиеся сэндвичевые комплексы в растворе, включающем образец.

В еще более предпочтительном варианте вышеупомянутая система мечения включает редкоземельные криптаты или редкоземельные хелаты в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.

В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают применение красителей, которые могут быть, например, выбраны из группы, к которой относятся FAM (5-или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие, как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, Xanthen, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорофлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлоро-2',7'-диметокси-флуоресцеин (JOE), N,N,N',N''-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, Родамин 110, красители BODIPY, такие, как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие, как умбеллиферон, бензимиды, такие, как Hoechst 33258; фенантридины, такие, как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромид этидия, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п. В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают применение красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминесцентных материалов в публикации Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p.518-562, включенной в данное описание путем ссылки, включая ссылки на страницах 551-562. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются эфиры акридиния.

Бактериальная инфекция, которая может быть диагностирована с применением способа согласно изобретению, поддается лечению соответствующим антибиотиком, известным специалистам в данной области. Возможные классы антибиотиков выбирают из группы, к которой относятся пенициллин (например, флуклоксациллин, амоксициллин, ампициллин, мезлоциллин), цефалоспорин (например, цефазолин, цефуроксим, цефотаксим, цефаклор, цефалексин), ингибитор β-лактамазы (например, сульбактам, лазобактам), тетрациклин (например, доксициклин, миноциклин, тетрациклин, окситетрациклин), аминогликозид (например, гентамицин, неомицин, стрептомицин), макролидные антибиотики (например, азитромицин, кларитромицин, эритромицин, рокситромицин, спирамицин, клиндамицин), линкозамид (например, линкомицин), ингибитор гиразы (например, ципрофлоксацин, офлоксацин, норфлоксацин), сульфонамиды, триметоприм, гликопептидные антибиотики (например, ванкомицин), полипептидные антибиотики (например, колистин, полимиксин) и амфеникол (например, хлорамфеникол).

Кроме того, изобретение касается применения комплекта, включающего одно или несколько антител, направленных против РСТ или его фрагмента или против предшественника PCX или его фрагмента, для диагностирования бактериальной инфекции у пациентов с неспецифическими жалобами. Примеры

Любые пациенты, поступающие с результатами недавних внешних лабораторных исследований или определенными электрокардиографическими изменениями при поступлении (например, инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST) исключались из исследования. Подобным образом исключались и пациенты с известными терминальными медицинскими состояниями (например, раком в последней стадии), поступающие в ED. Пациенты исключались, если они были гемодинамически неустойчивыми или если жизненно важные параметры заметно выходили на пределы нормы (например, систолическое кровяное давление <90 мм рт.ст., частота сердечных сокращений >120/мин, температура тела >38,4 или <35,6°C, интенсивность дыхания >30/мин).

Диагностика инфекции

Всего в исследование включали 415 пациентов. У 86 из этих 415 пациентов была диагностирована бактериальная инфекция (n=19 пневмония, n=17 цистит, n=8 инфекции мочевых путей, n=7 сепсис, n=10 уросепсис, n=1 септический шок, n=3 бронхит, n=9 инфекция неизвестной локализации, n=1 перитонит, n=1 остеомиелит, n=1 сигма-диверкулит, n=1 колит, n=2 ХОЗЛ с острым приступом болезни, n=1 холангит, n=1 холецистит, n=2 рожа и n=2 гастроэнтерит).

Диагностирование инфекций в этом исследовании осуществляли в соответствии со стандартными критериями: температура >37,5°C, уровень лейкоцитов в крови >11 000/мл или <4000/мл, легочный инфильтрат при рентгенографии грудной клетки или наличие культур, положительных на патоген.

Как было указано выше, у 86 из этих 415 пациентов были диагностированы бактериальные инфекции (например, инфекции нижних дыхательных путей, инфекции мочевых путей, сепсис, септический шок). К инфекциям нижних дыхательных путей относятся острый бронхит, обострения хронического обструктивного заболевания легких (ХОЗЛ) и пневмония. Пациенты с инфекциями нижних дыхательных путей демонстрируют как минимум один респираторный симптом, выбранный из группы, к которой относятся кашель, образование мокроты, одышка, учащенное дыхание и плевритическая боль в грудной клетке; и дополнительно как минимум один показатель во время выслушивания (хрипы, крепитация) или один признак инфекции (центральная температура тела >38°C, тремор, уровень лейкоцитов >10 г/л или <4 г/л клеток). Диагноз инфекция мочевых путей основывался на двух из следующих критериев: повышенная температура (>38°C), положительный на нитриты анализ мочи, лейкоцитурия и значительная бактериурия. Сепсис, тяжелый сепсис и септический шок определяли в соответствии со стандартными критериями (Levy, et al: 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med 2003: 31; 1250-1256).

Измерение РСТ

РСТ измеряли, применяя сверхчувствительную испытательную систему промышленного производства с функциональной чувствительностью анализа 0,007 нг/мл, как описывается в публикации Morgenthaler et al. (Morgenthaler et al. 2002. Clin Chem 48:788-790). В общих чертах, антитело овцы вырабатывали против кальцитонинового компонента РСТ, и моноклональное антитело мыши вырабатывали против катакальцинового компонента РСТ. Пробирки покрывали антителом против катакальцина. Антитело против кальцитонина метили MACN Acridiniumester (In Vent GmbH, Хеннигсдорф, Германия) и использовали как метку. Разбавленные растворы рекомбинантного РСТ в нормальной лошадиной сыворотке использовали в качестве калибраторов. 100 мл образец стандарта инкубировали в накрытых пробирках в течение 30 минут, добавляли 200 мл метки. После дальнейшей инкубации в течение 2 ч пробирки 4 раза промывали 1 мл промывным раствором LIA (BRAHMS AG, Хеннигсдорф, Германия), связанную хемилюминесценцию измеряли при помощи люминометра LB952T (Berthold, Вильдбад, Германия).

Результаты

Всего в исследование было включено 415 пациентов. Уровень прокальцитонина определяли в образцах плазмы пациентов с неспецифическими жалобами сразу после поступления в отделение неотложной помощи. У 86 из этих 415 пациентов были диагностированы бактериальные инфекции. Показатели концентрации РСТ у пациентов с неспецифическими жалобами с бактериальной инфекцией и без нее показаны на Фигуре 1. Показатели концентрации РСТ были значительно выше у пациентов бактериальной инфекцией по сравнению с пациентами без бактериальной инфекции (р<0,0001). Кривая ROC-анализа показывает площадь под кривой (AUC) 0,721 (р<0,0001) (Фигура 2). Разные пороговые значения использовали для определения соответствующей чувствительности и специфичности (Таблица 1).

Таблица 1 Чувствительность и специфичность (в %) для разных пороговых значений РСТ у пациентов, поступивших в ED с неспецифическими жалобами Пороговое значение РСТ [нг/мл] Чувствительность (в %) Специфичность (в %) 0,03 89,5 36,5 0,05 77,9 58,7 0,10 54,7 73,9 0,20 38,4 83,9 0,25 33,7 88,2 0,50 16,3 93,3

Последовательность

SEQ ID NO: 1 (аминокислотная последовательность PCX):

1 APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS

51 SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT FPQTAIGVGA PGKKRDMSSD

101 LERDHRPHVS MPQNAN

Группа изобретений относится к области медицины и биохимии и касается способа диагностирования бактериальной инфекции у пациента с неспецифическими жалобами, включающего следующие этапы: (i) обеспечение образца из организма пациента, поступившего с неспецифическими жалобами; (ii) определение уровня прокальцитонина (PCT) или его фрагмента длиной как минимум 12 аминокислот в вышеупомянутом образце и (iii) определение у вышеупомянутого пациента наличия или отсутствия бактериальной инфекции путем сравнения вышеупомянутого определенного уровня PCT с заданным пороговым уровнем. Изобретение также касается применения этого способа для обеспечения контроля лечения для введения антибиотика пациенту с неспецифическими жалобами и для применения этого способа для лечения пациента с неспецифическими жалобами с использованием антибиотика. Группа изобретений позволяет уменьшить субъективность классификации пациентов и повысить эффективность диагностики. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

1. Способ диагностирования бактериальной инфекции у пациента, поступившего в отделение неотложной помощи с неспецифическими жалобами, включающий следующие этапы:
(i) обеспечение образца из организма пациента, поступившего с неспецифическими жалобами;
(ii) определение уровня прокальцитонина (РСТ) или его фрагмента длиной как минимум 12 аминокислот в вышеупомянутом образце и
(iii) определение у вышеупомянутого пациента наличия или отсутствия бактериальной инфекции путем сравнения вышеупомянутого определенного уровня РСТ с заданным пороговым уровнем,
причем заданный пороговый уровень составляет от 0,02 нг/мл до 0,25 нг/мл и пациент не предъявляет одной из следующих жалоб:
боли (в грудной клетке, брюшной полости, голове, ноге, суставах, спине), одышки, кашля, слабости (локализованной), характерных для инсульта симптомов, опухания конечностей (ноги, руки), диареи, дизурии, GCS<14, помрачения сознания, интоксикации, судорог, кровотечения, обморока, страха, психотических симптомов, суицидального мышления, повреждения кожи, аллергической реакции на коже, лихорадки, головокружения, учащенного сердцебиения, тошноты с рвотой, травмы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вышеупомянутый образец представляет собой жидкость организма, в частности кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну или плевральный выпот.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что фрагмент РСТ или фрагмент предшественника РСТ имеет длину как минимум 12 аминокислотных остатков.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что заданный пороговый уровень составляет от 0,02 нг/мл до 0,1 нг/мл, еще более предпочтительно от 0,02 нг/мл до 0,06 нг/мл, наиболее предпочтительно от 0,02 нг/мл до (ниже) 0,05 нг/мл.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что у вышеупомянутого пациента присутствует бактериальная инфекция, если вышеупомянутый определенный уровень РСТ выше, чем заданный пороговый уровень.

6. Способ по п. 1, включающий анализ с обнаружением РСТ с функциональной чувствительностью анализа ниже 0,06 нг/мл.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вышеупомянутая бактериальная инфекция выбрана из группы, к которой относятся инфекция нижних дыхательных путей, инфекция, инфекция мочевых путей, вагинальная инфекция, сепсис, тяжелый сепсис, септический шок, инфекция пищеварительного тракта, перитонит, цистит, колит, бактериальный менингит, синусит, фарингит, холангит, холецистит, остеомиелит, рожистое воспаление.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вышеупомянутая бактериальная инфекция поддается лечению антибиотиком.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вышеупомянутая бактериальная инфекция не проявляет клинических симптомов бактериальной инфекции.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что также включает этап (iv) введения или прекращения введения антибиотика пациенту.

11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что также включает этап определения уровня как минимум одного маркера, такого как С-реактивный белок (CRP).

12. Применение способа по пп. 1-11 для обеспечения контроля лечения для введения антибиотика пациенту, поступившему в отделение неотложной помощи с неспецифическими жалобами.

13. Применение способа по пп. 1-11 для лечения пациента, поступившего в отделение неотложной помощи с неспецифическими жалобами, с применением антибиотика.