ПЛАНКТОННЫЙ ШТАММ ВОДОРОСЛЕЙ Parachlorella nurekis И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ УНИЧТОЖЕНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/12 A01H13/00 A01N63/00 

Область изобретения

Данное изобретение относится к штамму одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG, который предназначен для продуцирования биомассы и уничтожения цианобактерий (сине-зеленых водорослей).

Предшествующий уровень техники

Существует хорошо известный штамм одноклеточных зеленых водорослей Chlorella vulgaris IFR С-111, характеризующийся высокой продуктивностью, который удовлетворяет требованиям промышленного культивирования (патент RU 1751981).

Недостаток штамма Chlorella vulgaris IFR C-111 заключается в сезонности его развития (в течение периода с мая по декабрь), требовательности к составу питательной среды, перманентном цикле развития клеток и узком диапазоне температур культивирования (26-36°С).

Существует известный штамм одноклеточных зеленых водорослей Chlorella vulgaris BIN с широким диапазоном температур, приемлемых для культивирования (20-40°С), который является требовательным к субстрату, обладает способностью очищать сточные воды (патент RU 2192459) и используется для биологического восстановления водохранилищ (Bogdanov, 2008).

Недостаток штамма Chlorella vulgaris BIN заключается в отсутствии сезонного размножения в естественных резервуарах, затрудняющем его использование в различных климатических зонах. Плохое сохранение жизнеспособности в водохранилищах в температурном диапазоне от 0 до 16°С требует повторной обработки резервуара водорослями. Недостаточная способность к адаптации к естественным условиям резервуара требует дополнительной адаптации данного штамма. Другой недостаток штамма Chlorella vulgaris BIN заключается в узком диапазоне адаптации - только к определенным видам сточных вод.

Цель данного изобретения состоит в создании нового штамма одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis 1904 KIEG, который будет отличаться более высокой продуктивностью, сезонным размножением в естественных бассейнах и жизнеспособностью в температурных интервалах от 0 до 16°С и будет обладать способностью адаптироваться к естественным условиям в различных климатических зонах и уничтожать цианобактерии, бактерии и грибы.

Описание изобретения

Одноклеточные зеленые водоросли способны исключить вышеупомянутые недостатки предыдущих штаммов. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG культивировали на основе Chlorella vulgaris BIN из коллекции Пензенского научно-исследовательского сельскохозяйственного института, Российская Академия сельскохозяйственных наук. Этот штамм культивировали в воде естественного резервуара в различных климатических зонах. В конечном итоге был выбран промежуточный штамм, который более приспособлен и менее требователен по отношению к культивированию. Его применение показало высокую гибкость в отношении водохранилищ различных климатических зон, также способность уничтожать цианобактерии, другие бактерии и грибы.

Среда: Для культивирования штамма Parachlorella nurekis 1904 KIEG авторы изобретения берут на 1 л водопроводной воды питательную среду, содержащую следующие четыре компонента.

Питательная среда

Компонент 1: азотно-фосфорный раствор - 0.3 мл

Компонент 2: натриево-железистый раствор - 0.15 мл.

Компонент 3: медно-кобальтовый раствор - 0.2 мл

Компонент 4: раствор диоксида углерода - 10 мл

Морфологические характеристики: Новые клетки имеют слегка эллипсоидную форму и размер 2-3 мкм. Взрослые вегетативные клетки имеют 7-8 мкм в диаметре. Клетки с диаметром 8-10 мкм с уже сформировавшимися автономными спорами все еще находятся в материнской оболочке. Новые клетки имеют тонкие стенки, которые постепенно становятся толще. Когда автономные споры высвобождаются, (стенка) расщепляется на 2-3 части, которые остаются связанными. (Широкополосный (wideband) и открытый хлоропласт охватывает ¾ поверхности клетки и примыкает плотно к клеточной стенке.) Пиреноид окружен крахмальной обкладкой, состоящей из двух или трех полусфер. Размножение обеспечивается автономными спорами. Споры имеют одинаковый размер. Количество спор равно четырем, редко двум или более чем четыре. Количество спор строго четное. Деление клеток, возникновение и высвобождение автономных спор продолжается в течение целых суток без строгого выстраивания к определенному часу. Как новая, так и взрослая клетки являются темно-зелеными.

Культуральные характеристики: Клетки не аккумулируются, а распространяются равномерно в суспензионном объеме. (Сосудистые) стенки не перерастают. Водоросль культивируют и хранят в жидкой питательной среде. Она хорошо растет с использованием нитрата аммония. Водорослям необходим для питания раствор диоксида углерода, полученный из целлюлозы.

В течение культивирования клетки практически не осаждаются. В состоянии покоя клетки начинают осаждение через 5-10 дней. Процесс осаждения заканчивается через месяц.

Культивирование штамма не требует автоматического перемешивания.

Условия культивирования не (включают) сезонное размножение. (В естественных условиях сезонность иначе очень сильно выражена.) В условиях культивирования штамм требует определенной питательной среды и поддержания биотехнологического хода культивирования. На открытом воздухе водоросль адаптируется к условиям бассейна, в который она была помещена.

Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG уничтожает бактерии, грибы, вызывает разрушение клеток и колонии цианобактерий вплоть до их полного уничтожения.

Цикл развития штамма нестабилен; клетки развиваются несинхронным образом.

Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG возможно культивировать в 19% соленой воде.

Культивирование водорослей не требует стерильности. Штамм обладает способностью создавать условия монокультуры.

Физиологические характеристики: Штамм аутотрофный; ему необходим для питания азот, главным образом нитрат аммония. Он растет при солнечном свете, также в условиях искусственного освещения в открытых резервуарах с лампами Osram Plantastar 250 Вт. Свет проникает через слой 20 см. Штамм имеет хорошие свойства планктона, т.е. способность подниматься и равномерно распределяться в среде культивирования.

Живые клетки водорослей несут отрицательные заряды. Потеря зарядов влечет за собой коагуляцию клеток и их слипание. Способность прилипания к водородным пузырькам используется для выделения биомассы из культивационной среды путем электрической флотации.

Оптимальная температура для культивирования составляет 28-30°С. В естественных условиях водоросль растет при температуре 16-32°С, в то же время она имеет длительную жизнеспособность во всех бассейнах при температурах от 0 до 16°С.

Режим освещения соответствует продолжительности прямого иллюминационного искусственного света, обеспеченного лампами Osram Plantastar 250 Вт, освещение длится 10-12 часов. Достаточное минимальное освещение длится 8-10, максимальное освещение 12-14 часов. Развитие штамма не зависит от сезона или источника света.

Штамм ведет себя антагонистично по отношению к другим водным водорослям, бактериям, грибам или дрожжам в среде культивирования. Никакие другие водоросли не могут развиться в присутствии этого штамма. Бактерии умирают и оседают.

Жизнеспособность клеток составляет минимум 30 лет, если для культуры соблюдаются условия хранения на рассеянном свете и при комнатной температуре.

В естественных бассейнах штамм уничтожает три вида циановых бактерий (цианобактерий): Aphanizomenon, Anabaena и Microcystis. В лабораторных условиях Parachlorella nurekis 1904 KIEG вызывает разрушение клеток и колоний цианобактерий вплоть до их полного уничтожения.

Данный штамм характеризуется высокой продуктивностью (см. таблицу) и способностью противодействовать цветению воды, вызванному цианобактериями и другими бактериями и грибами.

Краткое описание графических материалов

Данное изобретение может быть лучше объяснено с помощью Фигур: на Фиг.1 показан штамм Chlorella vulgaris при увеличении 1000 х; на Фиг.2 показано подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG в начале эксперимента: 1 - опытные, 2 - контрольные чашки (Фиг.2-6); на Фиг.3 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG через три часа; на Фиг.4 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) штаммом Parachlorella nurekis 1904 KIEG через девять часов; и на Фиг.6 представлено подавление Cyanobacteria (Aphanizomenon flos-aquae) через двенадцать часов.

Примеры осуществления данного изобретения

Пример 1. Отбирают пробы цветущего бассейна с цианобактериями Aphanizomenon flos-aquae. 100 мл пробы нужно отфильтровать и взвесить, биомассу нужно экстрагировать (300 мг) и поместить в чашку Петри, куда затем добавляют 100 мл суспензии Parachlorella (биомасса 60 мг/100 мл). 100 мл пробы с цианобактериями помещают во вторую чашку Петри. Первая чашка Петри является опытной, вторая является контрольной. Обе чашки следует хранить при рассеянном свете и при комнатной температуре.

В начале эксперимента колонии цианобактерий хорошо видны в обеих чашках. Через три часа цианобактерий в опытной чашке темнеют больше, чем в контрольной чашке. Процесс разрушения колонии начинается в опытной чашке через 6 часов. В контрольной чашке нет наблюдаемых изменений. Через 9 часов цианобактерии в опытной чашке полностью теряют свою структуру. Они выглядят как полностью бесформенный объект, темнее, чем цианобактерии в контрольной чашке. В контрольной чашке нет наблюдаемых изменений. Через 12 часов опытная чашка не содержит видимых следов циановых бактерий. Контрольная чашка не показывает изменений.

Таким образом, через 12 часов суспензия Parachlorella полностью уничтожила колонию цианобактерий с биомассой, в 5 раз превышающей биомассу Parachlorella.

Пример 2. Наливают 100 мл пробы воды из цветущего бассейна - цианобактерии Aphanizomenon flos-aquae - в две конические колбы. Биомасса цианобактерий составляет 200 мг/100 мл воды. Затем добавляют 15 мл суспензии Parachlorella nurekis 1904 KIEG в первую колбу. Биомасса Parachlorella составляет 60 мг/100 мл. Первая колба опытная, вторая контрольная. Обе колбы следует хранить при рассеянном свете и при комнатной температуре (22°С).

В начале эксперимента колонии цианобактерий можно четко наблюдать в обеих колбах. Через 6 часов можно видеть, что цианобактерии в опытной колбе темнеют больше, чем в контрольной колбе. Цианобактерии в опытной колбе полностью теряют свою структуру через 12 часов. Они выглядят бесформенными хлопьями и темнее, чем цианобактерии в контрольной колбе. В контрольной колбе нет наблюдаемых изменений. Опытная колба не содержит видимых следов циановых бактерий через 20 часов.

За 20 часов суспензия Parachlorella, помещенная в естественную среду обитания цианобактерий, полностью уничтожила колонию цианобактерий с биомассой, в 20 раз превышающей биомассу самой Parachlorella.

Цианобактерии были уничтожены в среде Parachlorella после того, как авторы изобретения обработали среду цианобактерий суспензией Parachlorella. В тоже время биомасса цианобактерий была в несколько раз больше, чем биомасса Parachlorella.

Поэтому созданный штамм водоросли Parachlorella nurekis 1904 KIEG более эффективен по сравнению с другими известными штаммами и способен полностью уничтожать цианобактерии, вызывающие цветение воды. Например, в результате использования этого штамма на Цимлянском водохранилище (Россия) авторам изобретения удалось полностью уничтожить цианобактерии за три года (2006-2009).

Таблица Сравнительные показатели эффективности штаммов Chlorella vulgaris Показатель Штаммы Chlorella vulgaris IFRC-111 (RU 1751981) BIN (RU 2192459) Parachlorella nurekisi 904 KIEG (-) Продуктивность, сухая биомасса г/м² в день 30 60-65 70 Оптимальная температура культивирования, °С 26-36 20-40 29-30 Период культивирования, месяцы 12 12 12

Промышленная применимость

Parachlorella nurekis 1904 KIEG представляет собой штамм, чрезвычайно легко адаптирующийся и нетребовательный по отношению к условиям культивирования. Его применение доказало высокую адаптивность по отношению к бассейнам различных климатических зон и способность уничтожать цианобактерии, бактерии и грибы.

Группа изобретений, включающая штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis и его применение для уничтожения цианобактерий, относится к биотехнологии. Штамм Parachlorella nurekis 1904 KIEG депонирован в Коллекции Культур Водорослей и Протозоа (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP), Морской институт Шотландии, Данбег, ОБАН, Аргайл, РАЗУ 1QA, Шотландия, Соединенное Королевство (Scottish Marine Institute, Dunbeg, OBAN, Argyll, PA37 1QA, Scotland, UK) под регистрационным номером CCAP №259/1 и может быть применен для уничтожения цианобактерий. Изобретения позволяют сократить количество цианобактерий в водоемах. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Промышленный штамм одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis, депонированный в Коллекции Культур Водорослей и Протозоа (Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP), Морской институт Шотландии, Данбег, ОБАН, Аргайл, РА37 1QA, Шотландия, Соединенное Королевство (Scottish Marine Institute, Dunbeg, OBAN, Argyll, PA37 1QA, Scotland, UK) под регистрационным номером CCAP №259/1, обладающий способностью уничтожать цианобактерии.

2. Применение штамма одноклеточных зеленых водорослей Parachlorella nurekis CCAP №259/1 для уничтожения цианобактерий.